尹 吳 孫偉博 周 燕 諸葛強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210037)

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毛果楊Rubisco活化酶基因的克隆與功能分析*

尹 吳 孫偉博 周 燕 諸葛強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210037)

【目的】 核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是參與植物光合作用的第1步碳同化的關(guān)鍵酶，而Rubisco活化酶(RCA)能夠使Rubisco處于穩(wěn)定的催化活性狀態(tài)，從而提高光合效率。本研究從毛果楊中克隆RCA基因并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化南林895楊，獲得PtRCA高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，并進(jìn)行分子檢測(cè)及相關(guān)功能分析，為培育楊樹(shù)新型高光效抗逆品種提供依據(jù)?！痉椒ā?基于毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息克隆PtRCA基因序列，利用生物信息學(xué)對(duì)PtRCA基因進(jìn)行功能和結(jié)構(gòu)分析。采用Gateway技術(shù)將PtRCA構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB406中，以南林895楊為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。以轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊和對(duì)照(南林895楊)為材料，測(cè)定分析在高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的差異。【結(jié)果】 從毛果楊中克隆獲得PtRCA的CDS序列長(zhǎng)1 323 bp，編碼440個(gè)氨基酸殘基，其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為48 315.9 Da，等電點(diǎn)pI為5.57，為疏水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)； 通過(guò)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PtRCA屬AAA+超級(jí)家族一員，且與大豆、擬南芥RCA蛋白同源性較高。轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊RCA表達(dá)量均高于對(duì)照，且能夠利用強(qiáng)光充分進(jìn)行光合作用，其光飽和點(diǎn)也均高于對(duì)照，增加約12.5%～37.5%； 光補(bǔ)償點(diǎn)除3號(hào)株系外，其他轉(zhuǎn)基因株系均略低于對(duì)照； 轉(zhuǎn)基因植株在光飽和點(diǎn)的光合速率比對(duì)照增高24.6%～55.7%。轉(zhuǎn)基因株系對(duì)CO2的利用能力和羧化效率均強(qiáng)于對(duì)照組，CO2飽和點(diǎn)除1號(hào)和4號(hào)株系外，其他株系均比對(duì)照低12.5%～25.0%； CO2補(bǔ)償點(diǎn)比對(duì)照降低53.1%～80.4%； 光呼吸比對(duì)照低37.7%～79.3%，并且轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)在CO2飽和點(diǎn)的光合速率比對(duì)照增高4.4%～26.4%。另外，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)表現(xiàn)出耐光氧化的能力，光氧化處理后，對(duì)照PSⅡ原初光化學(xué)效率下降61.7%，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)下降45.0%～53.1%； 對(duì)照PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率下降54.1%，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)下降38.7%～52.0%； 光化學(xué)猝滅系數(shù)對(duì)照下降68.3%，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)下降51.0%～65.8%； 非光化學(xué)猝滅系數(shù)對(duì)照僅增加3.0%，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)增加6.0%～26.5%?！窘Y(jié)論】 楊樹(shù)Rubisco活化酶(PtRCA)蛋白與大豆、擬南芥RCA蛋白同源性較高。通過(guò)實(shí)時(shí)定量及相關(guān)生理分析表明，轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊具耐高溫特性，利用CO2和強(qiáng)光進(jìn)行光合作用的能力較強(qiáng)，催化RuBP進(jìn)行羧化反應(yīng)的效率較高。轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)能夠充分利用吸收的光子，PSⅡ反應(yīng)中心效率較高，過(guò)剩光能量得到較好的耗散，表現(xiàn)出耐光氧化的能力。研究結(jié)果表明，PtRCA基因的高效表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的光合效率，并對(duì)高溫高光強(qiáng)具有調(diào)節(jié)能力。

楊樹(shù)； Rubisco活化酶基因； 轉(zhuǎn)基因； 光合作用

光合作用是植物學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域，也是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)之一。Calvin循環(huán)是高等植物進(jìn)行光合作用碳固定的最基本途徑，其反應(yīng)共有13步，由RuBP(核酮糖-1，5-二磷酸)開(kāi)始到RuBP再生結(jié)束，所有反應(yīng)均在葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行(Rainesetal., 2006; Smithetal., 2007)。Calvin循環(huán)的第1步反應(yīng)由核酮糖-1，5二磷酸羧化酶(EC 4.1.1.39, 簡(jiǎn)稱Rubisco)催化。Rubisco是光合碳固定的關(guān)鍵酶，其催化RuBP羧化反應(yīng)和加氧反應(yīng)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)2種反應(yīng)的關(guān)系(Jurczyketal., 2015)。在植物體內(nèi)環(huán)境中，Rubisco的活性受Rubisco活化酶(Rubisco activase, RCA)的調(diào)節(jié)與控制，即Rubisco必須經(jīng)過(guò)RCA的活化，才能表現(xiàn)出其羧化與加氧活性(Parryetal., 2012)。因此，RCA的發(fā)現(xiàn)為提高植物Rubisco活力，從而提高碳固定的效率提供了新的思路。因此，RCA的生理與分子生物學(xué)研究已經(jīng)成為光合作用領(lǐng)域的熱門課題(李海霞等， 2010)。

隨著基因工程的發(fā)展，克隆、表達(dá)、轉(zhuǎn)化RCA基因等相關(guān)研究工作已經(jīng)逐步展開(kāi)?？茖W(xué)家們成功克隆擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、棉花(Gossypiumspp.)等植物RCA基因的cDNA(Wernekeetal., 1989; Rundleetal., 1991; Toetal., 1999; Salvuccietal., 2003)。研究發(fā)現(xiàn)，RCA基因?qū)Χ唐诟邷孛{迫反應(yīng)較為敏感，但其表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這種機(jī)制對(duì)于提高植物光合作用，從而應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期高溫脅迫具有重要意義(DeRidderetal., 2007)。光照強(qiáng)度對(duì)RCA活性影響的相關(guān)研究表明： RCA活性會(huì)隨著光量子通量密度的增加而隨之增加，而光強(qiáng)達(dá)到300 μmol·m-2s-1時(shí)迅速趨于飽和狀態(tài)； 然而Rubisco活性要在1 000 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度時(shí)才趨于飽和(姜振升等， 2010)。對(duì)水稻進(jìn)行高溫脅迫的試驗(yàn)表明，RCA對(duì)植物抗高溫有調(diào)節(jié)作用，主要由于面臨高溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的RCA能夠與熱激蛋白等分子伴侶蛋白互作，從而保證高溫處理下RCA的活性(Yamorietal., 2012)。轉(zhuǎn)RCA基因植株在熱脅迫時(shí)仍具有較高的光合速率(Bayramovetal., 2014)。另有報(bào)道，RCA也是一種能夠與赤霉素相結(jié)合的磷蛋白，對(duì)GA信號(hào)的傳遞有積極作用(Stotzetal., 2011)。RCA與植物光合作用速率(Tsaietal., 2015)和植物產(chǎn)量(Yinetal., 2014)具有密切關(guān)系。這些研究為使用基因工程技術(shù)改良作物及經(jīng)濟(jì)林木，提高其光合速率和抗逆性提供了新的思路。

楊樹(shù)(Populus)是一種適應(yīng)能力強(qiáng)、品種繁多、生長(zhǎng)速度快的優(yōu)良樹(shù)種，可作為人造板、造紙?jiān)系龋蚬こ碳夹g(shù)對(duì)提高楊樹(shù)抗逆性提供了新途徑。本研究選擇楊樹(shù)為研究材料，利用楊樹(shù)基因組序列信息，克隆毛果楊(Populustrichocarpa)PtRCA基因，通過(guò)農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化南林895楊(P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’)，獲得PtRCA高效表達(dá)植株，并進(jìn)行分子檢測(cè)及相關(guān)功能分析，為培育楊樹(shù)新型高光效抗逆品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

毛果楊及南林895楊無(wú)菌組培苗均于溫度22 ℃、光強(qiáng)4 000 lx、日光照16 h的溫室內(nèi)培養(yǎng)，分別用于目的基因克隆以及相關(guān)功能分析。

1.2 毛果楊PtRCA基因的克隆及分析

采用BIOMIGA公司的EZgeneTM Plant Easy Spin RNA Miniprep Kit (R6611)試劑盒提取毛果楊總RNA； 使用TAKARA公司提供的試劑反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)已有的PtRCA基因序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)5′端及3′端特異引物(表1)，擴(kuò)增PtRCA基因的編碼區(qū)，并進(jìn)行D-TOPO PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，連接到PMD 19載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP 10，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性克隆，挑選單克隆，交金斯瑞公司測(cè)序，并進(jìn)行相關(guān)序列比對(duì)，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)PtRCA基因進(jìn)行基因功能及其結(jié)構(gòu)分析(表2)。

表1 克隆擴(kuò)增引物及RT-PCR表達(dá)分析引物Tab. 1 Primers used in full length cloning and RT-PCR analysis

表2 基因序列分析軟件以及相關(guān)網(wǎng)址Tab. 2 Gene sequence analysis softwares and related web sites

1.3 溫度脅迫下RCA基因表達(dá)模式分析

用于溫度脅迫試驗(yàn)的植物材料為南林895楊溫室生長(zhǎng)苗(22 ℃)，6周正常生長(zhǎng)后進(jìn)行脅迫處理。第1種處理： 脅迫溫度梯度設(shè)置為10， 20，30 ℃，分別在脅迫1，3，5，7，9天后取葉片，進(jìn)行相關(guān)定量分析； 第2種處理： 37 ℃高溫條件下，分別在0，2，4，8，12 h時(shí)取葉片； 再將溫度調(diào)回室溫22 ℃，分別在2，4，8，12 h時(shí)取葉片，對(duì)所有葉片樣本進(jìn)行相關(guān)定量分析。每次試驗(yàn)相互獨(dú)立，分別重復(fù)3次。

1.4 楊樹(shù)PtRCA基因表達(dá)載體構(gòu)建

PMD 19 T質(zhì)粒； 用于入門載體擴(kuò)增的TOP 10大腸桿菌菌株； 用于表達(dá)載體擴(kuò)增的DB 3.1大腸桿菌菌株； 表達(dá)載體pGWB 406(日本RIKEN理化研究所贈(zèng)予)。

按照Gateway反應(yīng)程序，設(shè)計(jì)BP反應(yīng)引物，F(xiàn)端： GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAAGGCTCC ATGGCAGCCACCATCTCCAC； R端： GGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAACCATAGAAAGTT CCTC。PCR 產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行BP 反應(yīng)和LR 反應(yīng)。將LR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并測(cè)序，提取質(zhì)粒，得到目的基因植物表達(dá)載體，-20 ℃保存。

1.5 楊樹(shù)PtRCA基因的遺傳轉(zhuǎn)化與分子檢測(cè)

將含有sGFP基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA 105，通過(guò)葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。侵染濃度OD600值設(shè)置為0.6，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間3天，重懸時(shí)間60 min。

將預(yù)培養(yǎng)后的南林895楊外植體浸入重懸液中輕晃振蕩15 min，用無(wú)菌濾紙吸去葉片上多余的菌液，平鋪于分化培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.002 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 6.5 g·L-1)上，待分化篩選培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基 + Kan 40 mg·L-1+ 頭孢 200 mg·L-1+ 特美汀 200 mg·L-1)上長(zhǎng)出狀態(tài)較好的抗性芽后，轉(zhuǎn)至芽伸長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基(芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基 + Kan 20 mg·L-1+ 頭孢 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，最后轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基 + Kan 10 mg·L-1+ 頭孢 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)上，于22 ℃培養(yǎng)溫度、4 000 lx光強(qiáng)、每天16 h光照的條件下溫室培養(yǎng)，最后獲得完整抗性植株。

利用PCR對(duì)初步篩選出來(lái)的抗性植株進(jìn)行再次篩選，以陽(yáng)性質(zhì)粒為正對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因南林895楊為負(fù)對(duì)照進(jìn)行分子檢測(cè)。

1.6 光合速率相關(guān)參數(shù)的測(cè)定

在2016年6月采用GFS-3000(便攜式氣體交換熒光測(cè)定儀)測(cè)定轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊和對(duì)照的光合速率相關(guān)參數(shù)。選擇與對(duì)照(3株)相同時(shí)間移栽、長(zhǎng)勢(shì)良好且無(wú)病蟲害的盆栽轉(zhuǎn)基因植株30株(每個(gè)株系3株)作為樣本，測(cè)定時(shí)采用樹(shù)冠中部外圍著生于枝條頂端的3～5對(duì)生長(zhǎng)健壯的葉片。每個(gè)株系共測(cè)3片，每個(gè)處理重復(fù)5次。單次測(cè)定在15 min內(nèi)完成。

1.6.1 光合速率(Pn)日變化 晴朗無(wú)云條件下，在7： 00—19： 00之間，每隔1 h測(cè)定1次光合速率值，選用植株頂端的3對(duì)葉片，每株測(cè)定3片，重復(fù)記錄5次。

1.6.2 光合作用對(duì)光響應(yīng) 晴朗無(wú)云條件下，光合有效輻射在0～1 400 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)設(shè)定若干梯度，測(cè)定光合速率值。測(cè)定時(shí)，葉室溫度30 ℃，葉室CO2濃度350 μmol·mol-1(與大氣中CO2濃度相同)，相對(duì)濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過(guò)回歸分析獲得。

1.6.3 光合作用對(duì)CO2響應(yīng) 晴朗無(wú)云條件下，CO2濃度在0～1 000 μmol·mol-1范圍內(nèi)設(shè)定若干梯度，測(cè)定光合速率值。測(cè)定時(shí)，葉室溫度30 ℃，光合有效輻射1 200 μmol·m-2s-1，相對(duì)濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過(guò)回歸分析獲得。

1.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

在2016年8月采用GFS-3000(便攜式氣體交換熒光測(cè)定儀)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，選擇與對(duì)照(長(zhǎng)勢(shì)最好的1株)相同時(shí)間移栽、長(zhǎng)勢(shì)良好且無(wú)病蟲害的轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊10株(每個(gè)株系中長(zhǎng)勢(shì)最好的1株)作為樣本，測(cè)定時(shí)采用樹(shù)冠中部外圍著生于枝條頂端的第3對(duì)生長(zhǎng)健壯的葉片，每個(gè)數(shù)值均重復(fù)測(cè)5次。

在光照強(qiáng)度300 μmol·m-2s-1條件下， 葉片暗適應(yīng)20 min后再將光照強(qiáng)度增至1 800 μmol·m-2s-1，在2種光強(qiáng)條件下測(cè)定PSⅡ原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)、光化學(xué)猝滅(qP)、非光化學(xué)猝滅(qN)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的Duncan法進(jìn)行處理間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)PtRCA基因序列分析

根據(jù)已有的PtRCA基因序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)5′端及3′端特異引物，進(jìn)行D-TOPO PCR轉(zhuǎn)化，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑選白色陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)菌落PCR，所有菌樣結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶； 將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中BLAST，與克隆的毛果楊PtRCA蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)克隆片段與楊樹(shù)預(yù)測(cè)片段相一致，具完整閱讀框。將PtRCA基因序列在GenBank中登錄，獲得登錄號(hào)為KY307834。

通過(guò)3次獨(dú)立的測(cè)序，PtRCA基因編碼序列(CDS)長(zhǎng)1 323 bp，編碼區(qū)包含440個(gè)氨基酸，利用ProtScale對(duì)PtRCA基因編碼區(qū)CDS結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)RCA蛋白N-末端存在1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)合位點(diǎn)，含有AAA+家族蛋白保守區(qū)P-loop NTPase 超家族結(jié)構(gòu)域，以及2個(gè)ATP結(jié)合域、1個(gè)ATPase響應(yīng)結(jié)合域(圖1)。

圖1 PtRCA基因編碼區(qū)推測(cè)的核苷酸序列以及氨基酸序列Fig.1 Nucleic acid sequence and amino acid sequence of PtRCA粗實(shí)線區(qū)表示N-末端； 箭頭表示轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)合位點(diǎn)； 陰影區(qū)表示AAA+家族蛋白保守區(qū)； 雙實(shí)線且加框表示ATP結(jié)合域； 加框表示ATPase sensor 2 motif； 左邊數(shù)字表示核苷酸數(shù)字。Heavy line area refers to N-terminal; The arrow refers to transit peptide binding sites; The shadow area refers to the conservative district of AAA+; Double solid line and framed area refers to ATP domain; Framed area refers to ATPase sensor 2 motif; The number refers to the number of nucleotides.

利用ExPASy ProtParam在線分析PtRCA的理化特性： PtRCA蛋白分子式為C2135H3367N579O656S21，相對(duì)分子質(zhì)量為48 315.9 Da。共包括440個(gè)氨基酸，主要氨基酸為Asp,Glu,Arg,Lys，正電荷殘基數(shù)為49，負(fù)電荷殘基數(shù)為53，等電點(diǎn)pI為5.57。 不穩(wěn)定指數(shù)為33.4，屬于穩(wěn)定性蛋白。脂肪系數(shù)為77.55，平均親水系數(shù)為-0.311，為疏水性蛋白。

2.2 楊樹(shù)PtRCA基因蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MAGA 5.0軟件結(jié)合NCBI同源蛋白序列搜索結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)以分析楊樹(shù)PtRCA基因與其他物種RCA基因親緣關(guān)系，選取的物種分別為擬南芥、大豆(Glycinemax)、葡萄(Vitisvinifera)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、小籽海紅豆(Adenantheramicrosperma)、桃(Amygdaluspersica)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)、南芥(Arabis)、水田碎米薺(Cardaminelyrata)，楊樹(shù)PtRCA蛋白與擬南芥、麻瘋樹(shù)、大豆等具較高同源性，應(yīng)具備與其相似功能，這為楊樹(shù)PtRCA蛋白功能分析奠定了良好基礎(chǔ)。同時(shí)，將楊樹(shù)PtRCA基因編碼的蛋白與楊樹(shù)中其他蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對(duì)，并分析與PtRCA基因編碼的蛋白同源性較高的蛋白，發(fā)現(xiàn)其均屬于AAA+超級(jí)蛋白家族。這些都對(duì)PtRCA基因表達(dá)模式分析提供了參考依據(jù)。

2.3 楊樹(shù)RCA基因溫度梯度脅迫誘導(dǎo)表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)南林895楊(非轉(zhuǎn)基因)的RCA基因溫度梯度脅迫誘導(dǎo)表達(dá)情況，結(jié)果(圖2)顯示： 10 ℃低溫處理1天后，RCA基因表達(dá)量下降； 處理3天表達(dá)量極顯著提高，隨后顯著下降； 處理9天，表達(dá)量也顯著提高。20 ℃處理，RCA基因表達(dá)量基本呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)。30 ℃高溫處理1天后，表達(dá)量顯著升高，3天后顯著下降，5天后表達(dá)量逐步上升。具較高耐熱性的RCA轉(zhuǎn)基因植株，受到中度熱脅迫時(shí)，仍具有較高的光合速率以及生產(chǎn)量，故提高植物RCA熱穩(wěn)定性可作為改善植物抵御高溫脅迫的一種可行性方案(Kureketal., 2007)。

圖2 溫度脅迫下RCA基因表達(dá)模式分析Fig.2 Real-time PCR results of RCA expression under diverse temperature stresses

實(shí)時(shí)定量分析(圖3)顯示高溫(37 ℃)處理2 h后，RCA基因表達(dá)量顯著上調(diào)，隨后逐步降低，在高溫處理12 h后，表達(dá)量達(dá)到最低，甚至于不表達(dá)。而在經(jīng)過(guò)22 ℃室溫恢復(fù)處理后，RCA基因表達(dá)量開(kāi)始呈線性上升趨勢(shì)，且在恢復(fù)處理12 h時(shí)，RCA表達(dá)量超過(guò)了未經(jīng)高溫處理的初始表達(dá)量。這說(shuō)明適度高溫處理可誘導(dǎo)RCA表達(dá)(Wangetal., 2010)，這為推測(cè)RCA具耐高溫能力提供了依據(jù)。

圖3 37 ℃高溫誘導(dǎo)RCA基因表達(dá)模式分析Fig.3 Real-time PCR results of the expression of RCA induced by 37 ℃*，P < 0.05; **，P<0.01.

2.4 載體的構(gòu)建

目的基因先經(jīng)過(guò)BP反應(yīng)整合到入門載體，再經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)，整合到表達(dá)載體pGWB 406上，通過(guò)PCR凝膠電泳，結(jié)果顯示目的基因成功構(gòu)入表達(dá)載體。

2.5 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊的獲得

待分化篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出狀態(tài)較好的抗性芽后，需及時(shí)轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基上，于22 ℃培養(yǎng)溫度、4 000 lx光強(qiáng)、每天16 h光照的條件下溫室培養(yǎng)。每隔10～15天，更換1次培養(yǎng)基，并實(shí)時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀況。

待抗性芽生長(zhǎng)至3 cm高時(shí)，需及時(shí)轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于22 ℃培養(yǎng)溫度、4 000 lx光強(qiáng)、每天16 h光照的條件下溫室培養(yǎng)，最后獲得轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊的獲得Fig.4 Obtaining of PtRCA transgenic ‘Nanlin895’ poplarA： 葉盤分化； B: 抗性芽伸長(zhǎng)； C： 抗性芽的壯大； D： 抗性植株。A: Leaf differentiation; B: Resistant shoot elongation; C. Resistant shoot growing; D. Transgenic plant.

利用PCR分子檢測(cè)對(duì)初步篩選出來(lái)的抗性植株進(jìn)行再次篩選，以陽(yáng)性質(zhì)粒為正對(duì)照，未轉(zhuǎn)化南林895楊為負(fù)對(duì)照，顯示部分結(jié)果(圖5)，PCR擴(kuò)增出的特異條帶與陽(yáng)性對(duì)照一致，本試驗(yàn)共篩選出14個(gè)株系為陽(yáng)性。

圖5 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊PCR分子檢測(cè)電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis results for PCR molecular detection of PtRCA transgenic ‘Nanlin895’ poplarM： DL 2000 marker. 1-4: 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)(sGFP表達(dá)載體片段)； -CK： 野生型； +CK： 陽(yáng)性質(zhì)粒。1-4： Transgenic lines; -CK: Negative control; +CK: Positive control.

2.6 高溫脅迫下轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊與對(duì)照RCA基因表達(dá)比較分析

以室溫(22 ℃)正常生長(zhǎng)且未轉(zhuǎn)化植株(南林895楊)組培苗為對(duì)照組，對(duì)生長(zhǎng)45天的轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊和未轉(zhuǎn)化植株(南林895楊)的組培苗進(jìn)行高溫脅迫處理，每升高5 ℃設(shè)置1個(gè)處理溫度，37 ℃封頂，設(shè)置的3個(gè)高溫脅迫溫度為27，32，37 ℃，分別共同處理1，3，5天后，取組培苗頂端第3片葉進(jìn)行采樣分析。

實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果(圖6)顯示： 高溫處理1天后，27 ℃轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量顯著上升，32，37 ℃處理植株RCA基因表達(dá)量均有所下降，未轉(zhuǎn)化植株RCA基因表達(dá)量為極顯著下降； 高溫處理3天后，所有處理植株RCA基因表達(dá)量均顯著上升，27 ℃處理的植株RCA基因表達(dá)量為極顯著上升，且轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量是未轉(zhuǎn)化植株RCA基因表達(dá)量的2倍左右； 高溫處理5天后，所有處理植株RCA基因表達(dá)量均有所下降，其中27 ℃處理的轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，32 ℃處理的轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量也高于對(duì)照組，而37 ℃處理的轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量與對(duì)照組持平。此外，任一高溫和時(shí)間處理下的轉(zhuǎn)基因植株RCA基因表達(dá)量均顯著高于未轉(zhuǎn)化植株RCA基因表達(dá)量。

圖6 高溫脅迫下南林895楊RCA基因表達(dá)模式分析Fig.6 Real-time PCR results of RCA expression in ‘Nanlin895’ poplar under high temperature stress*，P < 0.05; **，P<0.01.

2.7 光合速率相關(guān)參數(shù)的測(cè)定

2.7.1 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的光合速率日變化規(guī)律比較 對(duì)光合速率日變化測(cè)定數(shù)據(jù)的分析表明(選取轉(zhuǎn)基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析)： 1)日變化曲線形態(tài)的不同： 對(duì)照植株的峰值出現(xiàn)在11： 00和14： 00，日變化呈雙峰曲線，最高凈光合速率(Pn)為12.7 μmol·m-2s-1左右，其低谷出現(xiàn)在12： 00—13： 00之間； 而3個(gè)轉(zhuǎn)PtRCA基因株系的平均峰值出現(xiàn)在12： 00，日變化基本呈單峰曲線，最高凈光合速率(Pn)為14.9 μmol·m-2s-1(RCA6)，平均持續(xù)1 h左右開(kāi)始逐漸下降(圖7)。2)與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)在7： 00的凈光合速率(Pn)并無(wú)明顯差異，為3.9～4.3 μmol·m-2s-1之間。

根據(jù)上述分析，推測(cè)可能是由于PtRCA基因?qū)?，改善了轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的C3光合循環(huán)，并提高了轉(zhuǎn)基因植株利用強(qiáng)光的能力，使其充分利用強(qiáng)光進(jìn)行光合作用； 相比之下，對(duì)照則出現(xiàn)明顯的光抑制現(xiàn)象。

圖7 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊和對(duì)照凈光合速率(Pn)的日變化Fig.7 Diurnal change of net photosynthetic rate(Pn) between transgenic poplars and controlRCA1,RCA2,RCA6: 轉(zhuǎn)基因株系Transgenic lines.下同。The same below.

2.7.2 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的光合作用對(duì)光響應(yīng)曲線的比較 光合作用對(duì)光的響應(yīng)測(cè)定數(shù)據(jù)(選取轉(zhuǎn)基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析)表明： 光照強(qiáng)度0～400 μmol·m-2s-1時(shí)，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的凈光合速率均呈線性增長(zhǎng)，并隨著光照強(qiáng)度的不斷增加逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)(圖8)。因此，依據(jù)凈光合速率與0～400 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)光照強(qiáng)度呈線性關(guān)系，建立10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照的直線回歸方程，計(jì)算出光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)、表觀量子效率、暗呼吸速率以及光飽和時(shí)的光合速率(表3)。結(jié)果表明： 1)光飽和點(diǎn)： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)所有株系的光飽和點(diǎn)均比對(duì)照高，增加約12.5%～37.5%，其中8號(hào)株系的光飽和點(diǎn)最高。這表現(xiàn)出轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)能夠更好地利用強(qiáng)光進(jìn)行光合作用。2)光補(bǔ)償點(diǎn)： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)(除3號(hào)株系外)的光補(bǔ)償點(diǎn)均略低于對(duì)照楊樹(shù)。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)具有較強(qiáng)的利用弱光能力。3)表觀量子效率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)(除2號(hào)和6號(hào)株系外)的表觀量子效率均略高于對(duì)照楊樹(shù)。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光合作用更加活躍。4)暗呼吸速率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)(除3號(hào)和9號(hào)株系外)的暗呼吸速率均略低于對(duì)照楊樹(shù)。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)在沒(méi)有光照時(shí)消耗的能量偏少。5)光飽和時(shí)的光合速率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)在光飽和點(diǎn)時(shí)的光合速率比對(duì)照增高24.6%～55.7%(1號(hào)和2號(hào)株系的光合速率最高)。這進(jìn)一步表明高光強(qiáng)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的羧化反應(yīng)能力，使光合速率得到提高。

2.7.3 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的光合作用對(duì)CO2濃度響應(yīng)曲線的比較 光合作用對(duì)CO2濃度響應(yīng)測(cè)定數(shù)據(jù)(選取轉(zhuǎn)基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析)表明： CO2濃度0～400 μmol·mol-1時(shí)，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的凈光合速率呈線性增長(zhǎng)，并隨著CO2濃度的不斷增加逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)(圖9)。因此，依據(jù)凈光合速率與0～400 μmol·mol-1范圍內(nèi)CO2濃度呈線性關(guān)系，建立10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照的直線回歸方程，計(jì)算出CO2飽和點(diǎn)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)、羧化效率、光呼吸速率、CO2飽和時(shí)的光合速率(表4)。結(jié)果表明： 1)CO2飽和點(diǎn)： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)CO2飽和點(diǎn)除1號(hào)和4號(hào)株系外，其他均比對(duì)照低12.5%～25.0%，在略高于大氣CO2濃度下就達(dá)到飽和。2)CO2補(bǔ)償點(diǎn)： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的CO2補(bǔ)償點(diǎn)比對(duì)照大幅度降低，低53.1%～80.4%。這表明由于PtRCA基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)CO2親和力較高，這也是轉(zhuǎn)基因植株CO2飽和點(diǎn)低的原因。3)羧化效率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的羧化效率均略高于對(duì)照。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的羧化效率較強(qiáng)，能更好地催化RuBP進(jìn)行羧化反應(yīng)。4)光呼吸速率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光呼吸比對(duì)照低37.7%～79.3%。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)有利于光合作用有機(jī)物積累，光呼吸消耗較少，其生物量增加。5)CO2飽和時(shí)的光合速率： 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)在CO2飽和點(diǎn)時(shí)的光合速率比對(duì)照增加4.4%～26.4%(2號(hào)株系的光合速率最高)。轉(zhuǎn)基因植株在CO2飽和點(diǎn)較低的情況下，光合速率卻比對(duì)照高，這也進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株有較強(qiáng)的羧化反應(yīng)能力，光合速率能夠得到提高。

圖8 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的光合響應(yīng)變化Fig.8 Changes of photosynthetic response between transgenic poplars and the control設(shè)定條件： 葉室溫度30 ℃，葉室CO2濃度350 μmol·mol-1，相對(duì)濕度60%。Testing conditions: Hamuro temperature of 30 ℃, Hamuro CO2 concentration of 350 μmol·mol-1, relative humidity of 60%.

表3 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的光合響應(yīng)參數(shù)指標(biāo)Tab. 3 Index of photosynthetic response parameters of transgenic poplar and the control

2.8 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的比較

2.8.1 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的PSⅡ原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實(shí)際光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)比較 由表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析可知： 1)PSⅡ原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)： 在低光照強(qiáng)度下，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的Fv/Fm沒(méi)有明顯差異； 而經(jīng)過(guò)光氧化處理后，F(xiàn)v/Fm均存在不同程度的降低； 相比較而言，對(duì)照下降得最多，為61.7%，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)下降45.0%～53.1%(4號(hào)株系下降得最少，為45%)。2)PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)： 在低光照強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的Fv′/Fm′沒(méi)有明顯差異； 然而經(jīng)過(guò)光氧化處理后，二者的Fv′/Fm′均有不同程度的降低，對(duì)照下降得最多，為54.1%，而轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)下降38.7%～52.0%(6號(hào)株系下降得最少，為38.7%)。這表明轉(zhuǎn)PtRCA基因植株利用吸收的光子的能力較強(qiáng)，吸收的光子供給PSⅡ反應(yīng)中心的效率較高，推測(cè)這可能是由于PtRCA基因的導(dǎo)入，提高植株P(guān)SⅡ反應(yīng)中心的效率。

圖9 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照在不同CO2濃度下的光合響應(yīng)Fig.9 Photosynthetic response to CO2 concentration between transgenic poplars and the control設(shè)定條件： 葉室溫度30 ℃，光照強(qiáng)度1 200 μmol·m-2s-1，相對(duì)濕度60%。Testing conditions: Hamuro temperature of 30 ℃, light intensity of 1 200 μmol·m-2s-1, relative humidity of 60%.

表4 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的CO2光合響應(yīng)參數(shù)指標(biāo)Tab.4 Index of photosynthetic response to CO2 concentration between transgenic poplars and control

2.8.2 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的光化學(xué)猝滅(qP)和非光化學(xué)猝滅(qN)比較 由表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析可知： 1)光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)： 在低光照強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的qP沒(méi)有明顯差異； 經(jīng)過(guò)光氧化處理后，二者的qP均下降，對(duì)照下降了68.3%，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)下降較少，為51.0%～65.8%(2號(hào)株系下降的最少，為51.0%)。這表明在強(qiáng)光下，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光化學(xué)電子傳遞比較順暢，用于光化學(xué)電子傳遞的光能份額比較高，而對(duì)照出現(xiàn)了明顯的受阻現(xiàn)象。2)非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)： 在低光照強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)與對(duì)照的qN沒(méi)有明顯差異； 經(jīng)過(guò)光氧化處理后，對(duì)照增加僅為3.0%，而轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)增加較多，為6.0%～26.5%(2號(hào)株系增加的最多，為26.5%)。這表明PtRCA基因的導(dǎo)入，使得轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光合機(jī)構(gòu)沒(méi)有受到破壞，過(guò)剩光能得到較好的耗散，表現(xiàn)出較好的耐光氧化能力。

表5 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的PSⅡ原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實(shí)際光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)在不同光強(qiáng)下的比較①Tab.5 PS Ⅱ primary photochemical efficiency (Fv/Fm) and PSⅡ actual photochemical efficiency (Fv′/ Fm′) in different light intensity between transgenic poplars and control

① 平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(5組數(shù)據(jù))。Mean ±SD (n=5).

表6 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)和對(duì)照的光化學(xué)猝滅(qP)和非光化學(xué)猝滅(qN)在不同光強(qiáng)下的比較①Tab.6 Photochemical quenching (qP) and non-photochemical quenching (qN) in different light intensity between transgenic poplars and the control

① 平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(5組數(shù)據(jù))。Mean±SD (n=5).

3 討論

高光強(qiáng)一直是抑制植物生長(zhǎng)、降低光合速率的主要因素，然而，近幾年一系列研究表明： Rubisco活化酶(RCA)具抵御高光強(qiáng)脅迫的作用，這為培育高產(chǎn)量抗逆植株提供了理論依據(jù)。

3.1 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊與其他轉(zhuǎn)RCA基因植物的比較分析

在研究擬南芥Rubisco活化問(wèn)題時(shí)首先發(fā)現(xiàn)RCA，經(jīng)過(guò)對(duì)RCA進(jìn)行一系列抗體研究，發(fā)現(xiàn)它存在于高等植物及一些單細(xì)胞光合生物中，這說(shuō)明在光合生物中，RCA對(duì)Rubisco活性調(diào)節(jié)機(jī)制普遍存在，RCA與光合作用有著密切關(guān)系(Hasseetal., 2015)。

利用農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)獲得了RCA基因正義擬南芥，結(jié)果顯示僅表達(dá)大亞基的正義植株各項(xiàng)指標(biāo)與野生型并無(wú)明顯差異，而只表達(dá)小亞基的正義轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型(Zhangetal., 2002)。同樣，相似正義遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)小亞基正義植株長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于野生型植株，另外，該研究發(fā)現(xiàn)RCA與GA信號(hào)傳導(dǎo)有密切聯(lián)系(Sharmaetal., 2002； Wangetal., 2010)。雖然以上試驗(yàn)均表明RCA基因主要是由小亞基表達(dá)功能，但對(duì)獲得的正義水稻研究表明，轉(zhuǎn)大亞基植株的Rubisco活性、光合效率指標(biāo)均明顯高于野生型，作物產(chǎn)量也有所提高(Wuetal.， 2007)。這些研究為通過(guò)基因工程，增強(qiáng)植物的抗逆性，進(jìn)而提高植物光合速率和產(chǎn)量提供了新的思路。研究轉(zhuǎn)基因水稻RCA基因調(diào)控時(shí)，發(fā)現(xiàn)RCA對(duì)葉綠體的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，且在水稻發(fā)育生長(zhǎng)后期，轉(zhuǎn)基因植株葉片中RCA含量一直偏高，隨著葉片的衰老，RCA含量逐步降低，光合速率下降，說(shuō)明植物光合速率受RCA影響，RCA對(duì)凈光合速率起重要調(diào)控作用(蔣德安等, 2000； 翁曉燕等, 2001； 張國(guó)等, 2005)。

本研究嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因技術(shù)使毛果楊PtRCA基因在楊樹(shù)中高效表達(dá)，通過(guò)PtRCA基因的特性，使Rubisco處于穩(wěn)定的催化活性狀態(tài)，讓Rubisco更加有效地參與到光合碳同化過(guò)程中。本研究結(jié)果也表明，克隆得到的PtRCA基因蛋白與擬南芥等RCA蛋白同源性較高，可作為研究楊樹(shù)PtRCA蛋白功能的參考依據(jù)。分析證實(shí)了RCA具耐高溫耐熱能力, 轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)能夠充分利用中午的強(qiáng)光進(jìn)行光合作用，利用CO2的能力較強(qiáng)，能更好地催化RuBP進(jìn)行羧化反應(yīng)，羧化效率較強(qiáng)。在強(qiáng)光下，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光合機(jī)構(gòu)沒(méi)有受到破壞，過(guò)剩光能得到較好的耗散，表現(xiàn)出一定的耐光氧化能力。

上述結(jié)果表明具較高耐高溫耐熱性的RCA轉(zhuǎn)基因植株，受到中度熱脅迫時(shí)，仍具有較高的光合速率以及生產(chǎn)量。這與在研究擬南芥轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，發(fā)現(xiàn)RCA對(duì)凈光合速率熱恢復(fù)具重要作用(Kureketal., 2007)等相關(guān)研究結(jié)果一致。這為利用轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行楊樹(shù)新型高光效抗逆新品種的研究提供了重要依據(jù)。

3.2 轉(zhuǎn)PtRCA基因南林895楊與轉(zhuǎn)PEPC基因(C4植物)南林895楊的比較分析

與C3植物只利用卡爾文循環(huán)中1，5-二磷酸核酮糖直接固定CO2相比，C4植物首先利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，經(jīng)PEP羧化酶(PEPC)的作用與CO2結(jié)合，形成蘋果酸或天門冬氨酸。這些四碳雙羧酸轉(zhuǎn)移到鞘細(xì)胞里，通過(guò)脫羧酶的作用釋放CO2，后者在鞘細(xì)胞葉綠體內(nèi)經(jīng)核酮糖1，5-二磷酸(RuBP)羧化酶作用，進(jìn)入卡爾文循環(huán)。因?yàn)镻EP與CO2的結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于RuBP，這使得C4植物即使在CO2濃度比較低的時(shí)候，依然可以通過(guò)這一點(diǎn)源源不斷為光合作用提供充足的CO2，使得C4植物光合作用也較強(qiáng)。因此，通過(guò)分子技術(shù)讓C3植物與C4植物一樣，具有更加高效的光合作用已成為現(xiàn)今研究的熱門課題(Leegood, 2013)。

據(jù)報(bào)導(dǎo)，水生植物Egeriadensa和Hydrillaverticilata體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有C4光合途徑，這一發(fā)現(xiàn)很大程度上預(yù)示著，或許可以通過(guò)C4光合酶基因向C3植物的遺傳轉(zhuǎn)化從而提高C3植物光合作用的可操作性(Tengetal., 2001； Lietal., 2005)。作者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將光合作用C4途徑關(guān)鍵酶基因PEPC導(dǎo)入楊樹(shù)并進(jìn)行相關(guān)特性的分析，其研究結(jié)果(尹吳等， 2012)與本研究相比： 轉(zhuǎn)PEPC基因楊樹(shù)具有C4植物的某些高光效特性，在光合速率、光能利用效率、羧化效率等方面的表現(xiàn)與其對(duì)照相比具有一定的優(yōu)勢(shì)，這些表現(xiàn)在一定程度上優(yōu)于本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)PtRCA基因株系對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)； 然而，在耐光氧化方面，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)比轉(zhuǎn)PEPC基因楊樹(shù)具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)。上述對(duì)比說(shuō)明PEPC基因能夠更好地固定CO2，對(duì)CO2的親合力較強(qiáng)，從而促使磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)固定大氣中濃度較低的CO2，供C3途徑利用，因此轉(zhuǎn)PEPC基因楊樹(shù)的羧化效率更高，利用CO2的能力更強(qiáng)，而RCA基因具有很強(qiáng)的耐高溫抗高光強(qiáng)的特性。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)具有較高的凈光合速率，推測(cè)是由于PtRCA基因的導(dǎo)入，提高了轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)利用強(qiáng)光的能力，使其能夠充分利用中午的強(qiáng)光進(jìn)行光合作用。轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)所有株系的光飽和點(diǎn)較高，且在光飽和點(diǎn)時(shí)的光合速率較高。這說(shuō)明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)能夠較好地利用強(qiáng)光進(jìn)行光合作用。轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)CO2飽和點(diǎn)較低(除1號(hào)和4號(hào)株系外)； 而在CO2飽和點(diǎn)時(shí)的光合速率，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)較高； 此外，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的羧化效率較高。這些均表明轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)利用CO2的能力較強(qiáng)，能夠更好地催化RuBP進(jìn)行羧化反應(yīng)，羧化效率較強(qiáng)。

轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)利用吸收的光子的能力較強(qiáng)，吸收的光子供給PSⅡ反應(yīng)中心的效率較高，推測(cè)這可能是由于PtRCA基因的導(dǎo)入提高了PSⅡ反應(yīng)中心的效率。在高光照強(qiáng)度下，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)的光化學(xué)電子傳遞比較順暢，其PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額較高，且轉(zhuǎn)PtRCA基因楊樹(shù)表現(xiàn)出耐光氧化的能力，其過(guò)剩光能量得到較好的耗散。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Cloning and Functional Analysis of Rubisco Activase Gene fromPopulustrichocarpa

Yin Wu Sun Weibo Zhou Yan Zhuge Qiang

(KeyLaboratoryofForestGenetics&BiotechnologyofMinistryofEducationCo-InnovationCenterforSustainableForestryinSouthernChinaNanjingForestryUniversityNanjing210037)

【Objective】 Ribulose-1,5-bishosphate (Rubisco) is the key enzymes in the first step of carbon assimilation involved in plant photosynthesis. Rubisco was kept in a catalytic active state under the control of Rubisco activase(RCA), as a result, the efficiency of photosynthesis will be improved. In this research, thePtRCAgene of poplars was cloned. Transgenic poplars with high expression ofPtRCAwere obtained through this research. As a result, a new type of high efficiency photosynthesis with stress tolerance was proved to be feasible through the analysis of molecular detection and functional analysis. 【Method】According to the sequence ofPtRCAgene cloned fromPopulustrichocarpa, the analysis of function and structure ofPtRCAwere conducted through Bioinformatics software.PtRCAwas constructed into the expression vector pGWB406 by usingAgrobacteriummediated method. ‘Nanlin895’poplar plants (P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’) were used in this research. Gene expression of both transgenic poplars and ‘Nanlin895’plants were compared under high temperature stress. The parameters of photosynthesis and chlorophyll fluorescence were compared between them as well. 【Result】The CDS sequence ofPtRCAwas 1 323 bp. There were 440 amino acid residues, and protein molecular weight is 48 315.9 Da. The isoelectric point is 5.57, which is hydrophobic protein without signal peptide and membrane structure.PtRCAis proved to be in the same AAA+ family according to the result of sequence comparison. It has same RCA homology protein with soybean and arabidopsis as well. The expression quantity of transgenic poplars were higher than ‘Nanlin895’ in average. Transgenic poplars showed advantage of photosynthesis during the noon, the light saturation point was 12.5% to 37.5% higher. Moreover, the efficiency of photosynthesis was 24.6% to 55.7% higher than the plants used as control. However, the light compensation point is lower than that of plants without transgenosis expect the No.3 strain. Besides, the usage of CO2and the carboxylation efficiency of the transgenic poplars were better. Expect No.1 and No.4 strains, CO2saturation point was around 12.5%-25.0% less than control plants. CO2compensation point and light respiration were proved to be 53.1%-80.4% and 37.7%-79.3% lower compared to the controls respectively. Moreover, the efficiency of photosynthesis at the CO2saturation point was around 4.4%-26.4% higher. The tolerance of transgenic poplars to light oxidation was increased according to this research. Under the light oxidation treatment, the primary photochemical efficiency of PSⅡ decreased 61.7% in control lines. And transgenic poplar decreased by 45.0%- 53.1%.The actual photochemical efficiency of PSⅡ in controls decreased 54.1%. And transgenic poplar decreased by 38.7%-52.0%.Photochemical quenching coefficient dropped 68.3%, and 51.0%-65.8% declined in transgenic poplars. Non photochemical quenching coefficient increased by 3.0% compared to the control, and 6.0%-26.5% increased in transgenic poplars.【Conclusion】 Poplar Rubisco activase (PtRCA) protein and soy protein,ArabidopsisthalianaRCA homology is higher. According to the real-time quantitative PCR and related physiological analysis, transgenic poplars (P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’) showed high-temperature resistance, higher efficiency of photosynthesis, increased ability to use CO2and better catalyzing effect on carboxylation reaction. The efficiency of assimilating photons and supplying to PSⅡ was highly developed, and as a result, the light oxidation ability of transgenic poplars was proved to be enhanced. The efficiency of photosynthesis was improved by high expression ofPtRACgene in transgenic poplars, which also showed ability to adjust for high temperature and strong light.

Populus; Rubisco activase gene; transgenic; photosynthesis

10.11707/j.1001-7488.20170410

2016-09-20；

2016-12-10。

國(guó)家科技部“863計(jì)劃”課題(2013AA102703); 國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2014DFG32440); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570650); 江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)。

S718.46； S718.43

A

1001-7488(2017)04-0083-13

*諸葛強(qiáng)為通訊作者。