孫小涵，張碧成，張強，何孔旺，張雪寒

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室， 南京210014；2吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 長春130118）

非致病性大腸桿菌鞭毛蛋白對O型口蹄疫病毒的佐劑效果

孫小涵1,2，張碧成1，張強1,2，何孔旺1，張雪寒1

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室， 南京210014；2吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 長春130118）

【目的】口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）的傳染性強，傳播廣，給世界經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來巨大危害，目前疫苗接種仍是主要而有效的防控手段。以增強口蹄疫疫苗免疫效力為目的，基于國內(nèi)外對鞭毛蛋白佐劑的深入了解與研究，對非致病性大腸桿菌鞭毛進行修飾，研究鞭毛蛋白（flagellin, F）以及有無LTMT佐劑不同重組鞭毛蛋白對口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse, FMDV)的佐劑作用?！痉椒ā客ㄟ^體外表達獲得 pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4種不同重組鞭毛蛋白，用間接ELISA方法檢測pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物學活性，按照5 μg/只小鼠蛋白量與FMDV滅活抗原混合制備疫苗，同時設(shè)置添加或者不添加ISA 206佐劑組，皮下接種Balb/c小鼠，共免疫2次，每次間隔2周。分別于免疫前和免疫后 14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠糞便，45 d后取小腸后段，采用阻斷ELISA方法檢測血清IgG抗體滴度，用間接ELISA方法檢測小鼠糞便和腸洗液中特異的分泌性IgA（secretory IgA, SIgA）抗體滴度，以評估免疫效力。【結(jié)果】SDS-PAGE 和 Western blot分析表明，4種不同重組鞭毛蛋白成功表達。并用GM l-ELISA方法驗證了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物學活性，融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了與GM l結(jié)合能力。動物試驗結(jié)果表明，疫苗經(jīng)皮下注射接種后，單獨口蹄疫抗原組沒有產(chǎn)生明顯的抗體水平，而鞭毛蛋白佐劑組比單獨的口蹄疫抗原組，IgG滴度高，并且產(chǎn)生sIgA抗體滴度更早、更高。此外，LTMT與鞭毛蛋白協(xié)同作用能刺激小鼠機體產(chǎn)生更高的IgG和sIgA。在試驗中，當鞭毛蛋白與ISA 206佐劑聯(lián)合使用時，血清中IgG滴度大幅增高，且抗體持續(xù)期延長?？谔阋呖乖cISA 206佐劑和F0NC-LTMT混合使用效果最佳，顯示對FMDV的最好保護?！窘Y(jié)論】數(shù)據(jù)表明，黏膜佐劑F0-LTMT發(fā)揮雙重佐劑活性，皮下注射可顯著提高FMDV全身特異性IgG和局部sIgA水平，顯示其具有良好的應(yīng)用前景。

口蹄疫病毒；非致病性大腸桿菌；鞭毛蛋白；佐劑

0 引言

【研究意義】現(xiàn)在已知致病菌來源的鞭毛蛋白具有免疫佐劑效果[1-2]，但是因其來源于致病菌，可能具有潛在的危險性，致病菌的鞭毛與腸上皮細胞基底外側(cè)表達的TLR 5接觸，可誘導NF-κB途徑介導的促炎反應(yīng)，產(chǎn)生大量針對鞭毛自身的免疫反應(yīng)，導致可能的耐受性。而共生菌的鞭毛蛋白只與腸上皮細胞頂部接觸，不誘導明顯的促炎反應(yīng)，而且具有良好的佐劑活性[3]。本研究以口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)為評估對象，研究非致病性大腸桿菌鞭毛的免疫增強能力?！厩叭搜芯窟M展】鞭毛蛋白作為TLR-5受體激動劑，能夠誘導強烈的、廣泛的免疫反應(yīng)[4]。鞭毛蛋白是細菌鞭毛的單體亞基，具有高度保守的N端和C端，中間有一個高變區(qū)。鞭毛蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用是通過TLR-5受體識別保守的N端和C端[5]。鞭毛蛋白佐劑效果先前已在許多疫苗中確定，包括流感病毒[6-7]、結(jié)核分枝桿菌[8]和鼠疫菌[9]，報告表明鞭毛蛋白是優(yōu)良的載體和佐劑。MCSORLEY等[10]以鞭毛蛋白作為卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）的佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)CD4+T 細胞對OVA肽段 (322—339) 的反應(yīng)提高了3—10倍。PINO等[11]用FljB聯(lián)合抗原共同免疫和抗原單獨滴鼻免疫小鼠，前者產(chǎn)生更高水平的黏膜反應(yīng)和全身性免疫應(yīng)答，并且顯示出更強烈的CD4+T細胞應(yīng)答。而SUN[12]等用非致病性大腸桿菌與引發(fā)齲齒的變形鏈球菌的PAc蛋白融合表達時，鼻腔免疫8.5 μg融合蛋白能夠降低大鼠64.2%齲齒率。YANG等[13]用HIV-1 p24抗原取代非致病大腸桿菌主要的抗原性區(qū)域D2和D3域，使非致病性大腸桿菌鞭毛與HIV-1 p24嵌合表達時，小鼠IgA滴度仍然保持較高水平，而炎癥反應(yīng)明顯減弱，這大大增大了重組抗原安全使用的劑量范圍?！颈狙芯壳腥朦c】針對當前口蹄疫疫苗免疫后抗體產(chǎn)生慢、抗體水平低、抗體持續(xù)期短的缺點[14]，嘗試研制一種新型黏膜免疫佐劑。本研究以一種來源于正常共生菌株的鞭毛蛋白主體，構(gòu)建多個重組形式的鞭毛蛋白，與FMDV滅活抗原制備疫苗，皮下接種Balb/c小鼠，檢測小鼠血清IgG、糞便和小腸 IgA抗體，評估免疫效力。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在制備非致病性大腸桿菌重組鞭毛蛋白，評估對其對FMDV的免疫增強作用。同時比較鞭毛蛋白與LTMT共同使用對FMDV滅活疫苗的佐劑作用。

1 材料與方法

試驗于2015年7月至2016年7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所完成。

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌K-12 MG1655菌株、pUC57-LTMT（用于表達大腸桿菌LTB亞單位）、pCold I載體均為農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室保存。大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α和BL21(DE3)，購自TransGen公司。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶 XbaⅠ、EcoR I 、SalⅠ、T4 DNA ligase連接酶購自Takara公司；蛋白純化試劑盒購自GE公司；HRP-羊抗兔-IgG購自南京諾唯贊生物科技有限公司；GM1 購自Sigma公司；HRP標記的羊抗鼠IgA抗體、兔源抗CTB抗體購自Abcam公司；口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 實驗動物

6—8周齡Balb/c小鼠，購于揚州大學醫(yī)學院。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建

1.4.1 引物設(shè)計與合成 以大腸桿菌K-12 MG1655菌株（Genbank登錄號：NC_000913.3）為模板，Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表1（下劃線為酶切位點EcoR I和Sal I）。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒 以大腸桿菌K-12 MG1655菌株為模板，擴增F0和F0NC，再將目的基因F0和F0NC分別插入到表達載體 pCold-His相應(yīng)的酶切位點中；同時將實驗室保存的克隆質(zhì)粒pUC57-LTMT，插入到表達載體pCold-his-F0和pCold-his-F0NC，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-his-F0-LTMT和pCold-his-F0NC-LTMT。

1.5 重組融合蛋白的表達和純化

1.5.1 重組蛋白的表達 將陽性重組質(zhì)粒pCold-his-F0-LTMT和pCold-his-F0NC-LTMT轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，挑取單菌落37℃繼續(xù)快速培養(yǎng)至OD600=0.4—0.6，加IPTG至終濃度1 mmol·L-1（同時設(shè)對照組），16℃進行過夜誘導表達；SDS-PAGE鑒定重組蛋白是否表達，并分析其可溶性。

1.5.2 重組蛋白純化和Western blot分析 過夜誘導重組菌，參照GE公司His TrapTMHP說明書純化重組蛋白。SDS-PAGE檢測純化效果，同時用兔抗大腸桿菌鞭毛抗血清對純化后蛋白進行Western blot分析。RC DC Protein Assay測定純化蛋白的濃度，并用內(nèi)毒素除去柱Detoxi-GelTM去內(nèi)毒素，凝膠法鱟試劑檢測內(nèi)毒素含量，按使用說明書進行。

1.6 GM1-酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）

每100 μL含神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 2 μg包被96酶聯(lián)板，4℃ 過夜；洗板，用2%的BSA，200 μL，37℃封閉2 h；洗板，每孔加入含12.5 ng的純化的蛋白有LTMT的，同時設(shè)陰陽性對照；PBST洗滌，加入兔源抗CTB，1﹕1 000，37℃，2 h；PBST洗滌，加入HRP-羊抗兔-IgG 1﹕10 000，37℃，1 h；洗滌后加入TMB顯色。終止液，測OD450。

1.7 免疫接種

將6周齡的Balb/c小鼠隨機分成7組，5只/組，按照5 μg/只小鼠蛋白量與FMDV滅活抗原混合制備疫苗，后以1﹕1的比例添加ISA 206佐劑，具體分組和免疫劑量（表2）。共免疫2次，間隔2周。分別于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d小鼠眼眶靜脈叢采血并采集小鼠糞便，45 d小鼠處死，取小腸后段，測定不同免疫時期小鼠的抗體水平。

表2 小鼠免疫試驗Table 2 Mice immunization

1.8 小鼠血清抗體水平的檢測

1.8.1 免疫小鼠糞便特異性 sIgA測定 采用間接ELISA方法進行：每0.1 g糞便加入0.5 mL糞便提取液，4℃浸潤。12 000 r/min 離心10 min，收集上清。以重組VP1蛋白做為抗原包被ELISA反應(yīng)板（0.08 μg/孔），4℃包被過夜；用5%脫脂乳封閉，洗板；按一定的倍數(shù)稀釋待檢樣品（同時設(shè)陰性對照），37℃反應(yīng)1 h；二抗是HRP標記羊抗鼠 IgA，37℃反應(yīng)1 h，顯色終止。酶標測定儀在波長450 nm處測定每孔的光吸收值。

1.8.2 免疫小鼠血清中特異性 IgG檢測 用口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒進行檢測：分別于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠血液，分離血清，檢測方法參照說明書。

1.8.3 免疫小鼠腸道中sIgA檢測 間接ELISA方法進行檢測：在免疫45 d處死小鼠，采集小腸后段5 cm，加入0.5 mL腸道沖洗液處理，12 000 r/min離心10 min，收集上清。測定方法同1.8.1。

2 結(jié)果

2.1 重組菌構(gòu)建、蛋白表達和純化

經(jīng)雙酶切鑒定，均獲得大小預期片段，為陽性重組質(zhì)粒（圖 1）。SDS-PAGE顯示，重組蛋白以可溶形式存在于細菌裂解上清中，F(xiàn)0、F0NC、F0-LTMT、F0NC-LTMT蛋白大小分別為55、41、79和61 kD。經(jīng)His TrapTMHP純化后，得到高濃度和高純度的4種重組蛋白（圖2），通過檢測內(nèi)毒素含量均小于0.5 EU·mL-1。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)鑒定圖Fig. 1 Restriction enzyme of recombinant plasmids

圖2 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE patterns of purified product

2.2 Western blot 分析

純化的蛋白SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以兔抗大腸桿菌鞭毛抗血清為一抗，HRP 標記的羊抗兔IgG抗體為二抗，顯色后出現(xiàn)清晰且特異的目的條帶（圖3）。

2.3 生物學活性檢測

LTMT的免疫增強是由于其形成的五聚體有與GM l結(jié)合能力，在熱變性下，使五聚體解聚后喪失與GM l結(jié)合能力。因此，鑒定融合蛋白 F0-LTMT和 F0NCLTMT是否能形成五聚體，保留與GM l結(jié)合能力是很必要的。GM l-ELISA分析表明，融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了大部分與GM l結(jié)合能力。而單純的載體蛋白H0與GM 1基本無結(jié)合能力（圖4）。

圖3 表達產(chǎn)物Western-blot 分析Fig. 3 The Western-blot analysis of the expression product

圖4 融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT生物學活性檢測Fig. 4 Test results of biological activity of fusion protein F0-LTMT and F0NC-LTMT

2.4 Balb/C小鼠的免疫效果

2.4.1 免疫小鼠中糞便特異性 sIgA測定 分別于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠糞便，檢測sIgA水平。圖 5所示，1組（滅活口蹄疫病毒組）和2組（206+滅活口蹄疫病毒組）沒有sIgA抗體產(chǎn)生，而含有鞭毛蛋白免疫組小鼠產(chǎn)生明顯特異性sIgA抗體。4組（F0+滅活口蹄疫病毒組）在28 d達到最高，1﹕50；5組（F0NC+滅活口蹄疫病毒組），F(xiàn)0截掉高變區(qū)后，IgA抗體滴度是 5組一半，為 F蛋白組中抗體水平最低的。6組（F0-LTMT+滅活口蹄疫病毒組）和7組（F0NC-LTMT+滅活口蹄疫病毒組）比4組抗體水平高，7組是所有組最好，為1﹕55，高于無F蛋白的1組和2組約50個滴度單位，差異極顯著（P＜0.001），比3組和4組抗體水平高約25個滴度單位，比6組高約15個滴度單位，在45 d后，F(xiàn)蛋白3、4、5、6、7組仍可以檢測到相應(yīng)的sIgA抗體。

2.4.2 免疫小鼠血清中特異性 IgG測定 分別于免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠血液，收集血清檢測IgG水平。經(jīng)2次免疫在21 d各組小鼠產(chǎn)生了較高的抗體水平，除1組外，其他各組均達到完全保護（26）。在28 d F蛋白+滅活口蹄疫病毒免疫組中6組產(chǎn)生抗體效果明顯 1﹕180（27.5），其他差異不明顯，大約在1﹕110（26.8）。2組抗體水平較高約1﹕240（27.9），而ISA 206佐劑和H0NC-LTMT與滅活口蹄疫病毒混合使用的效果最佳1﹕256（28），與滅活口蹄疫病毒的對照組相比較差異極顯著（P＜0.001，圖 6）。持續(xù)到45 d仍可以檢測到較高抗體。

2.4.3 免疫小鼠腸道中sIgA檢測 在免疫45 d采集小鼠腸道，檢測sIgA水平，檢測結(jié)果表明（圖 7），不含F(xiàn)蛋白的1、2 組幾乎檢測不到 IgA 抗體，而含有F蛋白的幾個免疫組在免疫鼠腸道中能夠測得較高的IgA抗體。3組、5 組、4 組、6 組和7 組IgA抗體水平依次增高，7 組為最高可達 1﹕55，高于滅活口蹄疫病毒組 1﹕10，差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 免疫小鼠糞便中 IgA 水平Fig. 5 IgA level in fecal material of immunized mice

圖6 免疫小鼠血清中IgG水平Fig. 6 IgG level in the serum of immunized mice

3 討論

鞭毛蛋白作為天然免疫應(yīng)答的誘導劑，能誘導產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答幫助外源抗原建立獲得性免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白以偶聯(lián)或融合形式作為創(chuàng)新疫苗的一個重要佐劑已被頻繁報道。而根據(jù)鞭毛蛋白兩端保守，中間高度變異的特點，研究者對其遺傳學、免疫學等方面作深入研究，逐步建立了有效的鞭毛表達系統(tǒng)[15-16]。LEE等[17]用嗜鹽弧菌鞭毛蛋白 FIaB作為破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT）的佐劑，通過鼻內(nèi)免疫小鼠，結(jié)果表明TT特異性sIgA明顯高于對照組。HONKO等[9]將鞭毛蛋白聯(lián)合鼠疫桿菌Fl蛋白皮下和鼻腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)顯著增強了F1特異性IgG抗體水平，且IgG抗體亞類傾向于Th2平衡。HULEATT[18]等通過TLR5配體鞭毛蛋白與保守的流感基質(zhì)蛋白 M2外功能區(qū)的4個重復序列在大腸桿菌中融合表達，提純后得到重組蛋白STF2.4xM2e，用其免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)M2e特異性抗體水平和M2e肽與鋁膠佐劑混合組相當，鼻腔免疫0.3 μg重組蛋白就能防止甲型流感病毒的致死性感染。SALMAN[19]更是將腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白與OVA制成納米包被顆粒，發(fā)現(xiàn)不管是灌服還是皮下注射免疫都出現(xiàn)了顯著而平衡的全身性免疫應(yīng)答。而且給藥方式也靈活多變，有皮下注射，鼻內(nèi)免疫，口服接種等。雖然鞭毛蛋白的佐劑功能激活的具體機制尚未清楚闡釋，但蛋白純化不僅容易可行，而且蛋白純度較高，給藥方式靈活，并最終使機體產(chǎn)生特異性體液免疫、黏膜免疫和細胞免疫反應(yīng)，成為新型佐劑的候選者。

圖7 免疫小鼠腸道中IgA水平Fig. 7 IgA level in intestinal tract of immunized mice

口蹄疫被認為是全球引起最多經(jīng)濟損失的傳染病[20]，其病死率雖然不是很高，但對畜牧業(yè)造成的影響巨大。目前中國預防口蹄疫的主要措施是疫苗的免疫注射，而滅活口蹄疫疫苗使用最為廣泛[21-22]。單純的口蹄疫病毒抗原的免疫原性比較低，免疫動物后不能產(chǎn)生有效的保護力， 需要使用佐劑提高抗原免疫原性，例如鋁鹽類佐劑和油乳類佐劑，鋁鹽類佐劑產(chǎn)生的抗體效價較低，并且維持免疫反應(yīng)持久性上較弱[23]；油乳類佐劑也伴隨一定的副反應(yīng)，特別是在注射部位引起的上皮巨噬細胞顆?；蜐?。而細菌鞭毛蛋白作為疫苗佐劑具有以下諸多特點：通過使用極低劑量（1 —10 μg）的細菌鞭毛蛋白就可促進IgG 1和IgG 2a應(yīng)答[24]，這樣有可能會避免對機體產(chǎn)生副作用；另外，給兔滴鼻或使用兩倍劑量（100—500 mg）肌肉注射，28 d后仍然沒有檢測到毒性；鞭毛蛋白除有自身的強免疫原性外，還具有增強外源抗原免疫原性的特性，包括體液免疫和細胞免疫。但由于鞭毛蛋白來源于致病菌，可引發(fā)促炎反應(yīng)[25]。而筆者選擇來自非致病性細菌鞭毛蛋白作為佐劑，是由于其具有非致病性的性質(zhì)和免疫反應(yīng)的特點。研究認為非致病性大腸桿菌鞭毛蛋白將是一個安全而有效的佐劑。

在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白對機體的體液免疫和黏膜免疫都有一定的促進作用。IOANNA等[26]經(jīng)口鼻免疫接種的鞭毛蛋白佐劑流感疫苗，能同時提高小鼠體內(nèi)的IgG和IgA的水平，但研究表明鞭毛蛋白對IgG有一定的促進作用，但并不顯著，這種差異可能和所用的抗原和免疫途徑不同有關(guān)。而CHAUNG等[27]用雞體研究鞭毛蛋白佐劑H5N2亞型禽流感疫苗的結(jié)果表明，經(jīng)口鼻免疫接種鞭毛蛋白佐劑H5N2亞型禽流感疫苗后，雞體內(nèi)血清IgG的水平均沒有顯著提高。這與本研究的結(jié)果相似，表明沙門菌鞭毛蛋白佐劑作用很可能是通過提高黏液中sIgA水平來實現(xiàn)的。在本試驗中，筆者加入廣泛應(yīng)用于口蹄疫疫苗的 ISA 206佐劑，顯著增強了口蹄疫抗原的免疫效果，當ISA 206佐劑和H0NC-LTMT與滅活口蹄疫病毒混合免疫時，IgG抗體水平比 206+滅活口蹄疫病毒組極顯著增高（圖 6），說明ISA 206佐劑和H0NC-LTMT混合使用能更好的促進小鼠產(chǎn)生IgG抗體。而鞭毛蛋白對黏膜免疫的作用尤為明顯，經(jīng)皮下免疫的F蛋白與滅活口蹄疫病毒組均產(chǎn)生較高的IgA抗體，而無F蛋白組幾乎沒有IgA抗體產(chǎn)生。如圖 5所示，F(xiàn)0蛋白截掉高變區(qū)后，影響了IgA抗體的產(chǎn)生，只有F0全長的一半，全部或部分缺失鞭毛蛋白高變區(qū)會使鞭毛的抗原性降低，但不會影響其佐劑活性[28]。而高變區(qū)容許外源蛋白插入[10-11]，為此將LTMT插入到F0和F0NC融合表達后，顯著增加了IgA抗體水平，二免21 d后F0NC-LTMT蛋白效果達到最佳，同時F0和F0NC與LTMT融合表達也在一定程度上促進 IgG產(chǎn)生，與sIgA結(jié)果不同，F(xiàn)0-LTMT更能有效的促進IgG抗體產(chǎn)生。大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin, LT）的B亞單位為LT的結(jié)合部位，其無毒性以及良好的黏膜佐劑活性, 成為黏膜疫苗研究的一個重要佐劑[29-30]。有研究表明，小鼠黏膜免疫試驗，LT能誘導混合的CD4+Th1和Th2型細胞[31]。黏膜免疫是免于機體被病原體侵犯的重要屏障，LTMT與鞭毛蛋白協(xié)同作用能刺激小鼠機體產(chǎn)生更高的sIgA?？谔阋卟《究梢酝ㄟ^口腔和呼吸道黏膜方式感染，因此，疫苗能夠誘導黏膜免疫是非常重要的[32]。而針對當前O型口蹄疫疫苗免疫后抗體產(chǎn)生慢、抗體水平低、抗體持續(xù)期短的缺點，在本試驗中14 d即可檢測到IgG抗體水平，28 d各組達到完全保護，達到最高，而且到45 d仍然可以檢測到較高的抗體水平，達到完全保護。說明鞭毛蛋白對機體的體液免疫和黏膜免疫都有一定的促進作用，對口蹄疫抗原具有佐劑作用。

4 結(jié)論

口蹄疫病毒與較低劑量鞭毛蛋白皮下免疫確實能夠刺激小鼠機體產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答和一定的全身體液免疫應(yīng)答，非致病性大腸桿菌鞭毛蛋白具有作為滅活口蹄疫疫苗佐劑的潛力。

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（責任編輯 林鑒非）

Adjuvant Effects of Flagellin from Non-Pathogenic E.coli on FMDV

SUN XiaoHan1,2, ZHANG BiCheng1, ZHANG Qiang1,2, HE KongWang1, ZHANG XueHan1
(1Institute of Veterinary Research, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Engineering Research of Veterinary Bio-products of Ministry Agriculture, Nanjing 210014;2College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin 130118)

【Objective】Foot and mouth disease (FMD) is highly infections and spread wide. It has brought a great harm to the world economic and social development. The current vaccination is still the main and effective means of prevention and control of this disease. To enhance FMD Virus (FMDV) antigenicity, the Flagella (F0) was modified from the non-pathogenic Escherichia coli to construct recombinant F0 protein and evaluate the single F0 protein and fusion protein F0-LTMT adjuvant effectiveness on FMDV based on the research about flagella protein adjuvants from home and abroad.【Method】Four recombinant proteins of F0, F0-LTMT, F0NC, and F0NC-LTMT were expressed, and their biological activities were detected by GM1-ELISA. The FMDV immunogen was prepared by mixing inactivated FMDV with a single recombinant F0 at 5 μg per mouse, and additional ISA 206 adjuvant was setaccording to the proportion to evaluate the immune effect in mice. The Balb/c mice was subcutaneously inoculated with emulsified immunogen twice at intervals of 2 weeks. Sera and feces were collected, respectively, on the day 0, 14, 21, 28, 35 and 45, and distal intestine was also collected after immunization on day 45. Titers of IgG in serum were detected by blocking ELISA kit, specific sIgA in feces and intestinal liquid by indirect ELISA to evaluate the titers.【Result】SDS-PAGE and Western blot analyses showed that four different recombinant flagellin were successfully obtained. Their biological activities were verified by GM l-ELISA. In mice no significant levels of antibodies were detected in the single FMDV immunized group compared with higher IgG titer sIgA titers in flagellin adjuvant group. Moreover, the synergistic effect of LTMT and flagellin facilitated to produce more IgG and sIgA in mice. When flagellin combined with the ISA 206 adjuvant, the titer of serum IgG increased significantly and gave extended duration. The mixed immunogen of FMDV, ISA 206 and H0NC-LTMT displayed the best antibody titers.【Conclusion】F0-LTMT provided dual adjuvant effectiveness to FMDV, induced systemic specific IgG and sIgA in mice. It is a potential mucosal adjuvant for FMDV.

FMDV; Escherichia coli; flagellin; mucosal adjuvant

2016-08-05；接受日期：2017-02-07

江蘇省自主創(chuàng)新資金（cx（15）1060）、國家自然科學基金（31572503）

聯(lián)系方式：孫小涵，Tel：18641938670；E-mail：1427670749@qq.com。通信作者張雪寒，E-mail：liuxuehan1996@hotmail.com