王小柯，江東,2，孫珍珠

（1西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，重慶 400712）

利用GBS技術(shù)研究240份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化

王小柯1，江東1,2，孫珍珠1

（1西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，重慶 400712）

【目的】GBS（genotyping-by-sequencing）是一種高效而經(jīng)濟(jì)的SNP（單核苷酸多態(tài)性）發(fā)掘和基因分型技術(shù)。采用GBS技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行基因分型，以闡明一些野生寬皮柑橘和地方品種的遺傳背景，為其起源和演化研究提供更可靠的證據(jù)。【方法】選用國(guó)家柑橘種質(zhì)重慶資源圃保存的具有廣泛遺傳多樣性和地理起源的240份寬皮柑橘作為材料，利用EcoR I限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA后構(gòu)建GBS文庫(kù)；然后進(jìn)行Illumina HiSeq PE150二代測(cè)序獲得短讀序列，通過BWA軟件將序列映射到克里曼丁參考基因組上，再利用SAMTOOLS軟件鑒定SNP位點(diǎn)。依據(jù)SNP的基因分型結(jié)果，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)演化樹，并進(jìn)行主成分分析?！窘Y(jié)果】利用GBS簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行測(cè)序，共獲得96.3 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)為401.26 Mb，經(jīng)過測(cè)序深度為4X、Miss0.2、次要等位基因頻率（MAF）＞0.01的篩選條件過濾，最后共獲得了114 200個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)。主成分分析結(jié)果顯示240份寬皮柑橘被分為4大類，其中溫州蜜柑亞群、野生寬皮柑橘亞群可明顯區(qū)分于其他寬皮柑橘。利用系統(tǒng)演化樹可將240份寬皮柑橘劃分到11個(gè)類群中。系統(tǒng)演化樹和主成分分析都揭示了不同地理來源和特定形態(tài)的寬皮柑橘在遺傳水平上存在明顯的差異，比如來源于日本的溫州蜜柑、歐美的克里曼丁橘及其雜種后代，以及中國(guó)南方的野生寬皮柑橘由于地理分布不同而形成了較為獨(dú)特的類型，彼此間能夠相互區(qū)分開。進(jìn)化樹結(jié)果表明中國(guó)南、北不同地域的寬皮柑橘可能存在不同的演化路徑，南嶺山脈及南方地區(qū)的野生寬皮柑橘、酸橘和目前南方地區(qū)栽培的砂糖橘存在較近的起源演化聯(lián)系，而北方寬皮柑橘的演化卻與寬皮柑橘中的古老地方品種存在緊密聯(lián)系。人工雜交育種、長(zhǎng)期的人工選擇和馴化形成了不同類型的寬皮柑橘，同時(shí)也導(dǎo)致寬皮柑橘遺傳多樣性的增加。另外，一些寬皮柑橘資源中的可疑親本也通過GBS技術(shù)得以準(zhǔn)確鑒定。本研究表明沃柑與金諾橘有較近的親緣關(guān)系。【結(jié)論】GBS技術(shù)用于柑橘種質(zhì)資源的基因分型高效可靠，建立的系統(tǒng)演化樹可以對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行準(zhǔn)確劃分，與用植物形態(tài)學(xué)劃分的結(jié)果高度吻合。另外，GBS技術(shù)用于資源材料的準(zhǔn)確鑒定和親緣關(guān)系的研究，可為柑橘植物新品種權(quán)的保護(hù)提供可靠的技術(shù)支撐。

GBS；寬皮柑橘；系統(tǒng)演化；品種鑒定

0 引言

【研究意義】中國(guó)是世界寬皮柑橘的起源中心，寬皮柑橘種類豐富多樣，至今仍有野生寬皮柑橘的分布[1]，這為研究寬皮柑橘的起源和演化提供了重要材料?，F(xiàn)有的研究表明寬皮柑橘是柑橘屬下的基本種之一，但由于寬皮柑橘與柑橘屬下的其他種易發(fā)生種間雜交，導(dǎo)致其種類繁多，不僅增加了鑒定難度，其亞種或類群的劃分一直以來也存在較大的爭(zhēng)議[2]。通過基因分型對(duì)寬皮柑橘種質(zhì)進(jìn)行甄別和鑒定不僅是資源收集、保存、評(píng)價(jià)和利用的基本要求，也為寬皮柑橘品種類群的劃分、起源演化的研究、柑橘植物新品種權(quán)的保護(hù)和認(rèn)定提供更加科學(xué)、充分的依據(jù)。在長(zhǎng)期的栽培、馴化歷史過程中，來源于不同地域的寬皮柑橘可能保留了明顯的具有地域特征的遺傳差異。因此，對(duì)不同地理來源的寬皮柑橘進(jìn)行遺傳多樣性研究，有助于了解這些材料的遺傳背景，從而為寬皮柑橘的育種提供可利用的基因資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)寬皮柑橘種質(zhì)的鑒定除利用植物形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分辨外，也采用分子標(biāo)記技術(shù)[3-4]和基因測(cè)序技術(shù)[5]。儲(chǔ)春榮等[3]利用SSR、Indel等分子標(biāo)記證實(shí)了蘇州地區(qū)的黃皮橘、朱紅橘是兩類重要且較為古老的橘類資源，長(zhǎng)江上游流域的紅橘是與朱紅橘不同的另一古老橘類品種；高恒錦等[4]利用類似的方法證實(shí)了起源于中國(guó)南嶺山脈的野生寬皮柑橘是一類獨(dú)特的原始野生寬皮柑橘類型，表明原始野生柑橘可能是寬皮柑橘中的初生種。WU等[5]通過對(duì)柑橘全基因組進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)克里曼丁的基因組中有柚類基因的滲入，而來自中國(guó)的 1份野生寬皮柑橘與其他寬皮柑橘存在明顯的遺傳差異。近來隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因分型的成本持續(xù)降低，GBS技術(shù)作為第二代深度測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，通過采用酶切加標(biāo)簽的方法，使多樣本高通量平行測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)[6-7]。這不僅大大降低了基因測(cè)序的成本，也使對(duì)大樣本全基因組的基因分型成為可能，對(duì)深入了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化具有重要意義[8-10]。同時(shí)GBS獲得的短讀序列可通過有參或無參基因組的形式進(jìn)行拼接組裝，進(jìn)而獲得高密度的SNP標(biāo)記，利用這些SNP標(biāo)記或者開發(fā)的bin標(biāo)記可進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建[11-12]、遺傳圖譜加密[13-15]、全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）[16-18]及基因組的輔助組裝等研究。目前GBS技術(shù)作為基因分型的重要手段，已經(jīng)在遺傳圖譜構(gòu)建[11-12,19-20]、遺傳選擇[10]、基因多樣性研究[21-23]、種質(zhì)鑒定[24-25]及品種識(shí)別[26-27]等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。【本研究切入點(diǎn)】寬皮柑橘中的古老地方品種、野生資源在中國(guó)極其豐富，但國(guó)外對(duì)這些資源的研究很少涉及，因此，中國(guó)的野生和地方寬皮柑橘品種的遺傳多樣性值得深入研究?；贕BS技術(shù)的低成本、高通量和不依賴參考基因組等特點(diǎn)[28]，將其用于寬皮柑橘種質(zhì)資源的基因分型是可行的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用 GBS技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘的野生資源、地方品種以及國(guó)內(nèi)外培育的雜種材料進(jìn)行基因分型，通過系統(tǒng)演化和遺傳多樣性分析，以闡明這些寬皮柑橘的遺傳背景及起源和演化。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的240份寬皮柑橘材料均采自國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑橘資源圃，這些寬皮柑橘種質(zhì)來自于不同時(shí)期、不同地區(qū)的資源收集活動(dòng)，包括起源于中國(guó)南方地區(qū)的野生寬皮柑橘15份，地方品種77份，選育品種140份，遺傳材料8份。在選育品種中包括有清見雜種材料11份，愛媛30號(hào)及愛媛28號(hào)雜種材料19份。這240份寬皮柑橘材料中來源于日本的溫州蜜柑有40份，來源于歐美的寬皮柑橘材料32份，尼泊爾材料5份，其余為國(guó)內(nèi)材料，具體材料名單見電子版附表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和GBS文庫(kù)構(gòu)建 2016年春季采集所有寬皮柑橘資源的嫩葉，利用植物基因組DNA提取試劑盒（Magen HiPure Plant DNA Mini Kit，Guangzhou，China）提取DNA。提取的樣品DNA送諾禾致源進(jìn)行DNA質(zhì)檢、建庫(kù)和測(cè)序，利用Qubit? 2.0熒光測(cè)定計(jì)（Invitrogen，Carlsbad，USA）檢測(cè)核酸濃度，同時(shí)在1%的瓊脂糖凝膠上100 V電泳40 min檢測(cè)DNA純度，高質(zhì)量的DNA用于GBS文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。每個(gè)樣本取1.5 μg DNA用于文庫(kù)構(gòu)建，首先應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)基因組進(jìn)行酶切，酶切后的片段兩端利用T4 DNA連接酶（NEB）加上適配體接頭，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)樣品進(jìn)行混合，電泳回收350—400 bp區(qū)間的DNA條帶，割取的片段進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物用于測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)在Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行雙末端150 bp的測(cè)序。GBS分析的重復(fù)性、可靠性檢測(cè)使用電子版附表1中56號(hào)（1-1）、57號(hào)（專有橘）和58號(hào)（1-2）3份種質(zhì)材料作為生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（SNP）鑒定 每條測(cè)序數(shù)據(jù)按照條碼劃分到對(duì)應(yīng)的樣本中，對(duì)每條序列進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控篩選，去除原始測(cè)序序列中的接頭序列和低質(zhì)量的短讀序列，包括單端測(cè)序中含有的N數(shù)量超過該條序列長(zhǎng)度的10%，或者單端測(cè)序中低質(zhì)量（Q≤5）堿基數(shù)超過該條序列長(zhǎng)度50%的序列。剩下的高質(zhì)量序列采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序?qū)⑵淦ヅ涞娇死锫⒖蓟蚪M上（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih. gov/genomes/all/GCF_000493195.1_Citrus_clementina_ v1.0）。SNP檢測(cè)采用Samtools軟件進(jìn)行，對(duì)齊的匹配文件用Samtools軟件轉(zhuǎn)換為BAM文件后進(jìn)行變異調(diào)用，Samtools收集BAM文件中的匯總信息，計(jì)算可能基因型的似然值，再利用Bcftools應(yīng)用先驗(yàn)值進(jìn)行變異調(diào)用，采用貝葉斯模型檢測(cè)群體中的多態(tài)性位點(diǎn)獲得VCFs文件。

1.2.3 群體進(jìn)化樹分析 采用SNP基因分型數(shù)據(jù)估測(cè)240份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化，根據(jù)群體遺傳學(xué)特征的共同點(diǎn)或差異推斷出它們的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。利用個(gè)體SNPs的檢測(cè)值計(jì)算群體間的遺傳距離。兩個(gè)個(gè)體i和j之間的p-距離通過如下公式計(jì)算：

式中，L表示高質(zhì)量SNPs區(qū)域長(zhǎng)度，dij表示兩個(gè)個(gè)體為不同基因型值的賦值表。運(yùn)用 TreeBest（http:// treesoft.sourceforge.net/treebest.shtml）軟件計(jì)算距離矩陣，以此為基礎(chǔ)，通過鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。引導(dǎo)值（bootstrap values）經(jīng)過達(dá)1 000次計(jì)算獲得。

1.2.4 主成分分析 通過GCTA（http://cnsgenomics. com/software/gcta/pca.html）軟件計(jì)算特征向量以及特征值，并利用R軟件繪制PCA分布圖。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序質(zhì)量

GBS測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，240個(gè)寬皮柑橘樣本的總測(cè)序數(shù)據(jù)量為96.31 Gb，去除低質(zhì)量的序列后，產(chǎn)生的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為96.3 Gb，平均每個(gè)樣本數(shù)據(jù)量為401.26 Mb。測(cè)序質(zhì)量較高（Q20≥93.78%、Q30≥85.19%），GC分布正常，群體樣本與克里曼丁參考基因組的平均比對(duì)率為93.79%，表明本試驗(yàn)的樣本與參考基因組克里曼丁有較高的相似性。序列平均覆蓋度為17.82%（至少有一個(gè)堿基的覆蓋），至少有4個(gè)堿基的平均覆蓋度為8.60%。利用Samtools軟件檢測(cè)后共獲得765 252個(gè)SNP位點(diǎn)，經(jīng)過條件為測(cè)序深度4×、Miss0.2、次要等位基因頻率（MAF）＞0.01的過濾后，最后共獲得114 200個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)用于群體進(jìn)化樹分析。

2.2 主成分分析

本研究選擇的 240份寬皮柑橘涵蓋了寬皮柑橘中的大部分類型，利用PCA分析方法對(duì)240份寬皮柑橘材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，根據(jù)第一主成分和第二主成分可將240份寬皮柑橘分為4個(gè)亞群，分別為類群Ⅰ（溫州蜜柑亞群，包括溫州蜜柑、早熟蜜橘和諾瓦橘），類群Ⅱ（野生寬皮柑橘亞群，包括細(xì)皮狗屎柑、大坑野橘、聶都野橘、莽山橘、粗皮狗屎柑、道縣野橘），類群Ⅲ（包括大浦、早香和橘橙22-53），類群Ⅳ（其余寬皮柑橘及其雜種品種，包括酸橘、年橘、椪柑、紅橘、朱紅橘、地中海橘、早橘、橘橙或橘柚雜種、清見雜種、克里曼丁橘等）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 240份寬皮柑橘的主成分分析圖Fig. 1 The principal component analysis of 240 mandarins

2.3 群體進(jìn)化樹分析

群體進(jìn)化樹的結(jié)果表明，240份寬皮柑橘種質(zhì)聚為一個(gè)大類，支持寬皮柑橘是柑橘屬下一個(gè)基本種的說法。來源于不同地理區(qū)域的寬皮柑橘在遺傳上存在明顯的差異，比如來源于日本的溫州蜜柑、來源于歐美的克里曼丁橘及其雜種與中國(guó)的絕大部分寬皮柑橘品種間存在明顯的遺傳差異，表明地理來源的不同可能是引起寬皮柑橘遺傳差異的重要原因之一。根據(jù)進(jìn)化樹對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)一步細(xì)分后，可將這些材料劃分到11個(gè)寬皮柑橘亞群中（具體分類亞群見電子版附表1），這11個(gè)亞群分別是野生寬皮柑橘及其衍化種（類群Ⅰ，包括小果類型的酸橘、粗皮狗屎柑、大坑野橘、道縣野橘、莽山橘、聶都野橘、年橘、砂糖橘、八月橘、馬水橘、青皮蜜橘等），古老栽培品種（類群Ⅱ，包括土橘、建柑、椪柑、紅橘、地中海橘、槾橘等），朱紅橘（類群Ⅲ，包括朱紅橘、南橘、料紅、南豐蜜橘等），早橘（類群Ⅳ，包括本地早、城固冰糖橘、旺蒼皺皮柑、克里曼丁×本地早雜種等），歐美橘橙雜種（類群Ⅴ，包括王柑、默科特、恩科爾、麗紅、金諾、無核沃柑等），橘柚雜種（類群Ⅵ，包括明尼奧拉、清峰、漢源黃果柑、湘慈43號(hào)等），清見×椪柑雜種群（類群Ⅶ），愛媛系列雜種（類群Ⅷ，包括愛媛28號(hào)雜種、愛媛30號(hào)雜種），克里曼丁橘類（類群Ⅸ，主要為克里曼丁橘及其雜種后代，如費(fèi)爾柴爾德、弗來蒙特橘、秋輝、帕森橘等以及其他類型雜種），溫州蜜柑（類群Ⅹ），清見雜種（類群Ⅺ，清見，清見與天草的雜交種，清見與明尼奧拉的雜交種）。進(jìn)化樹的分類結(jié)果與利用植物形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果是高度吻合的。

2.3.1 系統(tǒng)演化 從群體進(jìn)化樹的結(jié)果來看，中國(guó)南、北不同地域的寬皮柑橘可能存在不同的演化路徑。來源于南嶺山脈及南方地區(qū)的野生寬皮柑橘、寬皮柑橘中小果類型的酸橘、華南地區(qū)廣泛種植的砂糖橘、八月橘、馬水橘、青皮蜜橘等存在較近的親緣關(guān)系，這些材料在地理分布上也主要位于華南地區(qū)，而分布于長(zhǎng)江下游流域的小果寬皮柑橘中的乳橘類型，如南豐蜜橘、東華蜜橘卻與朱紅橘有較近的親緣關(guān)系，而小果類中的本地早卻與古老寬皮柑橘中的旺蒼皺皮柑有較近的親緣關(guān)系。結(jié)合這些品種的地理分布，推測(cè)南方地區(qū)栽植的砂糖橘等類型可能是從小果類的野生寬皮柑橘演化為酸橘后，再由其演化為現(xiàn)代栽培寬皮柑橘品種。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)的紅橘和北方橘區(qū)的朱紅橘之間也存在明顯的差異，這表明即便都是紅皮橘類型，南北地理氣候差異也造成了兩個(gè)不同的類群。另外從進(jìn)化樹上看，中國(guó)古老栽培品種旺蒼皺皮柑與城固冰糖橘遺傳距離較近，兩者有明顯的親緣關(guān)系，并且可能是本地早的早期親本來源之一，說明中國(guó)北方寬皮柑橘的演化有原始古老柑類品種的參與。來源于歐洲地中海地區(qū)的柳葉橘（阿凡娜橘）也形成了古老栽培品種中較為明顯的一個(gè)分支，與來源于東亞地區(qū)的土橘、椪柑、紅橘、朱紅橘等彼此分開，進(jìn)一步證實(shí)了不同地理來源的品種間存在較明顯的遺傳差距。

圖2 240份寬皮柑橘群體進(jìn)化樹Fig. 2 The phylogenetic tree of 240 mandarins

2.3.2 遺傳多樣性 從群體進(jìn)化樹的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，寬皮柑橘與柑橘屬其他種的種間雜交，會(huì)造成遺傳多樣性的增加，進(jìn)而形成獨(dú)特的亞群。比如來源于歐美的王柑、默科特等品種形成一個(gè)獨(dú)特的亞群，這些品種多數(shù)來源于橘橙品種間的天然雜種，由于具有橙類的遺傳基因，因此這個(gè)亞群的品種多數(shù)具有果皮硬、成熟晚等特點(diǎn)。而一些遺傳背景更為復(fù)雜的橘橙或橘柚雜種則形成了新的亞群，如清峰、湘慈43、漢源黃果柑等。通過人工雜交獲得的雜種后代也會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性的增加，而人工選擇的偏好性使具有相似特征的品種形成新的品種亞群，比如清見與不同椪柑品種的雜交后代形成了一個(gè)新的亞群（圖2中的類群Ⅶ），這些材料在遺傳距離上與椪柑相距較遠(yuǎn)；而愛媛 30號(hào)、愛媛28號(hào)人工雜交后代也形成了新的分支，但這些雜種后代與母本愛媛30號(hào)、愛媛28號(hào)的遺傳距離相對(duì)較近。來源于歐美的克里曼丁橘及其雜種后代在進(jìn)化樹上也形成了一個(gè)明顯的分支，表明克里曼丁橘應(yīng)是一個(gè)遺傳背景較為復(fù)雜的寬皮柑橘類型，其參與了許多現(xiàn)代寬皮柑橘品種的形成，如費(fèi)爾柴爾德、弗來蒙特橘、福瓊橘、凱旋柑、秋輝、苔絲、南香等品種中都具有該品種的基因滲入。

2.3.3 未知親本材料的鑒定 GBS技術(shù)不僅對(duì)研究寬皮柑橘的親緣關(guān)系具有重要價(jià)值，同時(shí)也為未知材料親本的鑒定提供了重要線索。在本研究中加入的56號(hào)（1-1）和58號(hào)（1-2）兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，其聚類結(jié)果顯示兩份重復(fù)材料均能聚在一起，表明通過 GBS得到的SNP數(shù)據(jù)和最后的分類結(jié)果均是穩(wěn)定可靠的。并且56號(hào)和58號(hào)兩份材料與愛媛28號(hào)和天草的遺傳距離都很近，這兩份材料本身來源于愛媛28號(hào)的雜交后代，而愛媛28號(hào)又是天草和南香的雜交后代，由此可見，利用GBS數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確推導(dǎo)出這些材料的直接親本。另外，本研究也對(duì)沃柑的親本進(jìn)行了探索，以往沃柑被認(rèn)為是坦普爾和丹西紅橘的雜種后代[29]，但根據(jù)葉片、果實(shí)等形態(tài)的鑒定結(jié)果表明沃柑不像是從丹西紅橘衍生而來。本研究利用GBS技術(shù)發(fā)現(xiàn)沃柑與金諾的親緣關(guān)系十分密切，遺傳距離遠(yuǎn)低于金諾與韋爾金的遺傳距離，而金諾和韋爾金屬于姊妹系，都是王柑和柳葉橘的雜交后代，因此，沃柑極有可能是王柑和柳葉橘的雜種后代，或者就是金諾的雜交后代。這與國(guó)外的報(bào)道是一致的，根據(jù)第12屆國(guó)際柑橘學(xué)會(huì)會(huì)議報(bào)道，利用SSR技術(shù)也證明了沃柑是金諾的雜交后代[30]。

同時(shí) GBS技術(shù)對(duì)了解種質(zhì)材料的遺傳背景具有重要意義。盛田溫州蜜柑具有果皮極光滑、不易浮皮等特點(diǎn)，以往被認(rèn)為是宮川溫州蜜柑的早生芽變材料，但從本研究結(jié)果來看盛田溫州蜜柑與宮川溫州蜜柑的遺傳距離較遠(yuǎn)，不像是宮川溫州蜜柑的芽變材料，極有可能是種子的實(shí)生繁殖后代。而大浦溫州蜜柑以往被認(rèn)為是山崎早生溫州蜜柑芽變而來，但研究結(jié)果表明本試驗(yàn)的大浦溫州蜜柑材料應(yīng)為雜種來源，其芽變來源的可能性較小。

3 討論

中國(guó)是世界寬皮柑橘的起源演化中心，野生寬皮柑橘類型多樣，道縣野橘的發(fā)現(xiàn)表明南嶺山脈是南方寬皮柑橘的起源中心[4,31]，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明野生寬皮柑橘與南方地區(qū)的酸橘存在緊密聯(lián)系，可能從其中演化出了酸橘，進(jìn)而再演化出了砂糖橘、馬水橘等現(xiàn)代栽培的寬皮柑橘品種。

寬皮柑橘由于栽培歷史久遠(yuǎn)、地理分布廣泛、種間易發(fā)生雜交，因而遺傳類型極其多樣，對(duì)其劃分存在諸多爭(zhēng)議。美國(guó)的斯文格認(rèn)為寬皮柑橘僅僅是柑橘屬下的一個(gè)基本種[32]，日本的田中長(zhǎng)三郎將寬皮柑橘對(duì)應(yīng)的蜜柑區(qū)進(jìn)行了較為細(xì)致的劃分，包括5個(gè)亞區(qū)共 36個(gè)種[33]，而中國(guó)的曾勉教授根據(jù)植物學(xué)特性結(jié)合地理分布將寬皮柑橘分為柑和橘兩個(gè)亞區(qū)[34]，認(rèn)為柑亞區(qū)為雜種起源?，F(xiàn)代分子生物學(xué)證據(jù)已經(jīng)表明，寬皮柑橘是柑橘屬下的一個(gè)基本種[35]，本研究支持該結(jié)論。從240份寬皮柑橘的群體進(jìn)化樹分析來看，將寬皮柑橘劃分為一個(gè)種是合理的，但如何對(duì)諸多的寬皮柑橘資源進(jìn)行有效管理，開展更細(xì)致的劃分也是必要的。本研究中的系統(tǒng)演化和主成分分析都表明，溫州蜜柑、野生寬皮柑橘、椪柑、克里曼丁橘彼此間存在明顯的遺傳差異，溫州蜜柑、克里曼丁橘是具有明顯雜種來源的寬皮柑橘類型，而椪柑是一個(gè)栽培寬皮柑橘類型，斯文格將其作為寬皮柑橘的代表種是不恰當(dāng)?shù)?，原產(chǎn)中國(guó)南方地區(qū)的原始野生寬皮柑橘才真正具有寬皮柑橘代表種的地位，其可能衍生出了酸橘，進(jìn)而衍生出了現(xiàn)代栽培寬皮柑橘砂糖橘等類型。

利用 GBS技術(shù)對(duì)寬皮柑橘進(jìn)行更細(xì)致的分類研究，與用植物形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果是吻合的，因而傳統(tǒng)的寬皮柑橘按照植物學(xué)特征進(jìn)行分類劃分具有一定的合理性[36]，比如本研究中的酸橘、椪柑、紅橘、朱紅橘、地中海橘、克里曼丁橘等亞群都能準(zhǔn)確地得以劃分。但由于寬皮柑橘與橙類、柚類的種間雜交易于發(fā)生，新的種間雜交還將不斷促進(jìn)新類型的產(chǎn)生，因此，利用 GBS技術(shù)對(duì)柑橘資源進(jìn)行基因分型有助于材料的準(zhǔn)確劃分和科學(xué)管理。

GBS研究結(jié)果還表明，地理隔離、雜交育種、人工選擇是造成資源特異性和多樣性的內(nèi)在動(dòng)力，來源于不同地理區(qū)域的資源材料往往會(huì)帶有明顯的遺傳印記，這與育種習(xí)慣、人工選擇的偏好性有一定關(guān)系。人工的長(zhǎng)期栽培和選擇使得一些品種群形成明顯類群，如椪柑、紅橘、朱紅橘、地中海橘、克里曼丁橘等栽培品種都形成了明顯的亞群。同時(shí)骨干親本在育種中的應(yīng)用也促進(jìn)了品種群的形成，比如歐美地區(qū)常利用王柑、默科特等為骨干親本開展雜交，其后代品種往往具有晚熟、皮較硬的特征；而東亞地區(qū)的日本、韓國(guó)等常采用清見和椪柑進(jìn)行雜交，獲得一些肉質(zhì)細(xì)嫩化渣、高糖的品種，進(jìn)而形成了有明顯遺傳特征的亞群。這些都在本研究中得到充分的證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究利用GBS技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘資源進(jìn)行了簡(jiǎn)化基因組的基因分型，建立的系統(tǒng)演化樹可以準(zhǔn)確地對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行劃分，其結(jié)果與用植物形態(tài)學(xué)的劃分結(jié)果存在高度吻合，表明GBS技術(shù)可高效用于資源材料的準(zhǔn)確鑒定和親緣關(guān)系的研究，可作為資源材料分子鑒定的重要手段?；贕BS技術(shù)具有高通量、低成本等特點(diǎn)，今后可用GBS技術(shù)建立涵蓋所有在圃柑橘種質(zhì)資源的簡(jiǎn)化基因組的基因分型數(shù)據(jù)，為今后品種的鑒別和品種權(quán)保護(hù)提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Study on Phylogeny of 240 Mandarin Accessions with Genotyping-by-Sequencing Technology

WANG XiaoKe1, JIANG Dong1,2, SUN ZhenZhu1
(1Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

【Objective】Genotyping-by-sequencing (GBS) is an economic technique to discover SNP and genotype myriad of crop germplasms in an effective way. The aim of this study is to clarify the classification and evolution of 240 mandarin germplasms by using GBS. 【Method】 A total of 240 mandarin germplasms conserved in the National Citrus Germplasm Repository in Chongqing, with widely genetic diversity and geographic origin, were selected as trial materials. GBS library was constructed withgenomic DNAs after digested with EcoR I restriction endonuclease and sequenced on Illumina HiSeq PE150, then the sequences were mapped to the clementine (Citrus clementina hort. ex Tanaka) reference genome by using BWA, and SNPs were called with the SAMTOOLS pipeline. With the SNPs genotyping data, a phylogenetic tree was built by using Neighbor-joining method and a principal component analysis (PCA) was carried out. 【Result】By using GBS, a total of 96.3 Gb of sequences were generated from the 240 mandarin germplasms, and each sample produced 401.26 Mb in average. After screening with parameter of dp4, miss0.2 and minor alleles frequency (MAF)＞0.01, a total of high quality 114 200 SNP sites were retained. The PCA analysis showed that the 240 mandarin germplasms could be divided into 4 groups, in which satsuma sub-group and wild mandarin sub-group could be clearly separated from other mandarin accessions. With phylogenetic analysis, the 240 mandarin germplasms could be divided into 11 groups. Both the phylogenetic analysis and PCA suggested that the genetic variations were presented in mandarin germplasms with different geographical origins and morphological characteristics. For example, satsuma mandarin (Citrus unshiu Macf.) derived from Japan, clementine (Citrus clementina Hort.ex. Tanaka) and its offspring from Europe and America, as well as wild mandarins from China could be clearly distinguished based on phylogenetic tree, moreover the phylogenetic tree showed that the mandarin germplasms derived from the Southern and Northern of China have unique evolutionary route. The wild mandarins distributed in Nanling Mountain and southern China have a closer phylogenetic relationship with sour mandarin (Citrus sunki Hort.ex Tanaka) and Shatangju mandarin, which are widely cultivated in southern China nowadays, whereas the evolution of mandarins in the northern of China were related to some primitive and old cultivars. In addition, hybrid breeding, long-term artificial selection and domestication led to the subdivision formation and increased the genetic diversity of mandarin. Besides, results of this study showed that GBS has a potential advantage to identify some mandarin accessions with suspicious parents. For example, the phylogenetic tree clearly shows that “Or” tangor has a very close relationship with Kinnow mandarin. 【Conclusion】GBS technology provides an effective and high feasible approach to assistant the taxonomic classification of 240 mandarin accessions, the classification results are in accordance with the conclusion based on morphological method. Meanwhile GBS also is a powerful tool for germplasm identification, and can be applied in the new cultivars identification and intellectual property protection.

GBS; mandarin; phylogenetic evolution; germplasm identification

2016-11-16；接受日期：2017-02-10

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAD01B04）、重慶市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2016shms-ztzx80004）

聯(lián)系方式：王小柯，Tel：18375638987；E-mail：wangxiaoke9191@163.com。通信作者江東，Tel：13983194771；E-mail：jiangdong@cric.cn