查倩，奚曉軍，蔣愛麗，田益華

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403）

高溫脅迫對葡萄高溫相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

查倩，奚曉軍，蔣愛麗，田益華

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403）

【目的】適宜的溫度是葡萄生長發(fā)育的必要條件，南方地區(qū)葡萄在成熟期常常經(jīng)歷連續(xù)高溫環(huán)境，葉片容易失水干枯，果實會發(fā)生明顯的日灼，嚴(yán)重地影響了其經(jīng)濟(jì)效益。選擇不同樹齡葡萄樹進(jìn)行高溫脅迫的相關(guān)研究，以解釋高溫對葡萄的傷害，為生產(chǎn)中高溫逆境的抵御措施提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x擇南方地區(qū)常見的鮮食葡萄品種‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申玉’‘申豐’‘申華’和‘滬培1號’為試驗材料，其中葡萄幼苗選擇長勢基本一致的1年生扦插苗移至人工氣候培養(yǎng)箱，在可控條件下培養(yǎng)7 d后于每天10∶ 00—16∶00（模擬夏季高溫發(fā)生時段）進(jìn)行不同溫度處理（25℃、35℃、45℃），觀察處理后0、3、6和150 h高溫應(yīng)答反應(yīng)；葡萄成年樹選擇6年生樹為試驗材料，在2015年夏季觀測到2個處理點分別為：“37℃”處理（2015年7月23日13∶ 00 h最高氣溫為37℃）和“42℃”處理（2015年7月31日13∶ 00 h最高氣溫為42℃），觀察以上處理的8個不同葡萄品種在高溫脅迫下葉片表型變化，對抗逆基因（HSFA2、GLOS1、HSP70、HSP17.9）和HSP21蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】‘申玉’‘夏黑’和‘申華’在高溫發(fā)生初期，頂部新梢和老葉有失水，并在150 h時有所恢復(fù)；‘巨峰’和‘巨玫瑰’葉片在高溫發(fā)生3 h時輕微失水，6 h時大面積失水，‘申豐’‘滬培1號’‘醉金香’葉片在高溫發(fā)生3 h時大面積失水，6 h時整株干枯。同時對葡萄幼苗和成年樹的抗逆基因的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：不同溫度處理（35℃/45℃/“42℃”）下不同葡萄品種的抗逆基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，但是表達(dá)豐度有所不同，表現(xiàn)為溫度水平越高，基因的上調(diào)倍數(shù)越大。另外，‘申玉’‘申華’‘醉金香’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的GLOS1、HSFA2和‘申玉’‘申華’‘夏黑’和‘巨峰’HSP70表達(dá)在長期高溫處理后恢復(fù)至原初水平；并觀察到HSP17.9在高溫發(fā)生后上調(diào)表達(dá)，但并未因為時間的延長而減弱表達(dá)倍數(shù)。高溫處理（45℃/“42℃”）會誘導(dǎo)葡萄幼苗和成年樹的HSP21蛋白水平，但是在一些品種（‘醉金香’和‘申豐’）中HSP21蛋白表達(dá)量有所減少?！窘Y(jié)論】不同葡萄品種對高溫的耐性有差異，其中‘申玉’‘申華’和‘夏黑’抗性最強(qiáng)，而‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’屬于抗性較弱的葡萄品種。樹齡和高溫發(fā)生方式是影響葡萄幼苗和成年樹的抗逆基因和蛋白表達(dá)差異的主要因素。

葡萄；高溫脅迫；抗逆基因；HSP21

0 引言

【研究意義】隨著全球氣候變暖，日益加劇的高溫環(huán)境嚴(yán)重地影響葡萄的生長和發(fā)育，表現(xiàn)為葉片卷曲失水干枯，果實容易發(fā)生日灼，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。其中南方多個葡萄生長地區(qū)已發(fā)生40℃以上的極端高溫天氣[2]。因此，研究葡萄高溫逆境應(yīng)答機(jī)制，對于生產(chǎn)上葡萄栽培指導(dǎo)和優(yōu)系選育提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高溫環(huán)境影響了葡萄的一系列生理生化和分子生物學(xué)過程，近年來抗逆基因和蛋白的研究頗為熱門。熱激蛋白HSP（Heat Shock Protein）是植物受高溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類應(yīng)答蛋白，作為分子伴侶蛋白，它以幫助其他的多肽折疊、組裝或者轉(zhuǎn)移，但其本身不可以形成蛋白質(zhì)，所以HSP蛋白可以組織受損蛋白積累，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)平衡，從而減少高溫傷害[3-4]。熱激蛋白 HSP家族包括 HSP100907060和一些sHSPs（Small Heat Shock Protein，分子大小為15—40 kDa）對植物的抗逆性發(fā)揮了重要作用[5-6]，作用于高溫、干旱、鹽脅迫等，其中研究熱門的HSP21蛋白，屬于sHSPs，受高溫脅迫誘導(dǎo)增多[7]，并參與保護(hù)植物葉片的PS II光化學(xué)反應(yīng)，有效地增強(qiáng)植物耐熱能力[8-9]。植物的轉(zhuǎn)錄因子HSF（Heat Stress Factor）是通過結(jié)合 HSP啟動子上的熱激元件，從而促進(jìn) HSP的表達(dá)，HSF家族成員龐大，根據(jù)低聚物結(jié)構(gòu)域的特點可為3大類ABC，家族龐大。在中國白梨轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中已發(fā)現(xiàn)137個HSF轉(zhuǎn)錄因子；蘆柑中克隆到18個HSF成員，其中有7個轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答高溫；蘋果和番木瓜等果樹上也發(fā)現(xiàn)這個關(guān)鍵調(diào)控因子HSF，與高溫脅迫密切相關(guān)[10-13]。單個過表達(dá)HSF或HSP轉(zhuǎn)基因植物耐熱能力并未提升，證明HSF通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控HSP蛋白的表達(dá)[14]。其中A類轉(zhuǎn)錄因子HSFA2與高溫脅迫密切相關(guān)，已在葡萄上克隆到轉(zhuǎn)錄因子 HSFA2和一個與肌醇半乳糖苷合成相關(guān)的基因GLOS1（Galactinol Synthesis），均發(fā)現(xiàn)在高溫處理下呈上調(diào)表達(dá)，且熱響應(yīng)因子 HSFA2反式激活GLOS1的啟動子[15]，進(jìn)一步證明HSFA2轉(zhuǎn)錄因子在高溫中的重要作用。以上所述抗逆基因均已證明在高溫逆境下起著一定的調(diào)控作用，這些研究結(jié)果對分析葡萄的高溫應(yīng)答反應(yīng)有著重要的意義，為理解葡萄的高溫適應(yīng)過程和后期指導(dǎo)提供理論基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】綜上可知葡萄高溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)的研究較為熱門，但大多研究僅僅針對人工可控條件下葡萄幼苗的高溫應(yīng)答反應(yīng)，尚缺少研究高溫脅迫下葡萄幼苗和成年樹的抗逆基因和蛋白的抗逆應(yīng)答過程。【擬解決的關(guān)鍵問題】對1年生葡萄苗進(jìn)行人工可控條件下的不同溫度處理，對6年生成年樹進(jìn)行田間高溫觀察，分析高溫逆境發(fā)生后不同葡萄品種抗逆基因和蛋白的表達(dá)差異。綜合分析不同樹齡的葡萄樹高溫脅迫應(yīng)答差異，為葡萄生產(chǎn)中果實成熟階段的自然高溫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2015年在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗站（30°89′ N，121°39′ E）進(jìn)行。

1.1 試驗材料與處理

以1年生盆栽葡萄幼苗‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申玉’‘申豐’‘申華’和‘滬培1號’為試驗材料，種植于塑料盆中，塑料盆大小為半徑15 cm，高40 cm；椰糠﹕腐殖土=1﹕1。智能人工氣候培養(yǎng)箱（杭州錢江儀器設(shè)備有限公司）的可控條件為白/夜為14 h/10 h，溫度為（25±1）℃/（20±1）℃，相對濕度為 65%—70%，光合有效輻射為 100 μmol·m-2·s-1。選擇生長一致的植株（具有15—20片功能葉）設(shè)置3個溫度處理，分別為25℃、35℃、45℃，處理時間段為10：00—16：00 h（模擬夏季高溫發(fā)生時段），其他時間段溫度保持（25±1）℃/（20±1）℃（白/夜）。每個處理5株葡萄，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)前期試驗發(fā)現(xiàn)8個葡萄品種中，一些品種在45℃處理3 h時有萎蔫現(xiàn)象，一些品種在處理6 h時有萎蔫現(xiàn)象，一些品種在處理6 h仍然正常生長，故設(shè)置當(dāng)天處理的13：00（3 h）和16：00（6 h）以及處理6 d后的16：00（150 h）3個取樣時間點，其中150 h時間點的設(shè)置是為了觀察長期高溫對葡萄的影響，取長勢一致的新梢第7—9片功能葉（6片葉片）于液氮速凍保存在-70℃冰箱。

圖1 2015年7月21日至7月31日氣溫觀察Fig. 1 The observation of air temperature on July 21 to July 31

試驗材料為6年生成年樹‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申玉’‘申豐’‘申華’和‘滬培1號’，采用籬架栽培模式，株行距為1.5 m×3.0 m，均采用設(shè)施大棚栽培方式。使用HOBO U23-002 data loggers（Onset Computer Corporation, Cape Cod, MA, USA）對棚內(nèi)溫度進(jìn)行測定，如圖 1所示，7月25日之前日最高溫度低于40℃，在7月25日至7月31日這個時間段每天至少有1個小時的溫度超過40℃（電子版附表1）。所以在本研究中選擇2015年7月23日（“37℃”）和2015年7月31日（“42℃”）為兩個溫度處理點。于當(dāng)天13：00取新展開幼葉（6片葉片）液氮速凍保存在-70℃冰箱。

1.2 抗逆基因表達(dá)分析

總RNA提取方法采用植物總RNA提取試劑盒（Omega，USA），使用1%瓊脂糖電泳檢測純度，并且用NANO DROP2000（Thermo Scientific）確定RNA濃度后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。?1 μg RNA利用PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）（參考操作手冊）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用于后續(xù)試驗。實時熒光定量PCR反應(yīng)是在Roche LightCycler?480II 實時熒光定量 PCR儀上進(jìn)行，使用 SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑（TaKaRa），反應(yīng)體系為20 μL，其中含有SYBR Premix Ex TaqTM（2x）10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，ddH2O 8.4 μL，每個樣品重復(fù)3次。

目的基因為HSFA2、GLOS1、HSP70、HSP17.9，內(nèi)參基因組合為GAPDH和EF1r，引物序列見表1。目的基因相對表達(dá)量計算使用 geNorm軟件[16-17]，選擇對照處理（25℃處理3 h）為參數(shù)，計算其他處理中的基因表達(dá)倍數(shù)，相對比值結(jié)果由 Hem I 1.0軟件繪制[18]。

表1 葡萄目的基因?qū)崟r熒光定量PCR引物序列Table 1 The sequence of primer for target genes in grape

1.3 HSP21蛋白表達(dá)分析

采用SHULTZ等[22]方法提取蛋白質(zhì)，并用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。20 μg提取的蛋白樣品在12% SDS–PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗Anti-HSP21[23]（Abcam，England，1﹕3000），4℃孵育過夜，蒸餾水洗膜3次后加入二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（CST，USA，1﹕1 000）室溫放置1 h，蒸餾水洗膜3次，浸于適量電化學(xué)發(fā)光試劑中1 min，取出后在室溫條件下干燥并用保鮮膜保存，置于暗盒中，壓片曝光。利用 Quantity One軟件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

獲得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，利用SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 高溫處理對葡萄幼苗植株表型的影響

在3個溫度（25℃、35℃、45℃）處理下進(jìn)行幼苗形態(tài)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25℃和35℃下8個品種的幼苗生長狀態(tài)良好，而 45℃處理下葡萄植株生長狀態(tài)就出現(xiàn)了明顯變化（表2），‘申玉’‘申華’和‘夏黑’經(jīng)高溫處理6 h后僅見頂部新梢和下部老葉失水現(xiàn)象，在150 h時得到恢復(fù)；‘巨峰’和‘巨玫瑰’在45℃處理3 h時表現(xiàn)頂部新梢失水，6 h時植株大面積的失水；‘申豐’‘醉金香’‘滬培1號’在高溫處理3 h時表現(xiàn)出大面積失水，并在6 h時整株干枯。因此，不同葡萄品種的幼苗在高溫脅迫下表現(xiàn)不同，其中抗性由強(qiáng)到弱為：‘申玉’‘申華’和‘夏黑’耐熱能力較強(qiáng)；‘巨峰’和‘巨玫瑰’耐熱能力次之；‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’耐熱能力最弱。

圖2 不同溫度處理葡萄高溫相關(guān)基因表達(dá)變化Fig. 2 Relative expression of heat stress related genes in grapevines under different temperature treatments

2.2 高溫逆境對葡萄抗逆基因表達(dá)的影響

本研究以25℃處理3 h時的數(shù)值為基數(shù)，取其他數(shù)據(jù)的相對比值，使用HemI 1.0軟件制作基因表達(dá)熱點圖（圖2）。在不同溫度處理（35℃/45℃）下8個葡萄品種的4個抗逆基因均上調(diào)表達(dá)：其中GLOS1和 HSFA2表達(dá)趨勢相似，表現(xiàn)在‘申玉’‘申華’‘醉金香’‘巨峰’和‘巨玫瑰’中GLOS1和HSFA2在高溫發(fā)生3 h時上調(diào)，隨后在6—150 h恢復(fù)至原初水平，且45℃處理增強(qiáng)趨勢高于35℃處理；‘申豐’的GLOS1和HSFA2在35℃處理增強(qiáng)趨勢高于45℃處理，‘滬培1號’和‘醉金香’的GLOS1和HSFA2在45℃處理3 h時增強(qiáng)趨勢高于35℃處理?！暧瘛疕SP70在3 h時表現(xiàn)出35℃處理增強(qiáng)趨勢高于45℃處理，在高溫后期均恢復(fù)至原初水平；35℃處理下的‘申華’‘夏黑’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的HSP70表達(dá)與25℃處理沒有差異，但是45℃處理下這4個品種均表現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢，其中‘申華’‘夏黑’‘巨峰’HSP70表達(dá)在高溫后期恢復(fù)至原初水平；‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’的HSP70在高溫中均被誘導(dǎo)表達(dá)，其中的差異為基因上調(diào)表達(dá)豐度不同。不同葡萄品種HSP17.9在高溫處理3 h上調(diào)表達(dá)，表達(dá)倍數(shù)在5—10，在高溫發(fā)生后期表達(dá)倍數(shù)并未減弱。

表2 可控條件下不同葡萄幼苗45℃處理萎蔫情況Table 2 The drooping status of different young grapevines at 45℃ treatment under controlled condition

選擇8個葡萄品種在“37℃”和“42℃”的GLOS1、HSFA2、HSP70、HSP17.9表達(dá)變化進(jìn)行分析（圖2），“42℃”處理下葡萄的 GLOS1、HSFA2、HSP70、HSP17.9表達(dá)量普遍較“37℃”處理高，影響這些抗逆基因表達(dá)的主要因子為溫度。而不同品種之間的表達(dá)豐度存在差異，是由于品種之間存在遺傳性差異。

2.3 高溫逆境對葡萄抗逆蛋白HSP21表達(dá)的影響

對 45℃處理后的葡萄幼苗葉片進(jìn)行高溫逆境應(yīng)答蛋白HSP21表達(dá)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種的HSP21蛋白表達(dá)趨勢有差異（圖3）?？篃嵝宰顝?qiáng)的葡萄品種‘申玉’在 45℃處理 6 h時后開始積累蛋白，并在150 h時積累最多；‘申華’隨著45℃處理時間延長，HSP21蛋白積累越多，150 h時HSP21蛋白稍有減少；‘夏黑’在45℃處理3 h時HSP21蛋白有較小幅度的積累，隨后在后期顯著減少積累量；‘巨峰’隨著處理時間的延長，HSP21蛋白積累越多；‘巨玫瑰’在45℃處理3 h時積累較多HSP21蛋白，但是6 h時急劇減少；另外，抗熱能力較弱的葡萄品種‘滬培1號’‘醉金香’和‘申豐’在45℃處理下HSP21蛋白量表現(xiàn)出減少趨勢。

同時對葡萄成年樹的葉片進(jìn)行抗逆蛋白 HSP21的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)（圖3），‘巨峰’‘巨玫瑰’‘申華’‘滬培1號’葉片中在“42℃”處理點積累較多HSP21蛋白。與“37℃”處理點相比，“42℃”處理點HSP21蛋白含量在‘夏黑’和‘申玉’葉片中略有增加，但在‘申豐’和‘醉金香’葉片中呈減弱趨勢，說明品種之間存在差異性，另外，設(shè)施條件下其他復(fù)雜的非生物因素也是 HSP21蛋白在不同葡萄品種中不一致結(jié)果的重要原因之一。

3 討論

植物的高溫抗逆過程極其復(fù)雜，植物感受逆境后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗逆相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)的改變來適應(yīng)不利環(huán)境[24-25]。因此，抗逆基因和蛋白的表達(dá)分析對了解植物高溫抗逆機(jī)制有著十分重要意義。此外，前人研究植物的高溫應(yīng)答過程集中于可控條件，所以研究設(shè)施條件下高溫發(fā)生后葡萄的應(yīng)答反應(yīng)可以為生產(chǎn)上栽培提供更有力的理論依據(jù)。

3.1 高溫逆境下不同葡萄品種的應(yīng)答反應(yīng)

高溫逆境對葡萄的傷害最為直觀的表現(xiàn)為葡萄葉片表現(xiàn)熱害，前人通過石蠟切片觀察到葡萄葉片在遭受高溫處理后葉肉部分先出現(xiàn)小面積的柵欄組織和海綿組織萎焉失水，最終大面積萎焉干枯[26]。本研究發(fā)現(xiàn)一些品種（‘醉金香’‘申豐’‘滬培1號’）在45℃處理3 h時已經(jīng)表現(xiàn)出失水干枯狀態(tài)，但是另一些品種（‘申玉’‘申華’‘夏黑’）在45℃處理150 h（每天高溫處理時間為6 h）仍然有維持正常生長的健康葉片，能夠適應(yīng)脅迫。由上述可知，不同葡萄品種的遺傳背景導(dǎo)致其對抗高溫脅迫的能力有所差異，故葉片萎焉干枯程度表現(xiàn)不同。熱害表現(xiàn)不僅與高溫處理的延續(xù)時間相關(guān)[27-28]，如一些品種（‘巨峰’和‘巨玫瑰’）在45℃處理6 h表現(xiàn)出萎焉現(xiàn)象；而且高溫傷害還與溫度處理的水平值相關(guān)[29]，故推測對‘申玉’‘申華’和‘夏黑’這些品種進(jìn)行更高水平（＞45℃）的溫度處理，才會出現(xiàn)明顯熱害現(xiàn)象。

另外，高溫逆境影響了植物葉片一系列抗逆基因的表達(dá)，具體表現(xiàn)在GLOS1、HSFA2、HSP70、HSP17.9均受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[15,30]。本研究發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種抗逆基因的上調(diào)倍數(shù)存在差異，不同溫度處理（35℃/45℃/“42℃”）下，葡萄葉片的抗逆基因上調(diào)表達(dá)，這是葡萄葉片對高溫脅迫的積極應(yīng)答過程，這與前人的研究結(jié)果一致[31]。但是基因表達(dá)豐度值是與溫度水平值呈正相關(guān)的，45℃處理下這些抗逆基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)顯著高于35℃處理。同樣觀察到高溫處理下抗逆基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較其他兩個高溫處理要小，可能與其他因素有關(guān)，需要進(jìn)一步分析。另外，抗逆基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)與葡萄的耐熱能力（由熱害表現(xiàn)的分類）并沒有表現(xiàn)出一致性，分析原因是單個抗逆基因的上調(diào)表達(dá)不能系統(tǒng)的代表此品種的耐熱能力，所以分析多個抗逆基因的表達(dá)變化顯得尤為必要。

圖3 不同葡萄品種HSP21蛋白表達(dá)量Fig. 3 HSP21 protein levels in different grapevines

抗逆蛋白 HSP21表達(dá)量是植物對逆境反應(yīng)表現(xiàn)的重要指標(biāo)，研究表明HSP21蛋白在高溫逆境下誘導(dǎo)表達(dá)[32]，本試驗結(jié)果得到，極端高溫（“42℃”/45℃）下葡萄葉片的HSP21表達(dá)量的增減與品種有關(guān)，‘申玉’‘申華’品種表達(dá)量明顯增加，而且連續(xù)增加；而‘醉金香’和‘申豐’表現(xiàn)出減少趨勢，可能是‘醉金香’和‘申豐’這些品種的葉片已經(jīng)瀕臨高溫傷害極限，已無力合成有效蛋白用以保護(hù)葉片的正常生理過程。

3.2 葡萄的高溫逆境適應(yīng)機(jī)制

高溫逆境會影響植物分子反應(yīng)，但植物自身會進(jìn)化出一套適應(yīng)機(jī)制應(yīng)對逆境[33-34]，其中表現(xiàn)在抗逆基因和蛋白的表達(dá)等。不同葡萄品種基因表達(dá)表現(xiàn)不一，本研究發(fā)現(xiàn)‘申玉’‘申華’‘夏黑’抗逆基因的表達(dá)在45℃處理6 h時有恢復(fù)趨勢，并在后期（150 h）恢復(fù)至原初水平，說明高溫發(fā)生短期內(nèi)，抗性較強(qiáng)的葡萄會發(fā)生可逆性傷害。前人曾報道短期高溫會增強(qiáng)辣椒等作物對高溫的抵抗能力[35-36]，并推斷其發(fā)生原因是高溫增強(qiáng)了植物的細(xì)胞膜飽和度，并產(chǎn)生一些保護(hù)性的物質(zhì)，比如糖和蛋白質(zhì)等。隨著生理生化和分子反應(yīng)的調(diào)節(jié)，長期高溫影響葉片啟動修復(fù)機(jī)制，從而先激發(fā)抗逆基因的保護(hù)，進(jìn)而形成高溫逆境適應(yīng)機(jī)制。

溫度逆境鍛煉是提高植物抗逆性的一種有效手段。前人研究表明，高溫鍛煉可大大提高多種植物的抗高溫能力，低溫鍛煉可明顯增強(qiáng)植物的抗寒性。本研究中田間設(shè)施條件下的溫度變化是呈梯度上升，在“42℃”高溫逆境發(fā)生時，已經(jīng)感受了次高溫過程（30—37℃），從而增強(qiáng)了適應(yīng)能力，與前人報道結(jié)論相符[37]，逆境馴化能提高植物的抗逆性，說明一個不傷害植株正常生長的高溫處理可以有效地提高葡萄的耐熱抗性[38-39]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)35℃處理可以誘導(dǎo)葡萄抗逆基因表達(dá)，增強(qiáng)葡萄對高溫逆境的適應(yīng)能力。因此判斷溫度馴化能夠增強(qiáng)植物的抗熱能力[40-41]，這也需要進(jìn)一步的深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)設(shè)施條件下高溫發(fā)生與人工可控條件高溫處理之間的抗逆基因和蛋白表達(dá)存在差異，主要是源于兩種條件下高溫發(fā)生方式的差異。其中原因之一是次高溫馴化過程；其次是兩種栽培條件下的葡萄樹勢存在差異性，在可控條件下就環(huán)境和樹齡等各種方面還原田間自然高溫的發(fā)生，為生產(chǎn)提供試驗和理論指導(dǎo)，這也是后續(xù)研究需要琢磨的重點和難點；第三，田間試驗的其他環(huán)境因子為不可控因素，為果樹試驗的主要難點，所以本研究通過兩種條件下葡萄的應(yīng)答反應(yīng)，能更系統(tǒng)全面地闡述不同葡萄品種的高溫應(yīng)答反應(yīng)和適應(yīng)性機(jī)制。研究可控條件下高溫逆境的葡萄應(yīng)答反應(yīng)只能為田間高溫發(fā)生提供一些理論依據(jù)，但是源于田間試驗的特殊性和多因素性，用兩種方式配合研究具有更強(qiáng)的科學(xué)性。

此外，本研究對高溫處理后8個葡萄品種葉片的抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）進(jìn)行了測定（數(shù)據(jù)未提供），發(fā)現(xiàn)生理水平上均有響應(yīng)高溫逆境，但無規(guī)律的變化趨勢，其原因可能是抗氧化系統(tǒng)的復(fù)雜性，說明抗氧化酶活性的變化可能不可以作為評判植物高溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但仍可間接反應(yīng)植物的高溫逆境響應(yīng)機(jī)制。

4 結(jié)論

不同葡萄品種耐熱能力有差異，不僅表現(xiàn)于葡萄熱害表型，還表現(xiàn)于抗逆基因和蛋白的上調(diào)倍數(shù)，這源于不同品種的遺傳背景差異。‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’屬于抗性較弱的葡萄品種；‘申玉’‘申華’和‘夏黑’的幼苗在長期高溫處理后植株表型和抗逆基因表達(dá)能恢復(fù)至初始水平，這3個品種葡萄能通過增強(qiáng)脅迫適應(yīng)機(jī)制抵抗高溫傷害。另外，樹齡和高溫環(huán)境發(fā)生方式是影響葡萄幼苗和成年樹的抗逆基因和蛋白表達(dá)差異的主要因素。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Influence of Heat Stress on the Expression of Related Genes and Proteins in Grapevines

ZHA Qian, XI XiaoJun, JIANG AiLi, TIAN YiHua
(Research Institute of Forestry and Pomology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences/Shanghai Key Lab of Protected Horticultural Technology, Shanghai 201403)

【Objective】The suitable air temperature is necessary for growth of grapes. Heat stress often happens in south area of China during grape mature period. The industrial economic benefits of grape are affected by the water-lost leaves and sunburn fruits. So study on the responsive mechanism of grapevines under high temperature stress is particularly important. The present research ismainly focused on the high temperature stress response of young grapes under control condition. As studies on response to high temperature stress in adult grapes are limited, so detailed explanation of high temperature damage in grapevines at different ages could provide a theoretical foundation for prevention of high temperature adversity. 【Method】 This study used 8 table grape varieties in south area of China as experimental materials, including Zuijinxiang, Summer Black, Kyoho, Jumeigui, Shenyu, Shenhua, Shenfeng, and Hupei 1#. Young grapevines (1-year-old) at the same growth stage were acclimated for 7 days in a controlled environment room, with a photoperiod of 14 h light under cool-white fluorescent light at 100 μmol·m-2·s-1. The grape plants were divided into 3 groups and were acclimated for 7 days at normal temperature (25℃). On the following day, 1 group of grapevines was kept at 25℃ in this controlled environment room. The other 2 groups were treated at 35℃or 45℃, respectively, from 10：00 h to 16：00 h (which was stimulated the high temperature levels in the day). The heat response was tested at 0, 3 h, 6 h and 150 h. In addition, the 6-year-old adult grapevines were selected to study heat stress response under field conditions in the present experiment, July 23, 2015 (denoted as “37℃”; highest temperature ＜40℃) stood for pre-temperature stress and July 31, 2015 (denoted as“42℃”, highest temperature ＞40℃) stood for post-temperature stress. 【Result】 The phenotype of young grapevines under high temperature stress was observed. The young sprout and aging leaves of Shenyu, Summer Black and Shenhua showed lightly water-loss at the beginning of high temperature stress, and recovered at 150 h. The leaves of Kyoho and Jumeigui showed slightly water-loss at 3 h and seriously water-loss at 6 h under high temperature stress. The leaves of Shenfeng, Hupei 1# and Zuijinxiang showed a seriously water-loss at 3 h, and the leaves of whole plant dry rot at 6 h under high temperature stress. And different temperature treatments (35℃/45℃/“42℃”) induced the expression of resistance genes in young and adult grapevines. However, the expression of genes in levels were different. The higher temperature level induced the greater gene expression. In addition, the expression of GLOS1 and HSFA2 in Shenyu, Shenhua, Zuijinxiang, Kyoho, and Jumeigui and the expression of HSP70 in Shenyu, Shenhua, Summer Black, and Kyoho recovered to the original levels at 6 h/150 h after high temperature treatments. The expression of HSP17.9 was increased by high temperature stress and the expression was not decreased with the prolongation of time. High temperature treatments (45℃/“42℃”) induced the expression levels of HSP21 protein in young and adult grapevines, however, the expression levels of HSP21 protein decreased in some varieties (Shenfeng and Zuijinxiang). 【Conclusion】 It was found that there are differences between different grape cultivars in the tolerance to high temperature stress. Firstly, Shenyu, Shenhua, and Summer Black are more tolerant to high temperature than others. Secondly, the system of heat-tolerance in Kyoho and Jumeigui collapsed. And then, Shenfeng, Hupei 1# and Zuijinxiang belong to the heat-sensitive grape cultivars. In addition, the differences of expression of genes and proteins between the grape seedling and adult trees were due to the tree age and the happening way of high temperature stress.

grapevine; high temperature stress; resistance genes; HSP21

2016-10-27；接受日期：2017-01-22

國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-30-9）

聯(lián)系方式：查倩，E-mail：zhaqian1988@163.com。通信作者蔣愛麗，Tel：021-62208171；E-mail：putaojal@163.com