柯丹霞，李祥永，王磊，程琳，劉永輝，李小艷，王慧芳

（信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院，河南信陽 464000）

大豆GmHAT5的克隆及其轉(zhuǎn)基因百脈根的抗鹽分析

柯丹霞，李祥永，王磊，程琳，劉永輝，李小艷，王慧芳

（信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院，河南信陽 464000）

【目的】從大豆鹽脅迫基因表達譜中篩選并克隆得到同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白（HD-Zip）家族基因GmHAT5，將其轉(zhuǎn)化豆科模式植物百脈根并進一步探究其抗鹽調(diào)控機制?！痉椒ā渴褂枚喾N生物信息學(xué)軟件對GmHAT5的開放讀碼框（ORF）、編碼蛋白的分子量、等電點、序列結(jié)構(gòu)和蛋白定位等進行預(yù)測，同時將大豆GmHAT5蛋白與其他10個物種的同源蛋白進行比對分析，并對GmHAT5在大豆不同器官及鹽脅迫下的表達特性進行分析。此外，構(gòu)建GmHAT5的植物超表達載體，通過對發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334的轉(zhuǎn)化，得到“復(fù)合體”百脈根植株，并在鹽脅迫條件下對其進行抗鹽表型分析；通過對根癌農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化，獲得百脈根的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系, 并對其進行抗鹽表型分析及相關(guān)生理指標檢測?！窘Y(jié)果】多種生物信息學(xué)軟件分析表明，該片段包含1個1 038 bp的ORF，編碼345個氨基酸。GmHAT5的理論分子量和等電點分別為39.17 kD和4.63。GmHAT5蛋白定位于細胞核，與其他HD-Zip家族蛋白一樣，屬于典型的核蛋白。序列分析表明，GmHAT5包含一個同源異型結(jié)構(gòu)域和一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，屬于第I類同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白。同源蛋白比對表明其與野生大豆GsHAT5同源性最高?；虮磉_特性分析表明，GmHAT5在大豆植株的各個不同器官中均有表達，是一個受鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達的HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)狀根轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明，使用200 mmol·L-1NaCl處理植株7 d后，“復(fù)合體”植株生長狀態(tài)良好，對照組植株葉片明顯萎蔫、失綠；不同NaCl濃度處理離體轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根14 d后，對照組較試驗組發(fā)狀根明顯干枯、生長受到抑制。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示，不同鹽濃度處理14 d后，轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根與兩組對照植株相比生長狀態(tài)更好。相關(guān)生理指標檢測結(jié)果顯示，與兩組對照相比，轉(zhuǎn)基因百脈根植株中丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性明顯降低（P＜0.05）, 而葉綠素含量和根系活力則顯著升高（P＜0.05）。測定不同植株陽離子含量的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因百脈根株系與兩組對照相比，Na+在葉片和根中含量顯著下降，K+和Ca2+在葉片和根中含量顯著升高?！窘Y(jié)論】從大豆中克隆得到一個編碼HD-ZipⅠ類同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白基因 GmHAT5，該基因在大豆中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達量顯著升高。超量表達GmHAT5顯著增強百脈根的耐鹽能力，發(fā)狀根轉(zhuǎn)化法可以作為一種快速有效篩選抗鹽候選基因的手段。推測GmHAT5在大豆鹽脅迫應(yīng)激調(diào)控中扮演重要角色。

大豆；同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白（HD-Zip）；轉(zhuǎn)錄因子；百脈根；耐鹽性

0 引言

【研究意義】百脈根（Lotus japonicus），也稱牛角花，是一種優(yōu)良的豆科牧草。原產(chǎn)地是歐亞溫暖地區(qū)，由于其營養(yǎng)豐富、適口性好、含皂素低、耐牧性強，目前在世界各地得到廣泛種植。同時，作為豆科植物，百脈根的固氮作用能夠增加土壤肥力，促進植株的生長發(fā)育，所以百脈根在建立人工放牧地、補播改良草場和建立人工草地中得到了廣泛的應(yīng)用。而且在豆科牧草中，百脈根的細胞再生性是最好的，它的遺傳轉(zhuǎn)化效率相對較高，所以百脈根是研究生物固氮機理[1-3]、外源基因轉(zhuǎn)化、牧草品質(zhì)改良的豆科模式植物，也是一種作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)動物疫苗的理想材料[4]。但是，大多數(shù)品種百脈根的抗旱性和耐鹽性較差，如果種植在荒漠化或鹽堿化土地上，是難以獲得高產(chǎn)量的。因此，基于傳統(tǒng)育種，利用生物技術(shù)對百脈根進行遺傳改良，從而培育出高產(chǎn)、抗鹽、耐旱的新品種，對提高百脈根牧草的產(chǎn)量、利用荒漠化或鹽堿化土地進而對荒漠化或鹽堿化土地進行改良具有重要意義。【前人研究進展】HD-Zip（homeodomain leucine-zipper）是植物特有的一類編碼同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物生長發(fā)育過程。HD-Zip包含一個高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）和一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（leucine zipper，LZ）。在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的作用下，HD-Zip蛋白形成二聚體，它的同源異型結(jié)構(gòu)域能夠與特定的 DNA序列相結(jié)合，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用[5-7]。根據(jù)HD-Zip蛋白自身氨基酸序列的不同，以及與其結(jié)合的 DNA序列的特異性，可以將HD-Zip蛋白分為Ⅰ—Ⅳ4個亞類。第Ⅰ類HD-Zip蛋白主要參與植物對逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)以及調(diào)控植物衰老、激素信號傳導(dǎo)等過程[8-9]，例如擬南芥 ATHB7和ATHB12受干旱和ABA誘導(dǎo)[10]，ATHB6參與ABA信號傳導(dǎo)[11]。第Ⅱ類HD-Zip蛋白主要在生長素信號傳導(dǎo)和光應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用[12]，例如擬南芥ATHB2能夠參與避蔭性反應(yīng)[13]。第Ⅲ類 HD-Zip蛋白主要參與側(cè)生器官誘發(fā)和分生組織分化等過程[14]。第Ⅳ類 HD-Zip蛋白主要參與表皮細胞分化和根發(fā)育等過程[15-16]，例如擬南芥PDF2和ATML1在表皮細胞分化過程中發(fā)揮功能[17]。目前，已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)42個HD-Zip家族基因，其中17個屬于HD-ZipⅠ成員。CHEN等[18]率先在Williams 82大豆（Glycine max）基因組中鑒定到 88個 HD-Zip 類轉(zhuǎn)錄因子，隨后BELAMKAR等[19]在大豆基因組中鑒定到 101個HD-Zip 類轉(zhuǎn)錄因子，其中35個屬于HD-Zip I類轉(zhuǎn)錄因子。應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選出16個鹽脅迫應(yīng)答基因，其中7個屬于HD-Zip I類基因。在模式豆科植物蒺藜苜蓿中，HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子HB1受鹽脅迫誘導(dǎo)在主根和側(cè)根分生組織中表達量上升。HB1直接識別并結(jié)合到 LBDI啟動子上順式作用元件CAATAATTG，介導(dǎo)抑制LBDI在側(cè)根形成中的作用，使苜蓿形成合適的根表面積以響應(yīng)不良的環(huán)境脅迫[20]。紫花苜蓿HD-Zip I類基因MsHB2受NaCl和ABA脅迫誘導(dǎo)，抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長。該基因可能通過參與 ABA信號傳導(dǎo)途徑從而負調(diào)控紫花苜蓿對鹽等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[21]。將野生大豆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因GsGST19導(dǎo)入紫花苜蓿中，鹽堿脅迫條件下觀察轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長狀態(tài)，測定丙二醛含量、相對質(zhì)膜透性等生理指標，結(jié)果表明，過表達GsGST19能夠提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的鹽堿耐受性[22]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，由于在非生物脅迫中的關(guān)鍵調(diào)控作用，HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子已成為抗逆基因工程應(yīng)用的新熱點。但是應(yīng)用相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來改良牧草抗逆性的報道較少。將大豆HD-Zip I類基因轉(zhuǎn)入百脈根，從分子角度對轉(zhuǎn)基因株系進行抗逆分析的研究目前未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文通過克隆得到一個大豆 HD-ZipⅠ類鹽脅迫應(yīng)答基因 Glyma01g04890，將其命名為GmHAT5。從基因編碼蛋白序列結(jié)構(gòu)、同源蛋白比對等方面進行分析，并構(gòu)建Ubiquitin啟動子調(diào)控的植物超表達載體，對轉(zhuǎn)化獲得的超表達百脈根轉(zhuǎn)基因株系進行抗鹽性及相關(guān)生理指標監(jiān)測，為進一步研究 GmHAT5在鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的分子機制奠定了基礎(chǔ)，為豆科植物耐逆基因工程改良提供了功能明確的候選基因資源，而且對于充分利用中國鹽堿地資源、擴大百脈根種植面積、提高百脈根產(chǎn)量和品質(zhì)、發(fā)展畜牧業(yè)等具有重要的研究價值和廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培大豆Williams82由中國科學(xué)院東北地理研究所孔凡江研究員饋贈；百脈根種子（MG-20）、大腸桿菌 DH5α、發(fā)根農(nóng)桿菌 LBA1334、根癌農(nóng)桿菌EHA105和植物超表達載體p1301U均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室生物固氮分子生物學(xué)研究室保存；克隆載體pGEM-T購自Promega公司。

1.2 GmHAT5的克隆與植物超表達載體的構(gòu)建

參照MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）說明書，提取W82大豆總RNA。取0.5 ng總RNA，用FastQuant RT Kit（With dDNase, TIANGEN）合成cDNA第一鏈。根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的GmHAT5序列（GenBank: KRH74761.1），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物F-GmHAT5和R-GmHAT5進行PCR擴增。將目的片段連接到T載體上測序。將克隆得到的GmHAT5插入植物表達載體p1301U中，上下游引物分別引入BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點（F-OX和R-OX），構(gòu)建p1301U-GmHAT5過表達載體，鈣轉(zhuǎn)，經(jīng)酶切和測序驗證后，將重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA1334中，用于百脈根的發(fā)狀根轉(zhuǎn)化。

1.3 GmHAT5的序列及表達分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對蛋白的結(jié)構(gòu)特征進行分析，用DNAMAN軟件進行序列同源性比對分析。從前人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中[19]調(diào)取GmHAT5在不同器官及鹽脅迫條件下的表達情況，包括幼葉、花、1 cm豆莢、開花后10 d、14 d莢殼、開花后10 d、14 d、21 d、25d、28 d、35 d、42 d種子、根和根瘤共14個組織以及鹽脅迫處理1、6和12 h共3個時間點的差異表達情況。

1.4 GmHAT5對百脈根的發(fā)狀根轉(zhuǎn)化及“復(fù)合體”植株的獲得

百脈根種子表面消毒，22℃暗培養(yǎng)待種子萌發(fā)后移入MS培養(yǎng)基。幼苗胚根長約1 cm時，剪掉胚根，收集子葉部分作為侵染外植體。在發(fā)根農(nóng)桿菌菌懸液中侵染15—30 min，將外植體移入MS平板，暗培養(yǎng)3—5 d。再將外植體轉(zhuǎn)移至含300 mg·L-1羧卞的MS培養(yǎng)基中。2周左右鑒定長出的發(fā)狀根，將不顯藍的陰性毛根切掉，此時獲得的植株即為百脈根“復(fù)合體”植株。詳細步驟請參照柯丹霞[23]方法。

1.5 “復(fù)合體”百脈根植株的鹽脅迫處理

選取長勢一致的“復(fù)合體”百脈根植株和空載體對照植株各15株，每隔2 d，用1/8 Hoagland營養(yǎng)液澆灌；經(jīng)過4周后，用終濃度為200 mmol·L-1NaCl的1/8 Hoagland營養(yǎng)液對植株進行處理，7 d后觀察記錄表型并拍照。

將“復(fù)合體”植株與空載體對照植株陽性發(fā)狀根分別剪取1 cm長一段放入MS培養(yǎng)基上，各分3組，每組8段發(fā)狀根，并設(shè)置3個重復(fù)，暗培養(yǎng)4周后，分別移入0、100和200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，觀察記錄發(fā)狀根生長狀態(tài)。試驗結(jié)束后拍照并收集MS平板上發(fā)狀根，置于105℃烘干24 h，稱量其干物質(zhì)量，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 GmHAT5對百脈根的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及再生植株的獲得

百脈根MG-20種子表面滅菌；萌發(fā)后的幼苗從莖基部橫切（帶葉柄），再縱切將兩片子葉分開；調(diào)整農(nóng)桿菌菌液OD600為0.6，將外植體放置其中浸泡30 min，吸干外植體表面殘留菌液，移入培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3—5 d后，轉(zhuǎn)入含 15—25 μg·mL-1的 G418和 300 μg·mL-1的cefotaxime再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d；外植體轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基連續(xù)篩選培養(yǎng)5周，每周傳代一次；移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上傳代3周；移到芽生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d；移到芽伸長培養(yǎng)基上傳代2周；移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d；移到根伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周生根成苗。煉苗3—4 d后，移入經(jīng)過高壓滅菌的基質(zhì)中（由蛭石﹕珍珠巖﹕草炭土按1﹕1﹕1比例配置），澆灌蒸餾水，放入人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。詳細方法參見《Lotus japonicus Handbook》[24]。

1.7 轉(zhuǎn)基因百脈根植株的分子生物學(xué)鑒定

以轉(zhuǎn)基因百脈根植株葉DNA為模板，根據(jù)篩選標記基因Gus序列設(shè)計特異引物（F-GUS，R-GUS）用于PCR檢測，目的片段長度為1 081 bp。隨后對部分PCR陽性植株進行GmHAT5轉(zhuǎn)錄水平分析?？俁NA的提取及cDNA第一鏈的合成方法同1.2。GmHAT5的特異引物（F-RT和R-RT）用于半定量RT-PCR 分析，以百脈根GPDH（F-GPDH和R-GPDH）為內(nèi)參基因。

1.8 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化百脈根植株的鹽脅迫處理

將轉(zhuǎn)GmHAT5的T0百脈根植株和空載體對照植株，分別剪取帶有2—3個節(jié)點的莖段進行扦插擴繁。待莖段生根后，選取生長狀態(tài)良好且長勢一致的擴繁苗，移栽到蛭石﹕珍珠巖=1﹕1的花缽中，22℃培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗）；1/8 Hoagland營養(yǎng)液每隔2 d澆灌一次；培養(yǎng)4周后，將生長健壯且長勢一致的試驗組以及對照組百脈根植株各分成4組，每組8株，并設(shè)置3個重復(fù)，分別用終濃度為0、50、100和200 mmol·L-1NaCl的1/8 Hoagland營養(yǎng)液處理14 d后觀察記錄表型并測定相關(guān)生理指標。

1.9 轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)生理指標的檢測

1.9.1 丙二醛含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛（MDA）含量。根據(jù)公式計算MDA含量：MDA濃度C（μmol·L-1）= 6.45（OD532- OD600）- 0.56 × OD450，MDA含量（μmol·g-1）= C × 提取液體積/樣品質(zhì)量。

1.9.2 葉片質(zhì)膜透性（相對電導(dǎo)率）測定 取高度一致的葉片0.2 g于錐形瓶中，加20 mL ddH2O并抽氣至葉片下沉；將三角瓶放入搖床中，25℃，100 r/min，處理1—2 h；用DDSJ-308A電導(dǎo)率儀測定上述溶液電導(dǎo)率，記錄為S1；然后100℃煮10 min，待冷卻至室溫后再次測定溶液的電導(dǎo)率，記錄為S2。根據(jù)公式計算相對電導(dǎo)率：相對電導(dǎo)率= (S1 / S2)×100%[25]。

1.9.3 葉綠素含量測定 剪取相同位置的葉片0.2 g放入盛有液氮的研缽中充分研磨；加1 mL預(yù)冷80%的丙酮，避光抽提20 min；離心取上清，加入兩倍體積80%的丙酮；空白對照為等體積80%的丙酮，通過紫外分光光度計檢測反應(yīng)液在663 nm和645 nm處的OD值。根據(jù)公式計算葉綠素含量：Ca=（12.72×OD663-2.59×OD645）×稀釋倍數(shù)，Cb=（22.88×OD645-4.67×OD663）×稀釋倍數(shù)，葉綠素濃度（ct）= Ca+Cb，葉綠素含量（mg·g-1）=（ct×反應(yīng)液體積×稀釋倍數(shù)）/ 樣品質(zhì)量[26]。

1.9.4 根系活力檢測 首先制作氯化三苯基四氮唑（TTC）的標準曲線；于試管中放入0.2 g新鮮根組織；加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液各2 mL，避光，37℃培養(yǎng)箱靜置1 h；加入1 mol·L-1硫酸0.8 mL終止反應(yīng)；取出根，放入盛有2 mL乙酸乙酯和少量石英砂的研缽中研磨；將研缽中的紅色液體移入干凈試管中，加入乙酸乙酯使終體積為4 mL；以乙酸乙酯為空白對照，用紫外分光光度計測定485 nm處的吸光值，對比制作的標準曲線，可以得到四氮唑還原量。根據(jù)公式計算根活力大?。核牡蜻€原強度（mg·(g·h)-1）=四氮唑還原量（mg）/根重（g）×?xí)r間（h）[27]。

1.9.5 Na+、K+和Ca2+含量測定 分別稱取1 g左右根和葉置于烘箱中，80℃烘48 h稱取干重；分別將其研磨成粉狀放入試管中，加入 1 mol·L-1的鹽酸浸泡 12—16 h；離心，在火焰分光光度計（6400A）上測定根和葉中Na+、K+和Ca2+含量。

2 結(jié)果

2.1 GmHAT5序列分析

利用DNAMAN軟件分析克隆得到的GmHAT5，該片段包含1個1 038 bp的ORF，編碼345個氨基酸。經(jīng)Protparam程序預(yù)測，GmHAT5蛋白的理論分子量和等電點分別為39.17 kD和4.63。利用PSORT軟件分析顯示 GmHAT5蛋白定位于細胞核，與其他HD-Zip家族蛋白一樣，屬于典型的核蛋白。

經(jīng)過NCBI網(wǎng)站的BLAST分析以及DNAMAN軟件，對大豆GmHAT5編碼的氨基酸序列進行同源蛋白比對分析發(fā)現(xiàn)，GmHAT5與野生大豆GsHAT5（GenBank：KHN01166.1）同源性最高，因此，將該基因命名為 GmHAT5，其次與綠豆 VrHAT5（GenBank：XP_014521387.1）、鷹嘴豆 CaHAT5（GenBank：XP_004489987.1）、木豆CcHAT5（GenBank：KYP43012.1）、棗ZjHAT5（GenBank：XP_015894877.1）、赤豆VaHAT5（GenBank：XP_017411881.1）、蓮NnHAT5（GenBank：XP_010242341.1）、可可TcHAT5（GenBank：XP_007044376.2）、蘋果 MdHAT5（GenBank：XP_008389534.1）、葡萄 VvHAT5（GenBank：XP_002269605.2）等幾種植物的HAT5蛋白同源性較高，并且都具有2個高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，其中第84—142位氨基酸編碼一個轉(zhuǎn)錄因子特有的功能結(jié)構(gòu)域-同源異型框結(jié)構(gòu)域（Homeobox domain），具有與DNA結(jié)合的功能，第 141—182位氨基酸編碼一個高度保守的功能結(jié)構(gòu)域-同源異型框結(jié)合類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域 HALZ（Homeobox associated leucine zipper）（圖1）。上述結(jié)果充分說明GmHAT5蛋白為大豆HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族的其中一個成員。

圖1 大豆GmHAT5與其他植物中同源蛋白的序列比對Fig. 1 The amino acid sequece alignment analysis of GmHAT5 and some homologous proteins in some other plants

2.2 GmHAT5在不同器官及鹽脅迫下表達特性分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中調(diào)取 GmHAT5在不同器官中的表達情況[19]，包括幼葉、花、1 cm豆莢、開花后10 d、14 d莢殼、開花后10 d、14 d、21 d、25d、28 d、35 d、42 d種子以及根和根瘤共14個組織。如圖2-A所示，GmHAT5在花中表達量最高，其次是根、1 cm豆莢、開花后10 d、14 d莢殼、幼葉，只在開花后21 d種子中未檢測到GmHAT5的表達。由RNA-Seq的差異轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)[24]可知，大豆GmHAT5受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，鹽脅迫處理6 h、12 h 2個時間點表達量明顯上升（圖2-B）。以上結(jié)果表明，GmHAT5在大豆植株的各個不同器官中均有表達，是一個受鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達的HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 不同器官（A）及鹽脅迫下（B）大豆GmHAT5的表達特性Fig. 2 Relative expression levels of GmHAT5 in different organs (A) and under saline stress (B)

2.3 “復(fù)合體”植株的獲得及抗鹽表型分析

利用發(fā)根轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建好的過表達載體p1301U-GmHAT5和空載體p1301U（Ct）分別導(dǎo)入百脈根發(fā)狀根中，用配置好的GUS染液鑒定陽性轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根（圖3-A），發(fā)狀根陽性率為45%，分別獲得超表達“復(fù)合體”植株25株和空載體對照植株18株，分別選取15株生長一致的植株進行抗鹽試驗。植株移入花盆中培養(yǎng)4周后，用200 mmol·L-1NaCl處理7 d，發(fā)現(xiàn)在 NaCl脅迫下，超表達“復(fù)合體”植株均能保持良好的生長狀態(tài)（圖 3-B），而對照植株則明顯萎蔫、失綠（圖3-C）。

將超表達與空載體對照植株陽性發(fā)狀根分別剪取1 cm長一段放入MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)4周后，移入終濃度分別為0、100和200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上（圖3-D—圖3-I）。處理14 d后觀察發(fā)現(xiàn)，正常條件下，超表達和對照植株陽性發(fā)狀根生長旺盛，分支較多（圖3-D和圖3-G）。隨著鹽濃度的升高，如 100 mmol·L-1NaCl處理后，超表達植株陽性發(fā)狀根長勢良好（圖 3-H），而對照陽性發(fā)狀根明顯干枯（圖3-E）；200 mmol·L-1NaCl處理后，雖然超表達植株陽性發(fā)狀根也開始出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，但是未影響發(fā)狀根的正常生長（圖3-I），而對照陽性發(fā)狀根不僅嚴重干枯，而且生長受到明顯抑制（圖 3-F）。對超表達與空載體對照植株陽性發(fā)狀根干物質(zhì)量進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：經(jīng)100和200 mmol·L-1NaCl處理后，空載體對照發(fā)狀根干物質(zhì)量明顯低于轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根（P＜0.01，圖3-J）。由此初步獲悉過表達GmHAT5顯著改善了 NaCl條件下毛狀根的生長狀況，從而提高了百脈根“復(fù)合體”植株的耐鹽性。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株的獲得及抗鹽表型分析

應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體p1301U-GmHAT5導(dǎo)入百脈根，應(yīng)用 GUS設(shè)計的特異引物 F-GUS和R-GUS，對卡那霉素篩選得到的抗性植株進行PCR鑒定，獲得15株P(guān)CR陽性植株（圖4-A）。從中挑選4株超表達植株，RT-PCR 數(shù)據(jù)表明，在超表達百脈根根中均能檢測到目的基因的表達，而對照植株根中未出現(xiàn)目的條帶（圖4-B）。

選取扦插擴繁狀態(tài)一致的 T0代轉(zhuǎn)基因百脈根株系和野生型（Wt）及空載體對照（Ct）植株，分成4組，每組8株，并設(shè)置3個重復(fù)，分別用0、50、100和200 mmol·L-1NaCl處理14 d。發(fā)現(xiàn)在正常條件下，轉(zhuǎn) GmHAT5百脈根株系與野生型及空載體對照的生長狀態(tài)并無明顯差異（圖4-C），而在50 mmol·L-1NaCl處理14 d后，轉(zhuǎn)基因株系的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于2個對照株系（圖4-D）。經(jīng)100、200 mmol·L-1NaCl處理14 d后，轉(zhuǎn)基因株系能保持良好的生長狀態(tài)，而2個對照株系明顯生長矮小，葉片失綠、萎蔫，甚至整株死亡（圖4-E，圖4-F）。

圖3 “復(fù)合體”百脈根植株的抗鹽表型分析Fig. 3 Salt resistant phenotypes of “composite” plants of Lotus japonicus

圖4 轉(zhuǎn)基因百脈根的分子生物學(xué)檢測及抗鹽表型分析Fig. 4 Molecular biology detection and salt stress phenotype analysis of transgenic Lotus japonicus

分別測量轉(zhuǎn)基因百脈根株系和野生型（Wt）及空載體對照（Ct）的株高和根長變化情況，通過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)（圖5），在正常條件下，三者株高和根長沒有明顯差異；經(jīng)過50 mmol·L-1NaCl處理14 d 后，轉(zhuǎn)基因株系的株高與 2個對照株系差異顯著（P＜0.05），而三者之間根長沒有明顯差異；經(jīng)過 100 mmol·L-1NaCl處理14 d 后，轉(zhuǎn)基因株系的株高與2個對照株系之間差異極顯著（P＜0.01），根長與2個對照株系之間差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)過 200 mmol·L-1NaCl處理14 d 后，轉(zhuǎn)基因株系的株高與根長與 2個對照株系之間差異均為極顯著（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，過表達GmHAT5顯著改善了高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根的生長狀況，從而增強了百脈根的耐鹽性。

圖5 鹽脅迫對轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根株高（A）和根長（B）的影響Fig. 5 Changes of shoot height (A) and root length (B) of transgenic Lotus japonicus with GmHAT5 under salt stress

2.5 鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因百脈根相關(guān)生理指標分析

2.5.1 丙二醛（MDA）含量分析 在鹽脅迫下，植物細胞產(chǎn)生大量活性氧使得膜脂發(fā)生過氧化反應(yīng)從而產(chǎn)生 MDA，其含量直接反映植物在脅迫條件下細胞膜受損程度的高低。通過分析轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根和兩組對照植株的MDA含量（圖6-A）發(fā)現(xiàn)，在正常條件下，葉片MDA含量在轉(zhuǎn)基因和對照植株間均無明顯差異，隨著鹽濃度的增加，植株葉片MDA含量均隨之升高，但轉(zhuǎn)基因株系MDA含量增加的量比對照組少（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，超量表達 GmHAT5可減輕鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因百脈根細胞膜造成的氧化損傷。

2.5.2 相對質(zhì)膜透性分析 相對質(zhì)膜透性也能夠反映植株在非生物脅迫下細胞膜受損程度的高低。在正常條件下，百脈根葉片相對質(zhì)膜透性在轉(zhuǎn)基因和對照植株間均無顯著差異。隨著鹽濃度的增加，百脈根葉片相對質(zhì)膜透性也隨之升高，但在相同鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因植株葉片相對質(zhì)膜透性顯著低于對照植株（P＜0.05）（圖6-B）。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GmHAT5增強了鹽脅迫條件下，百脈根植株細胞膜的生理活性。

2.5.3 葉綠素含量分析 圖6-C顯示，隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根株系和對照植株的葉綠素含量均隨之降低，但在相同鹽濃度條件下，轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量均顯著高于對照植株（P＜0.05）。數(shù)據(jù)顯示GmHAT5在百脈根中的超量表達，使得轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫條件下具備較強的光合能力，從而維持良好的生長狀態(tài)。

2.5.4 根系活力分析 從圖 6-D可以看出，隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因和對照植株的根系活力均隨之下降，但與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系的根系活力下降的幅度較低。由此可見，GmHAT5在百脈根中的超量表達可以使百脈根根系維持較高的活力，從而維持良好的生長狀態(tài)。

2.5.5 陽離子含量的分析 為了深入探討轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根植株的抗鹽機理，對轉(zhuǎn)基因株系和對照植株葉和根中Na+、K+、Ca2+的含量進行了測定（圖7）。從圖中可見，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因和對照植株Na+、K+、Ca2+含量在葉和根中基本一致。隨著 NaCl濃度的升高，轉(zhuǎn)基因和對照植株葉和根中Na+和Ca2+含量明顯升高，但與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株Na+含量增加的幅度較??；而Ca2+增加的幅度較大；反之，轉(zhuǎn)基因和對照植株葉和根中K+含量明顯降低，但轉(zhuǎn)基因植株比對照植株下降的要少。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根植株在鹽脅迫條件下，通過降低體內(nèi) Na+的含量，增加K+和Ca2+的含量，維持植株的正常生長，從而使轉(zhuǎn)基因植株具有更好的耐鹽性。

圖6 轉(zhuǎn)GmHAT5百脈根的生理指標測定Fig.6 Analysis on physiological characteristics of transgenic Lotus japonicus with GmHAT5 under salt stress

3 討論

高鹽脅迫是重要的非生物脅迫因子之一，嚴重影響植物的正常生長發(fā)育甚至減少農(nóng)作物的產(chǎn)量[28]。因此，揭示植物響應(yīng)鹽脅迫的分子調(diào)控機理，通過基因工程手段培育耐鹽作物品種對農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)大有裨益。大量研究表明，HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，該類轉(zhuǎn)錄因子較常規(guī)功能基因明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）等植物的抗鹽能力[29]。利用BLAST和 HMM軟件在百脈根注釋基因組中搜尋到 6個HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子，其中4個基因定位于第2染色體，另外2個基因分別定位于第4、第6染色體。EST測序數(shù)據(jù)顯示百脈根中的 HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子在整個植株中均有表達，在根和花芽中表達量較高，推測它們可能在非生物脅迫如ABA、干旱、光應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[30]。本研究從RNA-Seq技術(shù)篩選出的大豆鹽脅迫應(yīng)答基因中克隆了一個受鹽脅迫誘導(dǎo)表達量明顯上升的HD-ZipⅠ類轉(zhuǎn)錄因子GmHAT5，該基因在鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能及作用機理值得進一步深入探討。本研究初步獲悉超表達GmHAT5“復(fù)合體”植株具有一定的抗鹽功能后，進一步對獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化百脈根株系進行鹽脅迫處理。正常條件下，轉(zhuǎn)基因和對照植株生長狀態(tài)基本一致，而高鹽處理的對照植株長勢明顯較差，植株矮小，葉片失綠、萎蔫。與此同時，轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性均低于對照組，而葉綠素含量以及根系活力均高于對照組。丙二醛含量的高低和相對質(zhì)膜透性的大小是衡量植物細胞膜受損程度的2個重要指標。在本研究中，高鹽脅迫破壞植物細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性升高。但轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性較對照明顯較低，說明鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜破壞程度較小，質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性更好，植物能夠維持正常的生理功能。因此，上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)GmHAT5植株在高鹽脅迫下通過減輕質(zhì)膜的過氧化作用、降低葉綠體結(jié)構(gòu)功能的損傷以及增加根系活力，從而增強其耐鹽能力。

為了更好地理解轉(zhuǎn) GmHAT5百脈根植株的耐鹽機理，本研究檢測了轉(zhuǎn)基因和對照植株葉和根中Na+、K+、Ca2+的含量。在正常生長條件下轉(zhuǎn)基因和對照植株中離子的含量沒有明顯差異，說明GmHAT5在正常生長條件下不影響植株對3種陽離子的吸收。隨著鹽濃度逐漸升高，轉(zhuǎn)基因和對照植株葉和根中 Na+和Ca2+含量均隨之升高，K+含量隨之降低，但與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量較少，K+和Ca2+含量較多。在高鹽脅迫下，細胞內(nèi)離子濃度超過一定范圍后導(dǎo)致酶的失活，蛋白質(zhì)合成受阻，大量氨基酸轉(zhuǎn)化為胺類物質(zhì)，使得植物細胞中毒死亡，因此維持一定的離子濃度范圍對植物耐鹽至關(guān)重要。本研究中，GmHAT5在高鹽脅迫下通過減少 Na+的吸收或是增加 Na+的外排，降低轉(zhuǎn)基因植株葉和根中 Na+的含量，從而維持植株的正常生理功能。K+在穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境和調(diào)節(jié)離子平衡過程中發(fā)揮功能，Ca2+在植物耐鹽性方面也扮演著重要角色，如穩(wěn)定細胞壁和細胞膜，刺激細胞對鉀離子的吸收、調(diào)節(jié)水分平衡以及充當?shù)诙攀沟萚31]。因此，在鹽脅迫下保持較高的細胞質(zhì)K+和 Ca2+濃度能夠增強植物的耐鹽性。本研究中，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因百脈根葉和根中K+和Ca2+含量均明顯高于對照植株，充分說明GmHAT5的超表達有利于細胞對K+和Ca2+的吸收，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)平衡。

綜上所述，GmHAT5過量表達顯著提高了轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性，這為培育百脈根抗鹽新品系提供了新的育種材料。本研究建立的百脈根發(fā)狀根轉(zhuǎn)化結(jié)合穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，可以作為一種快速篩選抗鹽候選基因的手段。隨著對HD-Zip基因的逐漸了解以及對植物耐鹽機制的研究和生物技術(shù)的不斷完善，有望在利用HD-Zip基因改良作物的耐鹽性方面取得重要突破。

4 結(jié)論

克隆得到大豆鹽脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因GmHAT5，該基因?qū)儆贖D-Zip家族I類轉(zhuǎn)錄因子，編碼含346個氨基酸的蛋白，與野生大豆GsHAT5同源性最高，具有典型的同源異型框結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；超量表達GmHAT5顯著增強了百脈根的耐鹽能力，發(fā)狀根轉(zhuǎn)化法可以作為一種快速有效篩選抗鹽候選基因的手段；推測GmHAT5在大豆鹽脅迫應(yīng)激調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Isolation of GmHAT5 from Glycine max and Analysis of Saline Tolerance for Transgenic Lotus japonicus

KE DanXia, LI XiangYong, WANG Lei, CHENG Lin, LIU YongHui, LI XiaoYan, WANG HuiFang
(College of Life Sciences, Xinyang Normal University/Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000, Henan)

【Objective】Based on RNA-Seq profiling of the homeodomain leucine zipper protein (HD-Zip) transcription factor family in soybean (Glycine max) during salt stress, screening and cloning of a salt-induced gene (GmHAT5) from soybean were conducted. GmHAT5 was transformed into Lotus japonicus, the legume model system, to further understand the mechanism of salttolerance. 【Method】The ORF of GmHAT5, the protein molecular weight, isoelectric point, sequence structure and protein localization were analyzed by some bioinformatics programs. Meanwhile, the homologous protein alignments with 10 other species, and relative expression levels of GmHAT5 in different organs and under saline stress were also analyzed. The overexpression vector of GmHAT5 was constructed and transformed into Agrobacterium rhizogenes strain LBA1334 to obtain the “composite” Lotus japonicus plants and the salt resistant phenotype was analyzed under salt stress. The overexpression vector of GmHAT5 was also transformed into Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 to obtain the stable transgenic Lotus japonicus plants and then the phenotype and related physiological indexes were analyzed under salt stress. 【Result】Bioinformatics software analysis showed that the GmHAT5 contained an ORF with 1 038 bp, encoded 345 amino acid. The theoretical molecular weight and isoelectric point of GmHAT5 protein were 39.17 kD and 4.63, respectively. GmHAT5, located in the nucleus as other HD-Zip family proteins, was a typical nuclear protein. Sequence analysis showed that GmHAT5, which belonged to the first class of plant HD-Zip protein, contained a homeobox domain and a leucine zipper domain. The homologous protein alignments showed that GmHAT5 had a high similarity with GsHAT5. The hairy root transformation result showed that, after being treated with 200 mmol·L-1NaCl for 7 d, the“composite” plants grew well, while the empty vector control plants exhibited discoloration and stunted growth. Transgenic hairy roots in vitro culture was treated with a different concentration of NaCl for 14 d. Compared with the overexpressing transgenic hairy roots, the control group shriveled up and its growth was inhibited significantly. Stable transformation result showed that, after being treated with different concentration of NaCl for 14 d, the transgenic plants grew well compared to the two control groups. There were significantly changes in malondialdehyde content and relative membrane permeability caused by saline stress in transgenic plants compared to the two control groups (P＜0.05). Moreover, transgenic plants had higher levels of chlorophyll content and root activity compared with the two control groups under saline stress conditions (P＜0.05). Compared with the control plants, transgenic plants had lower levels of Na+content in leaves and roots, while K+and Ca2+contents in leaves and roots increased significantly in transgenic plants.【Conclusion】 A HD-Zip classⅠ homeodomain leucine zipper protein gene (GmHAT5) was cloned from soybean, the expression level was significantly increased under salt stress. Over-expression of GmHAT5 gene could enhance resistance to saline in Lotus japonicus. Hairy root transformation method could be used as a quick effective means for screening of salt tolerance candidate gene. These imply that GmHAT5 may play an important role in salt stress regulation in soybean.

Glycine max; homeodomain leucine zipper protein (HD-Zip); transcription factor; Lotus japonicus; saline tolerance

2016-11-21；接受日期：2017-01-03

國家自然科學(xué)基金青年基金（31400213）、信陽師范學(xué)院青年骨干教師資助計劃（2015）、信陽師范學(xué)院“南湖學(xué)者獎勵計劃”青年項目、2016年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201610477011）

聯(lián)系方式：柯丹霞，Tel：18738665461；E-mail：kdx_029@163.com