陳國曉，劉修恒，張祥生，丁德剛，朱曉博，陳鑫，閆天中

[1.河南省人民醫(yī)院（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院）泌尿外科，河南 鄭州 450003；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院（湖北省人民醫(yī)院）泌尿外科，湖北 武漢 430060]

臭氧氧化后處理對腎臟缺血再灌注損傷的作用

陳國曉1，劉修恒2，張祥生1，丁德剛1，朱曉博1，陳鑫1，閆天中1

[1.河南省人民醫(yī)院（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院）泌尿外科，河南 鄭州 450003；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院（湖北省人民醫(yī)院）泌尿外科，湖北 武漢 430060]

目的研究臭氧O3氧化后處理對大鼠腎臟缺血再灌注所致腎臟慢性纖維化的作用及相關(guān)機(jī)制。方法將72例SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（S組）、單純?nèi)毖俟嘧⒔M（I/R組）、O3氧化后處理組（I/R+O3組）、氧氣O2后處理組（I/R+O2組），每組4只。每組在模型復(fù)制成功后2周檢測血清肌酐（Scr）和血漿尿素氮（BUN），2和10周取腎臟標(biāo)本，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法染色、Masson染色，以及免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后2周各組的血清Scr、血漿BUN基本恢復(fù)到正常范圍，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后10周Masson染色顯示，腎纖維化程度，其他3組較S組重（P<0.05），I/R+O3組較I/R組、I/R+O2組輕（P<0.05），而I/R組與I/R+O2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與S組比較，其他3組TGF-β1、α-SMA的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+O3組的表達(dá)減弱（P<0.05）；I/R組與I/R+O2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論O3后處理可以減輕缺血再灌注損傷腎臟的慢性纖維化，其機(jī)制可能與O3后處理抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號通路激活有關(guān)。

缺血再灌注損傷；腎纖維化；臭氧氧化后處理

由于腎移植等泌尿外科手術(shù)中腎臟的缺血不可避免，因此如何預(yù)防和減輕缺血再灌注損傷，一直是臨床上研究腎臟保護(hù)的熱點(diǎn)課題。臭氧O3氧化預(yù)處理可以減輕腎臟的缺血再灌注損傷。但是臭氧氧化后處理對缺血再灌注損傷遠(yuǎn)期作用的相關(guān)文獻(xiàn)少有報(bào)道。本研究旨在進(jìn)一步研究臭氧后處理對大鼠缺血再灌注損傷腎臟纖維化的作用，以及可能的機(jī)制，為臨床保護(hù)缺血再灌注損傷提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley級（SD）大鼠，清潔級，雄性，體重250～300 g。室溫20～22℃，12 h晝/夜循環(huán)照明，濕度60%～80%，常規(guī)飲食，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后使用。

1.2 方法

1.2.1 模型 復(fù)制大鼠腎臟缺血再灌注模型：大鼠術(shù)前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定于鼠臺上，去毛，75%乙醇消毒，500 u肝素鈉腹腔注射，實(shí)驗(yàn)中體溫（直腸溫度）保持在37℃左右。行腹部正中切口，逐層切開皮膚，腹直肌及腹膜，暴露左右腎臟，游離左、右腎蒂，切除右側(cè)腎臟。用無損傷動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即確認(rèn)將腎臟血流阻斷，50 min后松開血管夾恢復(fù)腎臟血供，腎臟顏色變?yōu)轷r紅即為血流恢復(fù)，此為腎缺血再灌注模型。

1.2.2 分組 72例SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組18例。假手術(shù)組（sham-operated control group，S組），單純?nèi)毖俟嘧⒔M（ischemia reperfusion group，I/R組），臭氧氧化后處理組（ozone oxidative post-conditioning group，I/R+O3組），氧氣O2后處理組（oxygen post-conditioning group，I/R+O2組）。S組切除右側(cè)腎臟，僅行游離左側(cè)腎蒂而不夾閉，切口用生理鹽水紗布覆蓋，暴露50 min后關(guān)腹；I/R組切除右側(cè)腎臟，用無損傷動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即確認(rèn)將腎臟血流阻斷，50 min后松開血管夾恢復(fù)腎臟血供，腎臟顏色變?yōu)轷r紅即為血流恢復(fù)再灌注；I/R+O3組在I/R組基礎(chǔ)上，再灌注成功后，從SD大鼠肛門按照1 mg/kg吹入O3和氧氣的混合氣體（臭氧濃度為50μg/ml），1次/d，持續(xù)2周；I/R+ O2組在I/R組基礎(chǔ)上，再灌注成功后，按照13mg/kg從SD大鼠肛門吹入氧氣，1次/d，持續(xù)2周。

4組所有SD大鼠經(jīng)不同的手術(shù)及處理后，縫合傷口，麻醉蘇醒后回鼠籠。術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素20萬IU/d，抗感染，連續(xù)3 d。術(shù)后所有動(dòng)物在鼠籠中活動(dòng)，正常獲得水和食物。術(shù)后2周分別于下腔靜脈采血，并于術(shù)后第2和10周，每組取9只大鼠腎臟標(biāo)本。動(dòng)物用靜脈注射10%氯化鉀處死。

1.2.3 標(biāo)本采集 術(shù)后2周，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg大鼠腹腔注射麻醉生效后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，腹部消毒后剖腹，在無菌條件下抽取下腔靜脈血液2～3 ml，將血液標(biāo)本注入放有分離膠和促凝劑的試管，常溫3 000 r/min離心15 min后留取上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存，分別測定血血清肌酐（serum creatinine，Scr）和血漿尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

于術(shù)后2和10周，每組各取9例SD大鼠，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg大鼠腹腔注射麻醉生效后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，去毛，75%乙醇消毒，500 u肝素鈉腹腔注射，實(shí)驗(yàn)中體溫（直腸溫度）保持在37℃左右。切取左側(cè)腎臟標(biāo)本，并處死動(dòng)物。用生理鹽水通過腎動(dòng)脈將腎臟灌注至變白，充分沖凈腎臟血管中積存的血液，沖洗腎臟表面血液，濾紙吸干表面水份，冠狀剖開腎臟，切取皮質(zhì)塊，經(jīng)10%中性多聚甲醛固定后制備切片。常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)法檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Scr、BUN濃度 將血液標(biāo)本注入放有抗凝劑和分離膠的試管常溫1 500 r/min離心15 min，取上層血清置入-20℃冰箱冷凍保存，將血液標(biāo)本送至本院檢驗(yàn)科使用7170全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）測定Scr、BUN濃度。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 在事先設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，切取左側(cè)腎臟組織，10%多聚緩沖甲醛溶液固定24 h，制備切片，分別使用HE染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化；Masson染色觀察腎組織纖維化變化，腎小管間質(zhì)纖維化程度根據(jù)皮質(zhì)和外髓質(zhì)部受損面積占每高倍鏡面積（×200）的百分比來判斷；免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)；用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）進(jìn)行分析，根據(jù)公式：累計(jì)光密度/陽性表達(dá)區(qū)面積=平均光密度值（optical delnsity，OD），計(jì)算OD值，進(jìn)而定量比較各組的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注2周后大鼠腎功能和組織病理形態(tài)學(xué)的變化

根據(jù)尿素氮和肌酐來評價(jià)腎功能，2周后各組的肌酐、尿素氮基本恢復(fù)到缺血前水平，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1和圖1。

但是通過HE染色可以看出腎組織形態(tài)學(xué)改變卻不盡一致，I/R+O3組引起的腎小管間質(zhì)損傷已恢復(fù)，并接近正常，組織形態(tài)學(xué)接近于S組，而I/R組和I/R+O2組卻仍有小管變形、水腫、空泡、炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)區(qū)變寬等病理改變。見圖2。

表1 4組大鼠術(shù)后第2周Scr、BUN水平比較（n=18，±s）

表1 4組大鼠術(shù)后第2周Scr、BUN水平比較（n=18，±s）

組別BUN/（mmol/L）S組 29.8±3.17 7.01±1.68 I/R組 29.7±3.08 7.78±1.52 I/R+O3組 28.9±4.04 7.12±1.70 I/R+O2組 29.8±3.37 7.72±1.67 F值 0.290 1.059 P值 0.833 0.372 Scr/（μmol/L）

圖1 術(shù)后2周各組Scr、BUN的變化 （n=18，±s）

Masson染色顯示，I/R組、I/R+O2組小管間質(zhì)已經(jīng)有纖維化趨勢，而S組、I/R+O3組尚無明顯變化。見圖3。

圖2 術(shù)后2周各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 （HE染色×200）

2.2 缺血再灌注10周后大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色切片觀察，各組腎小球未見明顯改變，I/R組皮質(zhì)及外髓質(zhì)部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性，少量炎癥細(xì)胞浸潤?？傮w來看4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腎小管間質(zhì)纖維化程度根據(jù)皮質(zhì)和外髓質(zhì)部受損面積占每高倍鏡面積（×200）的百分比來判斷。S組大鼠腎纖維化程度為（1.12±0.19）%，I/R組為（39.01±1.56）%，I/R+O3組為（18.02±1.58）%，I/R+ O2組為（37.80±5.89）%。Masson染色表現(xiàn)為：I/R組腎小管有萎縮、管腔擴(kuò)張、膠原纖維沉積、間質(zhì)區(qū)增寬，有炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)呈條索狀和片狀分布的纖維化表現(xiàn)并且與I/R+O2組相似，S組無明顯纖維化，而I/R+O3組纖維化明顯減輕。4組間Masson染色比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=294.394，P=0.000），且I/R組、I/R+O3組、I/R+O2組與S組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.494、11.360和24.686，P=0.000），I/R+ O2組與I/R組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.808，P=1.000），I/R+O3組與I/R組、I/R+O2組腎小管間質(zhì)纖維化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.133和13.326，P=0.000），I/R+O3組較I/R組、I/R+O2組低。見圖4。

圖3 術(shù)后2周各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 （Masson染色×200）

圖4 術(shù)后10周各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 （Masson染色×200）

2.3 缺血再灌注10周后大鼠腎組織α-SMA、TGF-β1的表達(dá)

圖5 術(shù)后10周各組α-SMA表達(dá)的變化 （免疫組織化學(xué)法×400）

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，α-SMA的表達(dá)主要在間質(zhì)和血管，而TGF-β1的表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，兩者的陽性區(qū)域與纖維化分布位置較為一致。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析，計(jì)算平均OD值來比較各組差異。α-SMA、TGF-β1在S組表達(dá)很弱，在I/R組腎臟表達(dá)較強(qiáng)，并且與I/R+ O2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在臭氧氧化后處理組較I/R組及I/R+O2組表達(dá)減弱（P<0.05）。4組α-SMA、TGF-β1表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 2 709.119和2 606.613、P=0.000），且I/R組、I/R+O3組、I/R+O2組的α-SMA、TGF-β1與S組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tα-SMA=76.213、27.772和72.753，Pα-SMA= 0.000；tTGF-β1=76.086、25.825和68.906，PTGF-β1=0.000）；I/R+O2組與I/R組的α-SMA、TGF-β1比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.460和7.180，P=0.061和0.082）；I/R+O3組α-SMA、TGF-β1與I/R組、I/R+O2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tα-SMA=48.442和44.981，Pα-SMA= 0.000；tTGF-β1=50.261和43.081，PTGF-β1=0.000），I/R+ O3組較I/R組、I/R+O2組低。見表2和圖5、6。

表2 各組大鼠α-SMA、TGF-β1的表達(dá)比較（n=9，±s）

表2 各組大鼠α-SMA、TGF-β1的表達(dá)比較（n=9，±s）

注：1）與S組比較，P<0.05；2）與I/R組比較，P<0.05；3）與I/R組比較，P>0.05

組別TGF-β1的OD值S組 0.057±0.0072 0.0416±0.0062 I/R組 0.3021±0.00751） 0.2387±0.00551）I/R+O3組 0.1485±0.00691）2） 0.1085±0.00491）2）I/R+O2組 0.2997±0.00631）3） 0.2321±0.00531）3）F值 2709.119 2606.613 P值 0.000 0.000 α-SMA的OD值

圖6 術(shù)后10周各組TGF-β1表達(dá)的變化 （免疫組織化學(xué)法×400）

3 討論

自從再灌注損傷現(xiàn)象被報(bào)道后，圍繞保護(hù)或減輕缺血再灌注損傷的研究就沒有停止過。2002年缺血后處理的概念被提出[1]，由于其現(xiàn)實(shí)的可行性高而備受關(guān)注。其實(shí)廣義的后處理還包括藥物干預(yù)、化學(xué)干預(yù)等缺血再灌注發(fā)生以后其他人為干預(yù)措施，如本研究中用臭氧氧化后處理發(fā)生缺血再灌注損傷的腎臟。

國內(nèi)外一些研究證實(shí)，臭氧氧化預(yù)處理可以對缺血再灌注損傷的腎臟及其他器官有保護(hù)作用[2-3]。JOSE等[4]報(bào)道,臭氧氧化后處理對再灌注損傷導(dǎo)致的急性腎衰竭也有保護(hù)作用，并指出可能的機(jī)制有：刺激內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)組織對氧自由基的抵抗力；增加血液循環(huán)和加快氧代謝；降低氧化應(yīng)激；降低鈣超載；增加內(nèi)源性腺苷和NO的水平；減弱腎臟細(xì)胞凋亡的水平。但國內(nèi)外有關(guān)臭氧后處理對缺血再灌注損傷遠(yuǎn)期保護(hù)作用的相關(guān)報(bào)道卻不多。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均表明，嚴(yán)重的缺血再灌注損傷不僅可以引起急性腎功能衰竭，而且可以導(dǎo)致慢性腎小管間質(zhì)纖維化[5]。而腎間質(zhì)纖維化是各種病因腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同通路。

有學(xué)者稱，再灌注期間，腎小管有很強(qiáng)的增殖修復(fù)能力，再灌注損傷可以完全改善[6]。但有研究發(fā)現(xiàn)，一旦損傷程度超過某一臨界值，腎小管損傷就是不可逆的，腎小管的結(jié)構(gòu)和功能就不能完全恢復(fù)[7]。輕度的腎缺血再灌注損傷隨著時(shí)間的推移，腎功能及腎臟的病理改變會逐步恢復(fù)正常，但是當(dāng)發(fā)生的腎缺血再灌注損傷較嚴(yán)重時(shí)，由損傷導(dǎo)致的腎小管會發(fā)生不可逆性改變，表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)纖維化[8]。另有研究表明，中度的腎小管間質(zhì)纖維化病變盡管沒有引起血尿素氮，肌酐等指標(biāo)異常升高，但是缺血性腎衰竭的存活者遺留有不同程度的慢性腎臟功能和結(jié)構(gòu)損害[9-10]。

關(guān)于大鼠缺血再灌注模型的復(fù)制方法，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一，基本包括COHRANCE[11]和LEE等[12]復(fù)制的模型，其中腎缺血時(shí)間尤為重要。缺血時(shí)間過短，遠(yuǎn)期纖維化不明顯，而缺血時(shí)間過長則會大大提高大鼠死亡率，本研究所采用的缺血50 min是在LEE等[12]復(fù)制模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)而確立。本研究術(shù)后2周各組血Scr和BUN顯示腎功能雖然基本恢復(fù)正常，但是病理形態(tài)學(xué)上仍存在異常，Masson染色顯示有纖維化趨勢。而術(shù)后10周，缺血再灌注組出現(xiàn)的間質(zhì)纖維化就十分明顯，與此相對應(yīng)的是肉眼觀腎臟體積增大，腎臟表面不再光滑，粗糙呈顆粒樣凹凸不平。這說明在本研究中缺血再灌注已經(jīng)造成不可逆的腎臟慢性損傷，10周出現(xiàn)較明顯的腎間質(zhì)纖維化?？梢岳斫鉃?0min的較長時(shí)間缺血，造成腎臟持續(xù)的明顯損傷，使腎臟在血流復(fù)灌后第10周出現(xiàn)較明顯的腎間質(zhì)纖維化。說明本實(shí)驗(yàn)通過缺血再灌注損傷復(fù)制的大鼠腎纖維化模型是成功。但是具體缺血時(shí)間的長短，對應(yīng)引起腎臟纖維化的程度的輕重，以及兩者是否一致，還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，臭氧氧化后處理減輕腎小管間質(zhì)纖維化病變，同時(shí)還使腎組織α-SMA、TGF-β1的表達(dá)降低。

α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，而肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的活化形式，同時(shí)也是細(xì)胞外基質(zhì)膠原成分的主要來源[13]。在正常腎組織中α-SMA僅在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，而本研究術(shù)后10周的腎間質(zhì)中可以看到其表達(dá)增加，說明早期腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞已活化。

TGF-β1被公認(rèn)為是眾多纖維因子中的重要一個(gè)，其與受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而活化靶基因，從而產(chǎn)生一系列靶蛋白，該蛋白可以通多種途徑或其他機(jī)制使肌成纖維細(xì)胞增多。TGF-β1有多條下游信號通路，其中又以Smad信號通路在多種組織器官的纖維化過程中發(fā)揮重要作用[14]。許多對TGF-β1/Smad通路的研究發(fā)現(xiàn)，通過拮抗TGF-β1活化可以減輕腎間質(zhì)纖維化[15]。OVERSTREET等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，通過激活TGF-β1信號傳導(dǎo)通路可導(dǎo)致腎臟纖維化。

而筆者研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后10周單純?nèi)毖俟嘧⒔M的α-SMA、TGF-β1表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)，與此同時(shí)其纖維化程度也較對照組假手術(shù)組增強(qiáng)。提示缺血再灌注所導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)纖維化可能與肌成纖維細(xì)胞增多及TGF-β1/Smad信號通路激活有關(guān)。

另外，在筆者的研究中發(fā)現(xiàn)，α-SMA、TGF-β1在I/R組腎臟表達(dá)都增強(qiáng)，并且與I/R+O2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在O3后處理組與之比較，表達(dá)減弱，在假手術(shù)組無明顯表達(dá)。這提示O3后處理對缺血再灌注損傷造成的腎纖維化無明顯作用，同時(shí)排除其對觀察臭氧后處理對腎纖維化作用效果的干擾。O3后處理組腎間質(zhì)纖維化程度較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明顯減輕，同時(shí)其α-SMA、TGF-β1表達(dá)減弱，兩者相一致，則提示臭氧氧化后處理減輕組織纖維化的作用可能與其抑制TGF-β1/Smad信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，本研究提示較嚴(yán)重的腎臟缺血再灌注則可以引起腎小管間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與肌成纖維細(xì)胞增多，以及TGF-β1/Smad信號通路激活有關(guān)；而臭氧氧化后處理則可能通過抑制該信號通路而減輕腎臟的纖維化改變。至于更詳細(xì)的抑制該信號通路機(jī)制，還有待進(jìn)一步探討。臭氧氧化后處理在臨床上較具有現(xiàn)實(shí)可行性，有一定的運(yùn)用前景，本課題研究為其提供一定的理論基礎(chǔ)。

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（童穎丹 編輯）

Ozone oxidative post-conditioning protects rat kidney from ischemia reperfusion injury

Guo-xiao Chen1,Xiu-heng Liu2,Xiang-sheng Zhang1,De-gang Ding1, Xiao-bo Zhu1,Xin Chen1,Tian-zhong Yan1
[1.Department of Urology,Henan Provincial People's Hospital(People's Hospital of Zhengzhou University),Zhengzhou,Henan 450003,China;2.Department of Urology,the People's Hospital of Wuhan University(Hubei Provincial People's Hospital),Wuhan,Hubei 430060,China]

ObjectiveTo explore the effect of ozone oxidative post-conditioning on chronic renal fibrosis induced by ischemia reperfusion injury in rats and the mechanism.MethodsTotally 72 adult male SD rats were randomly divided into four groups (18 in each):sham-operation control group (S group),ischemia reperfusion group (I/R group),ozone oxidative post-conditioning group (I/R+O3group)and oxygen postconditioning group(I/R+O2group).Serum creatinine(Scr)and blood urea nitrogen(BUN)levels were evaluated 2 w after successful modeling.Renal specimens were obtained in the 2th and 10th week respectively,and the renal tissues were stained by HE and Masson staining.The protein expressions of transforming growth factorβ1(TGF-β1)and α-smooth muscle actin(α-SMA)were determined by immunohistochemistry analysis.ResultsAfter two weeks of treatment,Scr and BUN of each group basically returned to normal levels,and there were no significant differences among the four groups (P>0.05).Ten weeks after operation,Masson staining revealed renal fibrosis of the I/R,I/R+O2and I/R+O3groups was more serious than that of the S group (P< 0.05),renal fibrosis of the I/R+O3group was milder than taht of the I/R and I/R+O2groups (P<0.05),whilethere was no difference between the I/R group and the I/R+O2group (P>0.05).The protein expressions of TGF-β1and α-SMA of the I/R,I/R+O2and I/R+O3groups were higher than those of the S group (P<0.05); and compared with the I/R group,the expressions of TGF-β1and α-SMA were lower in the I/R+O3group (P< 0.05).There was no difference in the expression of TGF-β1or α-SMA between the I/R+O2group and the I/R group (P>0.05).ConclusionsOzone oxidative post-conditioning can relieve chronic renal fibrosis caused by ischemic reperfusion injury,and inhibition of activation of TGF-β1/Smad signaling pathway may be one of the mechanisms.

ischemia/reperfusion injury;renal fibrosis;ozone oxidative post-conditioning

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.004

1005-8982（2017）09-0019-06

2016-07-06

張祥生，E-mail：zxs9818@126.com，Tel：15037103077