江敏時 檀衛(wèi)平 郭奕文 鄒志浩

孟魯司特抑制RSV感染人支氣管上皮細胞所致炎癥作用研究

江敏時 檀衛(wèi)平 郭奕文 鄒志浩

目的以呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支氣管上皮細胞株(16HBECs)為模型, 探討孟魯司特在抑制炎癥過程中的藥理作用機制。方法建立RSV感染的16HBECs的炎癥模型, 給予不同滴度的RSV作用, 收集上清液, 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)兩次檢測細胞上清液中炎癥因子的表達。CCK-8法檢測藥物對16HBECs的生長影響。結果造模過程中隨RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用時間越長,炎癥因子的分泌量持續(xù)升高。12 mg/L及以下藥物濃度的孟魯司特和1∶320及以下稀釋倍的利巴韋林對細胞增殖沒有抑制作用。與感染RSV組相比, 高中劑量孟魯司特組較利巴韋林組抑制炎癥因子的作用明顯(P＜0.05)。結論孟魯司特能抑制RSV感染人支氣管上皮細胞所致炎癥作用。

孟魯司特；人支氣管上皮細胞；呼吸道合胞病毒；炎癥

支氣管哮喘是一種由T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等眾多因素共同介導的呼吸道炎癥疾病。RSV容易感染嬰幼兒、老年人等, 引起毛細支氣管炎癥和肺炎。孟魯司特是一種選擇性半胱氨酰白三烯受體(CysL1Rs)拮抗劑, 在國內(nèi)外臨床上都是治療哮喘的首選藥物。有研究發(fā)現(xiàn)孟魯司特具有非CysL1Rs依賴性的更加廣譜的抗炎性, 可作用于免疫活性細胞如嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、中性粒細胞等［1］, 其作用機制不太明確, 更需廣大科研人員的深入研究探討。

1 材料與方法

1. 1 實驗試劑與設備細胞和病毒：人喉鱗癌上皮細胞株(HEp-2細胞)、16HBECs、RSV-Long毒株A2型；藥物和試劑：孟魯司特鈉、利巴韋林注射液(1 ml∶100 mg)。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清；CCK-8試劑；IL-1β、TNF-α、IL-6、ELISA 試劑盒；設備：低溫高速離心機；Thermo酶標儀。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 建立RSV感染的16HBECs的炎癥模型Hep-2細胞、16HBECs生長培養(yǎng)采用高糖DMEM培養(yǎng)基, 細胞生長環(huán)境為37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。每隔2～3 d傳代一次, 取對數(shù)期生長的細胞試驗。

1. 2. 2 RSV 培養(yǎng)及組織培養(yǎng)感染量(TCID50)測定用Hep-2細胞對RSV進行擴增。當細胞病變(cytopathic effect, CPE)總數(shù)達到80%時收集細胞, 于-80℃/37℃的條件中反復凍融3次, 最后一次凍融盡量最大程度的收集細胞, 使之釋放病毒。將收集得來的細胞懸液在低溫離心機上2500 r/min, 離心10 min, 收集上清液, 采用0.22 μm濾膜過濾, 得到病毒懸液,沉淀則棄之。然后分裝后于-80℃保存。按依Reed-Muench兩氏法計算TCID50。

1. 2. 3 RSV誘導16HBECs炎癥模型的建立不同滴度的病毒的培養(yǎng)基作為RSV 感染組, 設不含滴度病毒培養(yǎng)基的正常細胞對照組。收集12～72 h內(nèi)被感染不同滴度的RSV的16HBECs上清液, 待測炎癥因子。

1. 2. 4 孟魯司特對RSV所致16HBECs炎癥的影響CCK-8法檢測孟魯司特對細胞的毒性：細胞存活率=藥物作用孔的OD值/正常對照組的OD值。確定各藥物的最大無毒濃度。ELISA按試劑盒說明書進行檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α。

1. 3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示, 多組比較采用單因素方差分析, 多組組間對比采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 RSV毒力測定每50 μl的原液含104.7TCID50, 病毒滴度為104.7TCID50/50 μl。

2. 2 RSV誘導16HBECs炎癥模型的建立隨著RSV感染滴度的增多, IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量呈上升趨勢(P＜0.05),隨感染時間延長, 相同滴度水平下IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量與12 h相比較也持續(xù)增多(P＜0.05)。

2. 3 孟魯司特對RSV所致16HBECs炎癥的影響

2. 3. 1 藥物毒性測定24 mg/L及48 mg/L的孟魯司特、1∶320以上稀釋倍數(shù)利巴韋林對16HBECs是有一定的抑制作用的, 12 mg/L及以下濃度的孟魯司特、1∶320及以下的稀釋倍數(shù)利巴韋林對細胞的生長均無明顯的抑制作用。

2. 3. 2 孟魯司特對RSV所致16HBECs炎癥的影響高中低三個劑量的孟魯司特鈉組、利巴韋林組與模型組比較, 三個炎癥因子的表達水平都有顯著的降低(P＜0.05)；高中劑量組分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α的含量比利巴韋林組分泌的量低(P＜0.05)。見表1。

表1 孟魯司特對RSV所致16HBECs炎癥因子的影響

表1 孟魯司特對RSV所致16HBECs炎癥因子的影響

注：與對照組比較,aP＜0.05；與模型組比較,bP＜0.05；與利巴韋林組比較,cP＜0.05

3 討論

該實驗成功建立了永久性RVS感染人支氣管上皮細胞的模型并開展后續(xù)的研究。有體內(nèi)外研究表明, RSV感染的氣道上皮細胞分泌高水平的IL-6、IL-1β、IL-8能調(diào)節(jié)刺激正常T細胞的表達, 調(diào)節(jié)活化正常T細胞表達以及其他促炎癥因子和趨化因子［2-6］。

孟魯司特是我國臨床上用于治療小兒支氣管哮喘的指南, 作為一種新型的非甾體類抗炎藥, 還具有一系列CysLT1Rs非依賴性的次級抗炎性, 抑制嗜酸性粒細胞在氣道血管內(nèi)皮的粘附于遷移活動［1,7-9］。孟魯司特單用對輕度持續(xù)性哮喘小兒有較好的治療效果, 并且副作用小［10-12］。

研究表明, 造模過程中隨RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的IL-1β、TNF-α、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用時間越長, 炎癥因子的分泌量持續(xù)升高(P＜0.05)。12 mg/L及以下藥物濃度的孟魯司特和1∶320及以下稀釋倍的利巴韋林對細胞增殖沒有抑制作用。與感染RSV組相比,高中劑量孟魯司特組較利巴韋林組抑制炎癥因子的作用明顯(P＜0.05)。孟魯司特對炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6這三個指標都能明顯的改善。但孟魯司特抑制炎癥反應機制目前為止尚未十分明確, 闡明其對炎癥反應的影響對支氣管哮喘的治療具有深遠的意義。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.08.074

2017-03-21］

510800 廣州市中西醫(yī)結合醫(yī)院(江敏時 郭奕文鄒志浩)；中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院(檀衛(wèi)平)