宋 冬， 郝卯林， 項冰倩， 羅梓垠， 石 璐， Wu Yiming， 王萬鐵△

(1. 溫州醫(yī)科大學缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 2. 四川省宜賓衛(wèi)生學校生理教研室， 宜賓 644000； 3. Division of Cardiovascular Medicine University of Iowa Carver College of Medicine， Iowa City 52242， USA； 4. 南京醫(yī)科大學康達學院病理學與法醫(yī)學教研室， 連云港 222000)

益氣活血通絡(luò)解毒方對小鼠肺缺血/再灌注損傷的作用及其機制*

宋 冬1，4， 郝卯林1+， 項冰倩1， 羅梓垠1， 石 璐2， Wu Yiming3， 王萬鐵1△

(1. 溫州醫(yī)科大學缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 2. 四川省宜賓衛(wèi)生學校生理教研室， 宜賓 644000； 3. Division of Cardiovascular Medicine University of Iowa Carver College of Medicine， Iowa City 52242， USA； 4. 南京醫(yī)科大學康達學院病理學與法醫(yī)學教研室， 連云港 222000)

目的：探討益氣活血通絡(luò)解毒方(YHTJF)對小鼠的肺部缺血/再灌注(I/R)損傷，及對I/R引起的氧化應激反應的作用。方法：成年雄性10～12周齡C57BL/6J小鼠70只，體重(21～25)g，采用在體左肺門夾閉法復制缺血/再灌注損傷模型。隨機分為7組：正常對照組(C)，羧甲基纖維素鈉carboxyl methyl cellulose-Na(CMC-Na)+正常對照組(CC)，羧甲基纖維素鈉+假手術(shù)組(CS)，羧甲基纖維素鈉+I/R模型組(CIR)，羧甲基纖維素鈉+YHTJF低、中、高濃度干預組(CYL、CYM、CYH)。CN、CS、CIR組術(shù)前連續(xù)7 d腹腔注射CMC溶液，CYL、CYM、CYH組術(shù)前連續(xù)7 d腹腔注射低、中、高濃度的YHTJF溶液。術(shù)畢，取左肺測定肺組織干濕比(W/D)及總肺含水量(TLW)，行肺組織損傷評估(IQA)，光鏡觀察肺組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)改變。TUNEL測組織細胞凋亡指數(shù)(AI)。檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)。結(jié)果：相比C組，CC組和CS組所有檢測指標均無明顯差異，CIR組的W/D、TLW、IQA、AI明顯升高(P<0.01)，肺組織形態(tài)學破壞顯著；MDA含量、MPO活力明顯升高，SOD活性顯著降低。與CIR組比較，CYL組、CYM組、CYH組W/D、TLW、IQA、AI的表達均明顯下降(P<0.01)，組織損傷明顯減輕，CYM組各項指標數(shù)值改善最明顯，組織損傷最輕；3個用藥組的MDA含量、MPO活力明顯下降，SOD活性顯著升高，其中中劑量用藥組氧化應激指標變化最突出。結(jié)論：YHTJF可有效減輕小鼠缺血/再灌注性肺損傷，以中劑量效果為最佳，其機制可能與其抑制體內(nèi)氧化應激反應、減輕肺組織細胞凋亡有關(guān)。

益氣活血通絡(luò)解毒方；小鼠；肺缺血/再灌注損傷；氧化應激；細胞凋亡

【DOI】 10.12047/j.cjap.5450.2017.038

肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury，LI/RI)是導致急性肺損傷的主要原因之一，其發(fā)生與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成、內(nèi)皮細胞的損傷、血管通透性增加、中性粒細胞和血小板的活化、細胞因子和補體系統(tǒng)的改變息息相關(guān)。目前已有大量報道，具有益氣、活血、通絡(luò)等功效的中藥對心、腦、腎等臟器在缺血/再灌注過程中的損傷有明顯的減輕作用[1-6]，但對這些中藥在肺臟缺血/再灌注方面的作用研究卻極少，故本實驗通過應用益氣活血通絡(luò)解毒方(yiqi huoxue tongluo jiedu fang，YHTJF)對C57BL/6J小鼠左肺模擬缺血/再灌注模型進行干預，觀察比較不同組別的肺組織損傷、細胞凋亡及氧化應激的相關(guān)指標，研究YHTJF對LI/RI有無影響以明確治療效果，并闡明藥物作用是否與干預氧化應激有關(guān)。

本研究將為深化、豐富中醫(yī)病絡(luò)理論體系提供科學依據(jù)，奠立“毒邪”損絡(luò)、“病絡(luò)”生成的病理生理基礎(chǔ)，為從“毒損肺絡(luò)” 論治再灌注肺組織細胞凋亡，以及中醫(yī)藥提高肺移植存活率提供新的思路和方法。本課題研究尤其在弘揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學、發(fā)展中西醫(yī)結(jié)合上具有重大的社會意義，不僅為臨床實踐提供有效的、易行的防治LI/RI的手段，而且將拓展YHTJF的臨床應用，具有非常廣泛的應用前景，并將產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益。

1 材料與方法1.1 動物和主要試劑

SPF級C57BL/6J成年雄性小鼠，體重(21～25)g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK(浙)2012-075。

YHTJF(北京中醫(yī)藥大學組方，黃芪甲苷和虎杖苷購于成都思科華生物技術(shù)有限公司，三七總皂苷購于廣西梧州制藥集團股份有限公司，混合后呈黃白色狀粉末，純度>98%)，經(jīng)文獻[7-11]、蒸發(fā)散射檢測儀及高效液相色譜儀分析，將3種單體依低(0.8 mg/ml 黃芪甲苷+3 mg/ml 三七總皂苷 +0.8 mg/ml 虎杖苷)、中(1.6 mg/ml 黃芪甲苷+6 mg/ml 三七總皂苷 +1.6 mg/ml 虎杖苷)、高(3.2 mg/ml 黃芪甲苷+12 mg/ml 三七總皂苷+3.2 mg/ml 虎杖苷)配比溶于含3%羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na)的PBS無菌溶液中，超聲震蕩使之完全溶解；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物分組與處理

隨機分為7組，每組10只，分別記為：正常對照組(Control, C)，羧甲基纖維素鈉+正常對照組(CMC-Na+Control，CC)，羧甲基纖維素鈉+假手術(shù)組(CMC-Na+sham，CS)，羧甲基纖維素鈉+I/R模型組(CMC-Na+I/R，CIR)，羧甲基纖維素鈉+ YHTJF低、中、高濃度干預組(CMC-Na+YHTJF-Low、CMC-Na+YHTJF-Middle、CMC-Na+YHTJF-High, CYL、CYM、CYH)。術(shù)前，C組不做任何處理，CC、CS、CIR各組術(shù)前7 d連續(xù)腹腔注射CMC-Na溶液，CYL、CYM、CYH各組術(shù)前7 d連續(xù)每日分別腹腔注射低 中、高濃度的YHTJF溶液0.2 ml/ 10 g。手術(shù)當日，C、CC組直接安樂死處死小鼠取標本；CS組只開胸，不夾閉肺門，3.5 h后安樂死處死小鼠取標本；其余4組均開胸夾閉肺門30 min，再松開動脈夾使得左肺再灌注3 h，頸動脈取血約0.8 ml術(shù)畢均安樂死處死小鼠留取肺組織。

1.3 肺W/D及TLW值測定

術(shù)畢，取小鼠左肺上葉經(jīng)漂洗、吸除表面血液和水分、稱重，記為濕重(wet weight，W)，置于70℃恒溫烤箱48 h, 稱重，記為干重(dry weight，D)。W/D比值表示肺干濕比(wet weight to dry weight of lung tissue，W/D)，計算 (W-D)/D 得總肺水含量(total lung water content，TLW)。

1.4 光鏡觀察及肺泡損傷定量指標的評估

取約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小鼠左肺下葉組織，漂洗并固定。石蠟包埋、切片，經(jīng)H&E染色后封片，光鏡(×200)下觀察肺組織的形態(tài)學變化。隨機取50個視野觀察，將肺泡內(nèi)紅細胞和(或)白細胞數(shù)目大于2個或肺泡內(nèi)水腫有液滲出者視為損傷細胞，每視野內(nèi)損傷肺泡數(shù)在總肺泡數(shù)中的百分比記作肺泡損傷定量指標(index of quantitative evaluation for alveolar damage，IQA)。

1.5 血清中 SOD、MDA、MPO 測定

再灌注結(jié)束后取小鼠頸動脈血約0.8 ml，注入空白離心管中，于4℃ 3 000 r/min 離心10 min 后取上清即為血清。分別按照試劑盒提供的說明書進行各物質(zhì)含量的測定。

1.6 TUNEL法檢測肺組織的細胞凋亡情況

依試劑盒說明書操作，光鏡(×400)下觀察計數(shù)，胞核棕褐色者記為凋亡細胞。觀察約500個細胞/片，計每100個細胞內(nèi)的陽性細胞數(shù)為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組肺W/D、TLW及IQA的變化

較之C組，CC組、CS組各項指標與C組無明顯差異，而CIR組肺W/D、TLW、IQA的值明顯升高(P<0.01)；較CIR組，CYL組、CYM組、CYH組的W/D、TLW及IQA值下降，以CYM組下降顯著，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01,表1)。

Treat-mentW/DTLWIQA(%)C1.78±0.780.78±0.595.80±1.30CC2.03±0.751.03±0.756.00±1.00CS2.23±0.581.23±0.587.00±1.23CIR7.25±2.39**6.25±2.39**74.00±7.31**CYL4.20±0.53##3.20±0.52##34.00±5.34##CYM3.54±0.37##△△2.54±0.37##△△26.20±3.35##△△CYH4.78±0.96##△△▲▲3.78±0.96##△△▲▲41.20±9.18##△△▲▲

W/D: Wet weight to dry weight of lung tissue; TLW: Total lung water content; IQA: Index of quantitative evaluation for alveolar damage; C: Control; CC: CMC-Na+Control; CS: CMC-Na+sham; CIR: CMC-Na+I/R; CYL: CMC-Na+YHTJF-Low; CYM: CMC-Na+YHTJF-Middle; CYH: CMC-Na+YHTJF-High; CMC-Na: Carboxyl methyl cellulose-Na

**P<0.01vsCS group;?##P<0.01vsCIR group;?△△P<0.01vsCYL group;?▲▲P<0.01vsCYM group

2.2 光鏡下各組肺組織形態(tài)學變化

C組、CC組和CS組的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡細胞無腫脹，肺間質(zhì)無水腫、增厚，未見炎癥細胞浸潤。CIR組的肺泡細胞腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間質(zhì)水腫、增厚，肺泡腔滲出，肺泡內(nèi)水腫滲出、紅細胞漏出及炎性細胞漏出。與CIR組相比，CYL組、CYM組、CYH組的肺泡結(jié)構(gòu)相對較完整，肺間質(zhì)水腫及炎癥細胞浸潤不同程度減輕，以CYM組減輕明顯(圖1，Alv=肺泡腔；ED=水腫，方框里標注的為肺不張)。

2.3 各組血清中SOD、MDA、MPO 測定

與 C 組相比，CC組和CS組指標均無明顯變化，而I/R 組血清 SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA 含量、MPO 活力顯著升高(P<0.05)；與 I/R組相比，用藥組的MDA 含量、MPO 表達明顯降低，SOD、CAT活性明顯升高(P<0.05)；中劑量組與其它組比較，以上數(shù)值變化最為顯著(P>0.05，表2)。

Fig. 1 The structure of the lung under light microscope (HE ×200) ALV: Alveolus； ED： Edema; □: Atelectasis A: C group; B: CC group; C: CS group; D: CIR group; E: CYL group; F: CYM group; G: CYH group

2.4 各組肺組織細胞凋亡觀察及AI的改變

C組、CC組和CS組細胞凋亡數(shù)量較少，與之相比，CIR組細胞凋亡數(shù)量明顯增多，細胞凋亡以肺血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞為主，AI亦均明顯升高，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；與CIR組相比，CYL組、CYM組、CYH組細胞凋亡減少，AI均降低，以CYM組下降明顯，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01, 表2、圖2，箭頭標注的顆粒為被染色的陽性細胞)。

Fig. 2 The apoptosis of the lung tissues under light microscope (POD ×400) A: C group; B: CC group; C: CS group; D: CIR group; E: CYL group; F: CYM group; G: CYH group

Tab. 2 Changes of the content of MDA and the activities of MPO and SOD in serum of rat in different ±s, n=5)

SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde; MPO: Myeloperoxidase; AI: Apoptotic index

*P<0.05vsCS group;?##P<0.01vsCIR group;?△P<0.05vsCYL group;?▲P<0.05vsCYM group

2.5 相關(guān)性分析

肺組織的AI與MDA、MPO的活性、W/D、TLW、IQA之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.887、0.943、0.907、0.825、0.911，P均<0.01)，與SOD的活性呈負相關(guān)(r=-0.939，P<0.01)。

3 討論

本實驗中，我們將小鼠隨機分到C、CC、CS、CIR、CYL、CYM、CYH組，每組10只。組別設(shè)置思路為控制變量：CC組和C組比較，檢測結(jié)果無明顯差異，說明羧甲基纖維素鈉作為藥物溶劑載體，對本實驗無影響；CS組和CC組比較，所測值無明顯差異，說明我們手術(shù)操作對實驗基本不會產(chǎn)生影響，因CC組和C組無明顯差異，故也可直接將CS組和C組進行比較；CIR組和CS組比較，有明顯差異，表明我們?nèi)毖?再灌注損傷模型造模較成功。以上結(jié)果成立時，說明本實驗中僅缺血/再灌注這一操作是影響小鼠肺部損傷程度的外因變量。用藥組和CIR組比較，有明顯差異，說明藥物對LI/RI模型有顯著的干預作用；將用藥組兩兩比較，有顯著統(tǒng)計學差異，表明不同用藥劑量對模型的干預作用不同，進而可篩選較為理想的用藥劑量。

研究證明，LI/RI 的一個重要的機制就是多種細胞釋放出的ROS增加的復雜的級聯(lián)反應。ROS 在肺缺血/再灌注損傷中起主要作用可以引起組織的脂質(zhì)過氧化損傷并釋放彈性蛋白酶、溶酶體酶等損傷和破壞肺組織結(jié)構(gòu)導致肺水腫。目前，臨床上常用血清中SOD、MDA、MPO的含量作為診斷肺組織細胞氧化損傷程度的常用指標。肺組織中SOD 水平能夠反映其抵抗氧自由基損傷能力，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物 MDA和MPO含量能夠間接反映細胞氧化應激損傷程度。本實驗中，與 C 組相比，CC組和CS組的氧化應激相關(guān)指標均無明顯變化，而I/R 組血清 SOD活性顯著降低(P<0.05)，MDA 含量、MPO 活力顯著升高(P<0.05)，表明 LI/RI 發(fā)生后，體內(nèi)OFR 驟增，清除能力不足，導致脂質(zhì)過氧化損傷，削弱組織抗氧化應激的能力。通過相關(guān)性分析，肺組織的AI與MDA、MPO的活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.887、0.943，均P<0.01)，與SOD的活性呈負相關(guān)(r=-0.939，P<0.01)，說明小鼠肺缺血/再灌注損傷造成的細胞凋亡和氧化應激機制密切相關(guān)。

多項研究均證實，中醫(yī)藥具有較佳的防治LI/RI的作用，已取得一定的成果[8-11]。但由于中藥復方和單味中藥其成分復雜、重整體而輕微觀的特性、藥理作用多樣以及作用機制復雜，故將中醫(yī)藥更多地應用在臨床患者身上，還需要克服很多難題。本實驗表明，在W/D、TLW檢測中，較之CIR組，經(jīng)YHTJF處理后的各用藥組標本的水腫數(shù)值指標明顯降低，中劑量用藥組標本水腫指標數(shù)值減低最為顯著，表明YHTJF可有效減輕缺血/再灌注對其造成的肺水腫，起到保護肺臟的功效，且中劑量用藥對缺血/再灌注情況下的肺保護效果最佳；通過光鏡檢測，用藥組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂情況較CIR組較大程度改善，肺泡中水腫不明顯，肺間質(zhì)增寬較CIR組減輕，紅細胞滲漏減少，炎性浸潤亦減少，表明YHTJF具有改善缺血/再灌注損傷狀態(tài)下肺組織受損結(jié)構(gòu)和功能的功能，對受損的肺有良好的保護作用；而中劑量組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果顯示IQA低于低劑量和高劑量組(P<0.01)，進一步表明，使用中劑量YHTJF時，小鼠受損的肺部結(jié)構(gòu)相對最完好，說明中劑量YHTJF對肺的保護效果最好；經(jīng)電鏡檢測，用藥組標本切片的肺泡內(nèi)核遭到破壞情況較CIR組顯著減輕，核染色質(zhì)的分布較CIR組相對均勻，板層小體的數(shù)量接近正常且形態(tài)尚完好，線粒體輕微腫脹，以上說明用藥組肺組織微觀結(jié)構(gòu)和功能相對完好，進一步說明YHTJF具有良好的保護肺組織的功能；由TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，用藥組的細胞凋亡量明顯少于CIR組，且3個用藥組中CYM組標本的凋亡細胞最少，結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果AI與W/D、TLW、IQA之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.907、0.825、0.911，均P<0.01)，表明YHTJF用藥組可有效減少因缺血/再灌注而凋亡的肺泡細胞，且使用中劑量藥物能最大程度地減少肺泡細胞凋亡。分析用藥組里中劑量組對再灌注損傷的肺保護效果最好，而高劑量組的保護作用卻降低，考慮可能的原因為隨著用藥濃度增加，其毒副作用同步增加，高劑量組起保護作用的同時，由于藥物毒副作用隨著濃度升高而加強，高濃度YHTJF會較大程度毒害肺臟。

氧化應激實驗結(jié)果顯示，與 I/R組相比，用藥組的MDA 含量、MPO 表達明顯降低，SOD活性明顯升高(P<0.05)；中劑量組與低劑量和高劑量組比較，MDA、MPO、SOD的數(shù)值變化最為顯著(P>0.05)，表明YHTJF的應用可有效抑制組織細胞的氧化應激，且中劑量用藥時抑制作用最佳。經(jīng)相關(guān)性分析，AI與MDA、MPO的活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.887、0.943，P均<0.01)，與SOD的活性呈負相關(guān)(r=-0.939，P<0.01)，進一步說明YHTJF在肺再灌注時減少OFR產(chǎn)生，并使內(nèi)源性對OFR 的清除功能增強，使組織的脂質(zhì)過氧化反應減輕，可有效抑制氧化應激造成的組織細胞凋亡，對缺血/再灌注損傷的肺有良好的保護作用。

綜上所述，YHTJF可有效減輕小鼠肺缺血/再灌注損傷，以中劑量效果為最佳，其作用機制可能與抑制體內(nèi)氧化應激反應、減輕肺組織細胞凋亡有關(guān)。因本藥只在數(shù)量有限的小鼠體內(nèi)做實驗，可能出現(xiàn)的一些副作用和其它問題尚未可知，對于將藥物應用于臨床尚需進一步研究。

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*【基金項目】河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目(132300410270)

The effects of YHTJF on lung ischemia/reperfusion injury in mice

SONG Dong1，4, HAO Mao-lin1+, XIANG Bing-qian1, LUO Zi-yin1, SHI Lu2, Wu Yiming3， WANG Wan-tie1△

(1. Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China； 2. Department of Physiology of Yibin Health School, Yibin 644000，China; 3. Division of Cardiovascular Medicine University of Iowa Carver College of Medicine， Iowa City 52242，USA;4.Department of Pathology and Forensic Medicine of KangDa College of Nanjing Medical University, Lianyungang 222000, China)

Objective: To explore whether yiqi huoxue tongluo jiedu fang (YHTJF, Traditional Chinese Medicine) alleviates the injury during lung ischemia/reperfusion (I/R) in mice through inhibiting oxidative stress or not. Methods: C57BL/6J male mice (n=70) were randomly divided into 7 groups: control (C), carboxyl methyl cellulose-Na(CMC·Na)+normal control (CC), carboxyl methyl cellulose-Na+ sham (CS), carboxyl methyl cellulose-Na+I/R (CIR), carboxyl methyl cellulose-Na+YHTJF-Low, CMC-Na+YHTJF-Middle, CMC-Na+YHTJF-High (CYL, CYM, CYH). The mice in CYL, CYM and CYH group were treated with YHTJF by intraperitoneal injection every day, while the carboxyl methyl cellulose-Na was administered with the same volume of CYL in CC, CS and CIR group. After 3 h-reperfusion, the left lung tissues were harvested to determine the lung wet/ dry weight (W/D), the total lung water content (TLW), and the index of quantitative evaluation for alveolar damage (IQA). Morphological observation and terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) were applied to evaluate the structural changes and the apoptosis index (AI) of the lung tissues. The expressions superoxide of dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA) and myeloperoxidase(MPO) in the lung tissues were detected by kits. Results: Compared with group C, the W/D, TLW, IQA, AI, lung tissue structural changes, and the expressions of MDA and MPO in group I/R were increased obviously (P<0.01), and the expression of SOD was decreased, while there was no significant difference between group CC and CS. Compared with group I/R, the parameters of these experiments in group CYL, CYM, CYH were all decreased, and the expression of SOD was increased, while the reduction in group CYM was the most remarkable among them (P<0.01). Conclusion: YHTJF may attenuate the I/R injury of the lung by the inhibition of apoptosisviaROS pathway.

YHTJF; lung ischemia/reperfusion injury; reactive oxygen species(ROS); apoptosis; mice

浙江省中醫(yī)藥重點研究計劃(2013ZZ011)；四川省宜賓市重點科技項目(2015SF035)

2016-04-28

2016-12-07

R363

A

1000-6834(2017)02-151-05

△【通訊作者】Tel： 0577-86689817； E-mail： wwt@wmu.edu.cn+：為共同第一作者