范世珍，陳旭娜，于波海，莫 莉

(深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳518034)

姜黃素通過抑制PI3K/Akt/mTOR促進SiHa細胞自噬

范世珍，陳旭娜，于波海，莫 莉

(深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳518034)

目的 研究姜黃素素誘導人宮頸癌細胞自噬的機制及對細胞功能的影響。方法 采用10,20,和30 μmol/L姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞12 h，隨后采用Western-blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路中Akt和mTOR的磷酸化水平。同時采用自噬抑制劑3-MA處理細胞，采用MTT法觀察處理前后SiHa細胞活性變化情況；ELISA檢測IFN-γ的分泌水平，Western blot檢測凋亡相關基因p53，p21和p27表達變化。結果 姜黃素能以劑量依賴性方式抑制Akt和mTOR磷酸化。同時，姜黃素也能抑制SiHa細胞增殖并誘導其分泌IFN-γ。當同時給予3-MA處理后，可明顯逆轉姜黃素對SiHa生長增殖的抑制作用，同時也能消除姜黃素誘導其分泌IFN-γ。此外，姜黃素也能上調(diào)細胞內(nèi)p53，p21和p27的表達，抑制自噬后，p53，p21和p27表達明顯減少。結論 姜黃素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR活性誘導SiHa細胞自噬，最終抑制其增殖并誘導其分泌IFN-γ及表達p53，p21和p27。

姜黃素；SiHa細胞；自噬；mTOR；PI3K/Akt

(ChinJLabDiagn,2017,21:0897)

宮頸癌是全球女性第三位常見的惡性腫瘤[1]。流行病學資料顯示，我國宮頸癌發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。根據(jù)深圳市的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中45%-47%均為未婚女性。人乳頭瘤病毒(Human papilomavirus,HPV)感染是宮頸癌的重要病原微生物[3]。盡管目前已經(jīng)有預防性疫苗問世，但宮頸癌的發(fā)生與超過15個型別的HPV感染有關，而現(xiàn)有疫苗覆蓋范圍有限。此外，目前上市的疫苗如Gardasil和Cervarx價格昂貴，對于中國等發(fā)展中國家而言疫苗接種率很低[4]。因此尋求有效的藥物控制HPV感染對于宮頸癌的防控來說具有重要意義。姜黃素(Curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)，研究證明，姜黃素除了具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用外，也可通過多種機制抑制病毒的復制[5,6]。在本課題組的前期研究當中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過誘導SiHa細胞自噬而抑制HPV的復制[7]。由于目前姜黃素抗病毒的研究還處于初始階段，關于它在誘導SiHa自噬中的確切機制尚不完全清楚。本研究旨在進一步探討姜黃素誘導SiHa細胞自噬的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

姜黃素(純度98%)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。兔抗人磷酸化mTOR和total mTOR、鼠抗人磷酸化Akt及total Akt購自Cell Signaling((Danvers,MA)，鼠抗人β-actin多克隆抗體購自Abcam(Cambridge,UK)。鼠抗人p53，p21及p27多克隆抗體購自Santa Cruz (Dallas,TX)。HPR標記二抗購自北京中山生物技術公司。胎牛血清購自南京森貝伽生物科技有限公司。IFN-γ ELISA試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司。其余分析純試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

人宮頸癌細胞系SiHa購自中科院上海細胞庫，用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2以及95%空氣的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代10-20次后，實驗設正常對照組、姜黃素組、姜黃素+3-MA組、3-MA組，分別加入姜黃素和(或2 μmol/L 3-MA)作用0-48 h，隨后提取細胞蛋白用于下一步研究。

1.3 細胞蛋白提取與Western blot分析

收集約3×106個SiHa細胞，加入預冷的裂解緩沖液(含1% Triton X-100，1%脫氧膽酸和0.1% SDS)冰上裂解30 min。蛋白濃度采用Bradford加以測定(Bio-Rad，CA，USA)。獲取50μg蛋白在12%濃度的分離膠中進行SDS-PAGE，電泳結束后將其轉印至硝酸纖維素膜上，并用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，最后分別加入相應一抗以及二抗，化學發(fā)光、顯影(Amersham Bioscience，NJ，USA)。

1.4 ELISA檢測IFN-γ分泌

SiHa細胞經(jīng)姜黃素或3-MA處理結束后，將細胞培養(yǎng)物置于-80℃，待其冷凍后再置于室溫溶解，連續(xù)經(jīng)過2循環(huán)的凍融后使細胞充分裂解，上清中IFN-γ的濃度為細胞分泌和合成的總量。其濃度測定方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進行，最后根據(jù)標準曲線計算IFN-γ的總量。

1.5 MTT檢測細胞增殖

采用MTT法分析細胞活性。即，培養(yǎng)于96孔板中的SiHa細胞(1×105/mL)，經(jīng)姜黃素和(或)3-MA作用后，棄培養(yǎng)上清，加入100 μl MTT溶液(將10 μL 10 μg/mL MTT用90 μl培養(yǎng)基稀釋)，37℃繼續(xù)孵育2 h。孵育結束后加入100 μl DMSO溶液，充分震蕩以溶解甲瓚，并于570 nm波長處測定其吸光度(μQuant,Bio-Tek)，并計算細胞相對活性，計算公式：處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 姜黃素對SiHa細胞Akt磷酸化的影響

SiHa細胞未經(jīng)姜黃素處理時，細胞內(nèi)Akt磷酸化水平較高。而經(jīng)10,20和30μmol/L姜黃素處理后，Akt磷酸化水平明顯降低，而總Akt水平無明顯變化(圖1)。

圖1 不同濃度姜黃素對SiHa細胞Akt磷酸化的影響

2.2 姜黃素對SiHa細胞mTOR磷酸化的影響

Westernblot結果也顯示，不同濃度姜黃素處理SiHa細胞后，mTOR的磷酸化水平隨著姜黃素濃度的遞增而逐漸減弱，而細胞內(nèi)總mTOR無明顯變化(圖2)

圖2 不同濃度姜黃素對SiHa細胞mTOR磷酸化的影響

2.3 姜黃素抑制SiHa細胞增殖與自噬有關

MTT結果顯示，不同濃度姜黃素處理可明顯抑制SiHa的活性。而采用自噬抑制劑3-MA處理細胞后，可明顯消除姜黃素對細胞活性的抑制效應(圖3)。

2.4 姜黃素促進IFN-γ分泌與自噬有關

不同濃度姜黃素處理后，可誘導SiHa細胞分泌IFN-γ，并呈一定的劑量依賴性，而給予3-MA處理后，IFN-γ分泌水平明顯減少(圖4)。

與對照組(0 μmol/L)相比，*P<0.05；與30μmol/L姜黃素相比，#P<0.05

與對照組(0 μmol/L)相比，*P<0.05；與30 μmol/L姜黃素相比，#P<0.05

2.5 姜黃素對凋亡相關基因表達的影響

Western blot結果顯示，姜黃素處理也能影響SiHa細胞中抑癌基因p53/p21及p27的表達水平。隨著姜黃素濃度的增加，p53、p21及p27的表達水平隨之降低，而給予3-MA處理后，可明顯削弱姜黃素對p53、p21及p27的誘導作用(圖5)。

圖5 姜黃素對凋亡相關基因表達的影響

3 討論

自噬是一種細胞自我修復和更新的生物學過程，細胞可以通過自噬過程來達到細胞內(nèi)各種成分含量的平衡穩(wěn)態(tài)，從而使細胞保持最佳的活性狀態(tài)[8]；細胞可以通過自噬過程完成細胞的分化和重塑來適應外在環(huán)境的改變及生長過程的演變。目前研究顯示，自噬在代謝平衡、抗腫瘤、抵抗微生物等方面發(fā)揮生物學作用[9]。自噬是細胞防御和應激調(diào)控的重要機制。自噬在病毒感染和機體免疫中起調(diào)控作用，自噬過程異?？梢詫е录毎劳?。許多RNA病毒和DNA病毒感染的細胞都存在自噬現(xiàn)象。自噬在宿主免疫防御中起重要作用，包括內(nèi)源性病原體的識別、降解、抗原呈遞。自噬作為宿主的防御機制，是機體防御病原體入侵的一道重要防線，在感染病毒的細胞中，病毒體和病毒蛋白、核酸均可通過異噬過程(xenophagy)被自噬體包裹并降解、消除[10]。有研究表明，HPV16病毒顆?？烧T導人包皮角蛋白細胞自噬體形成，誘導自噬相關蛋白的表達上調(diào)[11]。抑制自噬可以延長HPV16衣殼蛋白的降解，說明HPV16病毒顆粒誘導的自噬，可以通過快速降解病毒衣殼蛋白來抑制角蛋白細胞的感染[12]。另據(jù)報道，HPV與宿主細胞相互作用激活PI3K/Akt/mTOR信號途徑抑制自噬的發(fā)生，有利于HPV早期感染[13]。本課題小組前期實驗證實，姜黃素顯著抑制在宮頸癌細胞系中HPV E6/E7轉錄水平，并抑制細胞增殖，這表明姜黃素影響HPV的轉錄與復制[7]。為了證實PI3K/Akt/mTOR在姜黃素所致自噬中的作用，我們采用Western blot分別檢測了Akt和mTOR的磷酸化水平，結果顯示未經(jīng)姜黃素處理時，SiHa中Akt和mTOR磷酸化水平較高，而姜黃素處理后，Akt和mTOR磷酸化均受到抑制。鑒于PI3K/Akt/mTOR是負向調(diào)控細胞自噬的經(jīng)典通路，因此姜黃素可能通過影響PI3K/Akt/mTOR的磷酸化而誘導SiHa細胞自噬。然而姜黃素抑制PI3K/Akt/mTOR通路后通過何種機制參與自噬的發(fā)生目前尚未明了，有研究表明，mTOR主要通過其下游分子p70S6K和eIF4E調(diào)節(jié)Atgl/ULK等自噬相關分子的活性，最終發(fā)揮對細胞自噬的負性調(diào)控作用[14,15]。

由于HPV可以通過E6蛋白對p53進行降解，從而導致宿主細胞的生物學行為發(fā)生改變，因此我們隨后研究了姜黃素對SiHa生長增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)不同濃度的姜黃素處理后，SiHa增殖水平收到明顯抑制。而采用3-MA抑制細胞自噬后，可顯著逆轉姜黃素對SiHa細胞的抑制效應，這表明姜黃素是通過促進細胞自噬而發(fā)揮細胞生長抑制作用?？紤]到凋亡與自噬是細胞程序性死亡的兩個過程，既相互聯(lián)系又相互區(qū)別[16]，因此我們隨后檢測了p53、p21和p27的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理雖然能上調(diào)p53、p21和p27的表達，但抑制自噬后，可顯著消除姜黃素對p53、p21和p27的抑制效應。以上結果表明姜黃素抑制細胞增殖以及上調(diào)凋亡相關基因的表達與自噬有關，這與國外研究結果一致。

綜上所述，本研究通過證實了姜黃素通過影響PI3K/Akt/mTOR通路的活性而促進SiHa自噬的發(fā)生，后者最終通過影響細胞增殖，增強p53和p27抑癌基因活性等一系列活動，從而發(fā)揮抗病毒作用。在隨后的研究中，我們將對mTOR下游分子開展深入探討，以進一步明確自噬抑制HPV陽性宮頸癌的分子機制。

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Curcumin inhibits PI3K/Akt/mTOR pathway to induce SiHa cells autophagy

FANShi-zhen,CHENXu-na,YUBo-hai,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TraditionalChineseMedicalHospitalofFutian,Shengzhen518034,China)

Objective This study was designate to investigate the mechanism of Curcumin in the induction of authphagy and cellular function in human cervical cancer cells.Methods The human cervical cancer cell line SiHa was cultured and stimulated with 10,20,and 30 μmol/L of Curcumin for 12 h,the phosphorylated Akt and mTOR was detected by Western blot.Then cells were incubated with the autophagy inhibitor 3-MA,the cell activity was measured by MTT,the secretion of IFN-γ was detected by ELISA,and expression of the apoptosis associated gene p53,p21 and p27 were dectected by western blot.Results Curcumin could inhibit SiHa cells phosphorylation of Akt and mTOR.In addition,curcumin could also inhibit SiHa cells proliferation and secretion of IFN-γ.Pretrement of 3-MA could significantly abrogate Curcumin-induced growth inhibition and IFN-γ production.Furthermore,Curcumin could also up-regulate SiHa cells expression of p53,p21 and p27,and this function could be reversed by 3-MA.Conclusion Curcumin could inhibit PI3K/Akt/mTOR activation to induce SiHa cells autophagy,and eventually decrease the growth activity and promote the secretion of INF-γand expression of p53,p21 and p27.

Curcumin;SiHa cells;autophagy;mTOR;PI3K/Akt

2015年深圳市科技研發(fā)資金基礎研究資助項目(JCYJ20150331091010278)

1007-4287(2017)05-0897-04

R737.33

A

范世珍，44歲，女，主任技師，從事臨床檢驗研究。

2016-09-21)