龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，吉林 長春130021)

*通訊作者

鹿茸多肽對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松預(yù)防作用的研究

龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽*

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，吉林 長春130021)

骨質(zhì)疏松癥是一類以骨量減少、骨組織微觀形態(tài)退化為特征的代謝性疾病，絕經(jīng)后婦女為骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。患骨質(zhì)疏松癥后，骨組織強度降低，增高了骨折發(fā)生的風(fēng)險，同時也會引起骨質(zhì)疏松疼痛，以腰部疼痛尤為嚴重，極大地影響了患者的生活質(zhì)量、消耗了醫(yī)療資源[1]。骨質(zhì)疏松癥已成為全球性的公共健康問題。鹿茸是脊索動物門哺乳綱鹿科梅花鹿或者馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，鹿茸多肽是鹿茸中提取的主要活性成分，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽具有刺激成骨細胞增殖分化的作用[2,3]。本實驗將探究低、中、高劑量鹿茸多肽對于去卵巢大鼠血清骨代謝指標、股骨骨密度、股骨力學(xué)指標、股骨微觀形態(tài)的影響作用，探究鹿茸多肽對于去卵巢骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物與藥品:Wistar大鼠48只，雌性，清潔級，體重量 180±10 g (由長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(吉)2012-0005)；鹿茸多肽樣品(長春中醫(yī)藥大學(xué))；阿侖膦酸鈉片，規(guī)格：6片/盒，10mg/粒(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司)。

試劑:鈣(Ca2+)測試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20152824)；堿性磷酸酶(ALP)測試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20153463)。酸性磷酸酶(ACP)測試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20158235)；骨鈣素(OC)放射免疫分析藥盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20157235)。

儀器:PUS-2018G半自動生化分析儀(普朗醫(yī)療科技公司)；BI-2000圖象分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)；美國 HOLOGIC discovery WA 骨密度測定儀；CSS-44100生物力學(xué)測試儀(長春試驗機研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 取雌性Wistar大鼠48只，應(yīng)用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪單，其中40只摘除雙側(cè)卵巢，其余8只在相同位置做切口而不摘除卵巢作為假手術(shù)組。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉10萬單位/只，連續(xù)3天給予10萬單位/只。術(shù)后15天，將摘除卵巢大鼠隨機分為模型組、阿侖膦酸鈉(陽性藥)組、鹿茸多肽低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2 藥物劑量設(shè)計 陽性對照藥阿侖膦酸鈉臨床用量10 mg/人/日，即0.14 mg/kg(人均體重按70 kg計)，折算成大鼠的等效劑量為24 mg/kg，作為該試驗陽性對照藥阿侖膦酸鈉的劑量行灌胃給藥。鹿茸中國藥典生藥推薦量為2 g/d，生藥中鹿茸提取率為0.9%，換算成大鼠的鹿茸多肽每日等效劑量為45 mg/kg。設(shè)鹿茸多肽低、中、高劑量分別為90 mg/kg,45 mg/kg，22.5 mg/kg。模型組、假手術(shù)組給予等容量的蒸餾水。以上各組進行每日灌胃，連續(xù)灌胃3個月。

1.2.3 標本采樣 末次給藥后8 h開始禁食(自由飲水)，末次給藥后24 h，用6%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)后由腹主動脈取血，3 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min，取血清。處置后取左、右兩側(cè)股骨。

1.2.4 指標檢測 血清生化指標檢測：應(yīng)用PUS-2018G半自動生化分析儀測血清中Ca2+、ACP、ALP、OC含量。股骨BMD測定：所有組別均進行股骨骨密度測定。具體步驟為：取左側(cè)股骨，按美國 HOLOGIC discovery WA 骨密度測定儀的說明書的操作步驟，將股骨放在骨密度測定儀的投影區(qū)，進行掃描，獲取骨密度數(shù)據(jù)。股骨生物力學(xué)檢測：取左側(cè)股骨，使用CSS-44100生物力學(xué)測試儀在跨距20 mm、速度5 mm/s的條件下測量其最大彎曲力、斷裂撓度的生物力學(xué)指標。骨結(jié)構(gòu)光鏡觀察：取右側(cè)股骨用10%甲醛固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，采用BI-2000圖象分析系統(tǒng)拍取骨皮質(zhì)，骨小梁靜態(tài)圖像，并測量圖像中骨皮質(zhì)平均厚度和骨小梁面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標結(jié)果

如表1所示，與模型組相比，鹿茸多肽各劑量組均對血清鈣離子水平有升高作用，且高劑量鹿茸多肽升高血清Ca2+[(2.572±0.183)mmol/L]的效果優(yōu)于中[(2.535±0.220)mmol/L]、低劑量組[(2.524±0.289)mmol/L]，同時也優(yōu)于陽性對照組[(2.497±0.251)mmol/L]；低、中、高劑量鹿茸多肽均可以降低血清ALP、ACP和OC，陽性對照組(P<0.05)。

2.2 股骨BMD、骨力學(xué)測量結(jié)果

如表2所示，鹿茸多肽高[(0.221±0.012)g/cm3]、中[0.228±0.015)g/cm3]、低[(0.221±0.012)g/cm3]劑量組相比模型組[(0.212±0.018)g/cm3]均可以明顯增高股骨BMD值(P<0.05)，而鹿茸多肽各劑量組間比較則未見顯著差異(P>0.05)。在力學(xué)測試中發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽各劑量組均可以增加股骨力學(xué)性能,而高劑量鹿茸多肽對于增加最大彎曲力[110.11±9.341)N]和斷裂撓度[3.511±0.521)mm]作用最強，且鹿茸多肽對股骨斷裂撓度增加量甚至高于假手術(shù)組和陽性對照組。

表1 鹿茸多肽對骨質(zhì)疏松大鼠(去卵巢模型)血清生化指標的影響±s，n=8)

注：與假手術(shù)組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

表2 鹿茸多肽對骨質(zhì)疏松大鼠(去卵巢模型)骨密度、骨力學(xué)、骨皮質(zhì)厚度、骨小梁面積的影響±s，n=8)

注：與假手術(shù)組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3 股骨骨微觀形態(tài)觀察測量

股骨微觀結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示，通過對微觀結(jié)構(gòu)下股骨骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積進行觀察測量發(fā)現(xiàn)，與模型組相比， 陽性對照組增加股骨皮質(zhì)厚度[(249.7±24.55對183.3±37.70) μm，P<0.01)]和骨小梁面積[(65624.3±15042.9對28424.4±9034.8) μm3，P<0.01)]具有顯著作用，鹿茸多肽各劑量組效果雖然不如陽性對照組，但仍可以顯著改善股骨骨皮質(zhì)厚度增厚和骨小梁面積(P<0.05)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一類代謝性骨病，其病理特征為骨量減少、骨皮質(zhì)變薄及骨小梁數(shù)量減少?；脊琴|(zhì)疏松癥后，骨組織力學(xué)強度嚴重下降，極大地增加了骨折的風(fēng)險。同時，骨質(zhì)疏松癥也會導(dǎo)致以腰背疼痛為主骨質(zhì)疏松疼痛，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏，是骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。

鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，《本草綱目》中記載鹿茸具有“善于補腎壯陽，生精益血，補髓健骨”的功效。鹿茸多肽為鹿茸中主要的活性物質(zhì)，近年來關(guān)于鹿茸多肽的多種藥理活性已經(jīng)有了證實，如促進傷口皮膚愈合、提高機體免疫力、促進神經(jīng)損傷再生、保護心肌細胞、修復(fù)軟骨損傷等[4-7]。呂秀華等在體外實驗中驗證了鹿茸多肽可以促進M3T3-E1細胞增殖和成骨方向表達[8]；趙長偉等通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者服用鹿茸多肽后骨質(zhì)疏松臨床癥狀發(fā)生明顯好轉(zhuǎn)[9]。本研究在構(gòu)建大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型后，利用動物實驗分析鹿茸多肽對于骨質(zhì)疏松治療情況，并將治療組分為3種劑量，評價鹿茸多肽對于骨質(zhì)疏松癥的最佳治療劑量。

注：放大倍數(shù)：400×；A為模型組；B為陽性對照組；C為假手術(shù)組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

注：放大倍數(shù)：400×；A為模型組；B為陽性對照組；C為假手術(shù)組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

血清Ca2+、ALP、ACP和OC是機體骨轉(zhuǎn)換代謝的典型標志物，通過其數(shù)值的變化可以判斷機體骨代謝水平[10]。研究發(fā)現(xiàn)，給予鹿茸多肽后，血清鈣水平明顯升高，提示鹿茸多肽利于機體對鈣離子吸收。而血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨鈣素在給藥后均有下降的作用，說明鹿茸多肽有著抑制破骨細胞活性、減少骨吸收破壞的作用。

股骨BMD、骨力學(xué)強度是評價骨質(zhì)疏松嚴重程度的最重要指標，BMD、骨力學(xué)強度的改善使得骨質(zhì)疏松患者骨折風(fēng)險大大減小，明確提升了患者生活生存質(zhì)量。鹿茸多肽顯著促進骨組織生長，利于骨沉積作用，增加了骨密度和骨力學(xué)性能。觀察骨微觀形態(tài)可以最直觀的評價骨質(zhì)疏松情況，骨質(zhì)疏松的重要病理特征為骨量的減少，通過顯微鏡下觀察測量股骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積而判斷骨量情況。鹿茸多肽可以增加骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積，說明其有著良好的改善骨質(zhì)，預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。

本實驗結(jié)果表明,鹿茸多肽對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型有顯著的預(yù)防作用， 研究中所檢測的各項指標與臨床骨質(zhì)疏松患者情況平行，可考慮將實驗成果進行臨床轉(zhuǎn)化。在我們的研究中尚未涉及鹿茸多肽對于骨質(zhì)疏松癥預(yù)防作用的機制研究，后續(xù)研究中我們將進行相關(guān)的實驗。

[1]中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會．原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南[J]．中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志,2011,4(1):2.

[2]宗 穎,劉 侗,王志穎,等.鹿茸多肽成分及其藥理作用研究[J].吉林中醫(yī)藥，2013,33(11)：1135.

[3]林建華,修忠標,吳朝陽,等.鹿茸多肽對兔骨髓間質(zhì)干細胞體外增殖的影響[J] .中華實驗外科雜志,2005,22(7):827.

[4]翁 梁，周秋麗，王麗娟，等．鹿茸多肽促進表皮和成纖維細胞增殖及皮膚創(chuàng)傷愈合[J].藥學(xué)學(xué)報，2001，36(11):817．

[5]Allen S P，Maden M，Price J S．A role for retinoic acid in regulating the regeneration of deer antlers[J]．Developmental Biology，2002，251(2):409.

[6]路來金，王克利，李立軍，等．鹿茸多肽對周圍神經(jīng)再生的影響[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2008，22 (12) :1458．

[7]齊艷萍，李和平，陳雪龍．鹿茸藥理作用的研究進展[J]．經(jīng)濟動物學(xué)報，2008，12(1):53.

[8]呂秀華，陳 偉，周 凡，等.新疆塔里木馬鹿茸多肽對小鼠前成骨細胞的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2015,22(2)：47.

[9]趙長偉.鹿茸多肽治療骨質(zhì)疏松癥的臨床觀察[J].吉林中醫(yī)藥，2006,26(2)：22.

[10]Ziablitsev DS,Larin OS.Influence of single nucleotide polymorphisms of vitamin D receptor-gene on the level of osteoassociated hormones linkage with postmenopausal osteoporosis[J].Fiziol Zh,2015,61(5):21.

1007-4287(2017)05-0890-04

2016-08-27)