劉麗波，苗 帥，韓志峰，薛錦儒，辛 華，楊 斌*

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，吉林 長春130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科;b.胸外科)

EGFR、KRAS、ALK在肺腺癌中表達的意義

劉麗波1，苗 帥2a，韓志峰2b，薛錦儒2b，辛 華2b，楊 斌2b*

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，吉林 長春130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科;b.胸外科)

間變淋巴細(xì)胞瘤激酶(ALK)融合基因是最新的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療靶點，最初于2007年被發(fā)現(xiàn)并描述[1]，這種融合來源于2號染色體短臂的內(nèi)轉(zhuǎn)位，棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4(EML4)融合于間變淋巴細(xì)胞瘤激酶(ALK)胞內(nèi)激酶域，導(dǎo)致了異常的蛋白激酶表達。它在體內(nèi)及體外都具有潛在的致癌活性[2，3]，針對這一靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑克里唑替尼(Crizotinib)可以有效的阻止其致癌活性，I期及II期的臨床試驗證實其有效率達55-70%[4]。但鑒于ALK融合基因發(fā)生的陽性率較低，采用FISH方法作為篩選手段價格昂貴，因此如何準(zhǔn)確、快速地在臨床上篩選出ALK融合基因陽性的患者顯得至關(guān)重要。本研究根據(jù)EML4-ALK融合基因的臨床病理特點，選擇肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙的患者為研究對象，設(shè)計了一個新的臨床檢測路線，使得EML4-ALK融合基因檢測陽性率明顯提高，為普及開展EML4-ALK融合基因檢測提供了一個思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院及吉林大學(xué)第四醫(yī)院2013-2015年手術(shù)切除和經(jīng)皮肺穿刺活檢病理確診的96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者石蠟包埋組織。年齡32-77歲，平均年齡59歲；男性23例(24.0%)，女性73例(76.0%)。所有病例術(shù)前均未行化療、放療或靶向治療。按2009 國際肺癌研究學(xué)會( IASLC) 公布的第7 版肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期6例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期65 例，Ⅳ期13例。另選取2013-2015年吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌56例作為ALK檢測對照，年齡46-73歲，平均年齡55歲；男性34例(60.7%)，女性22例(39.3%)。其中腺癌34例、鱗癌20例，其它2例。

1.2 方法 (1) 用ARMS方法檢測肺癌組織中EGFR、KRAS基因突變:檢測樣本HE 切片經(jīng)由病理科醫(yī)生選擇基因檢測的腫瘤區(qū)域切取石蠟切片。按說明書提取DNA。EGFR、KRAS基因突變檢測:采用武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司研發(fā)的人類EGFR、KRAS基因突變檢測試劑盒( 熒光PCR法) (ARMS)，檢測EGFR基因18-21 外顯子29種突變，KRAS基因12和13密碼子上7種突變，按試劑盒說明書進行操作。(2)FISH 方法檢測EML4-ALK 融合基因:FISH 試劑盒由雅培分子公司提供，F(xiàn)ISH DNA 探針:Vysis 公司的LSI ALK 的雙色分離重排探針20 μl，具體實驗步驟按說明書進行。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):計數(shù)100 個完整細(xì)胞，其中異常細(xì)胞數(shù)> 15%則為陽性。異常細(xì)胞分兩種情況:①單橙與單綠信號距離重疊且重疊數(shù)≥1，另有單橙信號出現(xiàn);②單橙與單綠信號距離>2。

1.3 檢測順序 首先檢測EGFR突變。排除EGFR突變檢測陽性標(biāo)本后，剩余標(biāo)本(即EGFR突變野生型標(biāo)本)第二步進行K-Ras突變檢測。排除K-Ras突變檢測陽性標(biāo)本后，剩余標(biāo)本(即EGFR突變及K-Ras突變雙陰性標(biāo)本)第三步再進行EML4-ALK融合基因突變檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，EGFR基因突變、K-Ras突變和EML4-ALK融合基因各組間表達水平與各臨床病理參數(shù)之間的比較采用χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗或Fisher 精確概率。EML4 -ALK檢測實驗組與對照組之間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變狀況及與臨床特征的關(guān)系 96例患者中，39例(40.6%)患者攜帶EGFR突變，EGFR野生型57例(59.4% )。見表1。 統(tǒng)計學(xué)分析顯示，EGFR突變患者與野生型患者年齡無差異(中位年齡:57歲vs.57.5歲，P=0.958。女性患者EGFR突變率顯著高于男性(34/73,46.6% ;5/23,21.7%,P<0.05)。不同分期患者EGFR突變率無差異(P=0.187)。

表1 EGFR突變情況

2.2 KRAS基因突變與臨床特征的關(guān)系 57例EGFR突變野生型患者20例(35.1%)攜帶KRAS突變，其中12密碼子突變17例，13密碼子突變3例。KRAS突變患者與野生型患者年齡無差異(59歲vs 57歲，P=0.348)，男性和女性KRAS突變率無差異(8/18,44.4%；12/39,30.8%,P=0.315)，不同分期患者間KRAS突變率無差異(P=1.000)。

2.3 EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者EML4-ALK融合基因檢測結(jié)果 37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)。統(tǒng)計分析顯示，ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。男性和女性患者中ALK陽性率無差異(2/10,20.0%;6/27,22.2%,P=1.000)。不同分期患者ALK陽性率也未見差異(P=1.000)。8例FISH陽性腫瘤中，6例(75.0%)為紅綠分離信號，2例(25.0%)為單紅信號。

2.4 EGFR，KRAS，EML4-ALK在特定人群中分布比例 對96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者進行了EML4-ALK,EGFR,KRAS的檢測，發(fā)現(xiàn)在中國肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%),KRAS (20/96,20.8% ),EML4-ALK (8/96,8.3% )?？偟膩碚f，約69.7%的中國肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者存在以上三種基因的突變。

2.5 EML4-ALK融合基因檢測對照組結(jié)果 56例非小細(xì)胞肺癌患者，2例(3.6%，2/56)ALK陽性，均為腺癌患者。2例FISH陽性腫瘤中均為紅綠分離信號。

2.6 EML4-ALK融合基因檢測實驗組與對照組的陽性率比較 實驗組(21.6%，8/37)與對照組(3.6%，2/56) ALK陽性率統(tǒng)計分析，差異具有顯著性(P<0.05)。

3 討論

個體化治療及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展極大地改善了晚期非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，尤其是具有明確驅(qū)動基因的患者[5]。EGFR基因突變、K-Ras突變和EML4-ALK融合基因是肺癌尤其是NSCLC中最為常見突變類型，并已成為肺癌分子靶向治療中的重要靶點。EGFR突變檢測及其EGFR-TKI的使用是非小細(xì)胞肺癌治療史上里程碑式的進展。繼EGFR之后，ALK重排也己成為非小細(xì)胞肺癌尤其是肺腺癌中一個非常重要的分子亞型[6]。但由于ALK融合基因發(fā)生的陽性率較低，如何準(zhǔn)確、快速的在臨床上篩選出ALK融合基因陽性的患者顯得至關(guān)重要。隨著有關(guān)分子標(biāo)志物及其在NSCLC中預(yù)后和治療價值的認(rèn)識的發(fā)展，將對更普遍的分子標(biāo)志物進行檢測整合進我們?nèi)粘５呐R床工作中是十分必要的。Horn和Pao[7]建議基于基因突變在NSCLC中的普遍性及意義，序貫性的檢測KRAS，EGFR和EML4-ALK融合基因突變。因為沒有數(shù)據(jù)支持在初始檢測中只檢測KRAS或EGFR突變，國外還有學(xué)者[8]建議同時進行KRAS和EGFR檢測。雙陰性患者再進行ALK重排檢測。

因為東亞人群與西方高加索人群存在基因突變的差異[9]，東亞患者的K-Ras突變沒有高加索人群所占比例高[10-14]，而且K-Ras突變在實際的臨床工作中的意義沒有EGFR突變的意義大，首先檢測K-Ras突變陰性的患者還要檢測EGFR突變檢測，延遲了患者的治療，同時限于標(biāo)本量有限，經(jīng)過多次取材后會對以后的結(jié)果產(chǎn)生影響。并且由于K-Ras突變與EGFR突變兩者是互斥的，也沒有必要初始同時進行兩種突變的檢測。本研究建議首先檢測EGFR突變，如果為陽性，則可以直接進行EGFR-TKI靶向治療。如果為陰性再進行K-Ras突變檢測，因為K-Ras突變發(fā)生率明顯高于EML4-ALK融合基因突變，且兩者互斥，可以將K-Ras突變檢測作為另一種排除手段，這樣又可以排除掉一部分病例。如果K-Ras突變?yōu)殛幮栽龠M行EML4-ALK融合基因突變檢測[15]，這樣在排除大部分病例的情況下就可以大大提高其檢出陽性率，在標(biāo)本量有限，節(jié)約檢查成本的前提下篩查出這部分患者，為靶向治療做準(zhǔn)備。

本研究中，對96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者進行了EML4-ALK,EGFR,KRAS的檢測，39例(40.6%)患者攜帶EGFR突變，EGFR野生型57例(59.4% )。女性患者EGFR突變率顯著高于男性(34/73,46.6% ;5/23,21.7%,P<0.05)。57例EGFR突變野生型患者20例(35.1%)攜帶KRAS突變，其中12密碼子突變17例，13密碼子突變3例，各臨床特征之間無差異。37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)，ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。在中國肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%),KRAS (20/96,20.8% ),EML4-ALK (8/96,8.3%)?？偟膩碚f，約69.7%的中國肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者存在以上三種基因的突變。

37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者采用了FISH法檢測其ALK基因的重排狀態(tài)，8例(8.3%) ALK陽性。56例非小細(xì)胞肺癌患者作為檢測對照組，2例(3.6%) ALK陽性。兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明這種檢測流程能夠明顯提高檢出的陽性率。

通過本研究我們獲得了在我國特定的人群中(肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者)EGFR,KRAS，EML4-ALK的分布情況，同時采用特定的檢測流程可以明顯提高EML4-ALK融合基因檢出的陽性率，節(jié)約了成本，提高了效率，能夠在臨床實際應(yīng)用中得到推廣，為在我國普及開展EML4-ALK融合基因檢測提供了一個思路，為進一步開展克里唑替尼靶向治療提供了技術(shù)支持與基礎(chǔ)。

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吉林省衛(wèi)生計生委(2014ZC045)；吉林大學(xué)橫向課題吳階平基金會(3D513T073430)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0840-03

2016-09-25)