史悅怡 任儀鵬 張蕾步 榮發(fā)

口腔鱗癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中Treg水平關(guān)系的研究*

史悅怡 任儀鵬 張蕾步 榮發(fā)

目的：初步探索口腔鱗狀細(xì)胞癌患者外周血中和腫瘤微環(huán)境中Treg免疫細(xì)胞的分布狀況。方法：對(duì)我院30例未經(jīng)其他治療的60歲以上口腔鱗癌患者進(jìn)行標(biāo)本及外周血采集，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞水平，采用ch iss2004軟件統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1． OSCC患者外周血中CD4+CD25highFox P3+細(xì)胞含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。2． OSCC患者外周血中CD4+CD25highCD127low細(xì)胞含量高于正常對(duì)照。3． Treg中CD31+Treg比例OSCC患者高于對(duì)照組。4． OSCC患者腫瘤局部微環(huán)境中存在T reg的浸潤(rùn)。結(jié)論：OSCC患者存在T reg的水平異常，我們推斷Treg的浸潤(rùn)有可能抑制了全身及局部微環(huán)境中抗瘤因素的抑瘤效應(yīng)。

口腔鱗癌；Treg免疫；細(xì)胞腫瘤微環(huán)境

頭頸腫瘤每年發(fā)病超過(guò)100萬(wàn)例，約占全球成人惡性腫瘤的3%[1,2]。其中95%頭頸惡性腫瘤是鱗癌[3]。而口腔鱗狀細(xì)胞癌OSCC又在其中占約四分之一[4]。雖然放化療方法一直在進(jìn)步，但是近40年來(lái)OSCC的5年生存率卻無(wú)很大改善[5]。于是學(xué)者們開(kāi)始探索人體自身的免疫系統(tǒng)在頭頸鱗癌中的影響和機(jī)制，并且已有的研究成果發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)頭頸部鱗癌的影響很大[6,7]，其疾病進(jìn)展機(jī)制中很重要的一項(xiàng)就是對(duì)抗腫瘤免疫的免疫耐受以及免疫逃逸能力[8,9]。這提示我們必然存在調(diào)整這些免疫效應(yīng)的方法。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種抑制性T細(xì)胞，可以抑制其它T細(xì)胞的激活、增殖和效應(yīng)功能[10]。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)于有效免疫的抑制可能助長(zhǎng)了腫瘤的免疫逃逸[11,12]。鼠腫瘤的研究證明了這一點(diǎn)：剔除Treg細(xì)胞可以促進(jìn)鼠對(duì)幾種腫瘤的排斥，包括黑色素瘤、纖維肉瘤、非白血性白血病、骨髓瘤[13]。

目前對(duì)于OSCC患者的Treg分布是否存在異常還不明確。本實(shí)驗(yàn)的目的就在于初步探索OSCC患者外周血中和腫瘤微環(huán)境中Treg的分布狀況，為明確OSCC患者免疫狀態(tài)異常狀況，尋找干預(yù)方法打下基礎(chǔ)。

1．病例及標(biāo)本

1．1 血液標(biāo)本全部血液標(biāo)本取自解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科2015年10 月- 2016年4月的住院口腔鱗癌60歲以上患者。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。對(duì)照組來(lái)自輸血中心健康獻(xiàn)血者。兩組各30例?；颊哔Y料見(jiàn)表1。

表1 30例患者資料

1．2 組織標(biāo)本全部腫瘤組織標(biāo)本均取自上述30例患者，且經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌。切取腫瘤實(shí)體部分，避開(kāi)腫瘤周邊緣及壞死區(qū)域。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 標(biāo)本處理

血液樣本：空腹采取靜脈血5m l，保存于NH抗凝管，顛倒混勻六次，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行處理，術(shù)后如病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌則納入統(tǒng)計(jì)范圍。

組織樣本：所有組織標(biāo)本取出后迅速放在含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室立即按下列步驟處理：

(1)取下標(biāo)本后立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。將手術(shù)中取得的組織塊用PBS沖洗，洗去殘余的血液；

(2)然后用剪刀剪成0．1-0．2m c直徑大?。?/p>

(3)用混合的消化酶溶液(包含0．1%Ⅳ型膠原酶、0．002%I型DNA酶和0．01%V型透明質(zhì)酸酶，Sigma)在37℃下消化2小時(shí)；

(4)200目的消毒濾網(wǎng)過(guò)濾；

(5)用75%和100%fiacl液進(jìn)行密度梯度離心(1500r/m in×15m in)，離心后收集75%和100% fiacl液交界界面上的細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞；

(6)PBS洗滌，1000r/m in×10m in離心后去上清，共2次，收集沉淀細(xì)胞待用。

1．3．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)以血液樣本為例：采用兩步法標(biāo)記。組織樣本處理時(shí)提取組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，設(shè)定每管2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行抗體處理。

依據(jù)流式細(xì)胞儀操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，標(biāo)記了特異性熒光染料的單細(xì)胞懸液和鞘液，分別經(jīng)硅化管進(jìn)入流動(dòng)室，形成鞘液包裹細(xì)胞懸液的穩(wěn)態(tài)單細(xì)胞液柱，其以穩(wěn)定的層流形式通過(guò)噴嘴高速射下，液柱與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，單個(gè)細(xì)胞上標(biāo)記的熒光染料在通過(guò)激發(fā)光光斑時(shí)被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光，同時(shí)，由于混合細(xì)胞群中細(xì)胞大小和胞內(nèi)顆粒的多少會(huì)被激發(fā)而產(chǎn)生不同的散射光。被接收的光電信號(hào)被放大后進(jìn)入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、儲(chǔ)存、分析、處理，并運(yùn)用軟件程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行綜合分析從而獲得多參數(shù)數(shù)據(jù)和圖像。本研究中，每一個(gè)樣本收集分析2× 105個(gè)細(xì)胞，采用CellQuest分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并作圖。

1．4 統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)使用chiss2004軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，采用直線相關(guān)分析量指標(biāo)的相關(guān)性，P＜0．05 為有差異，P＞0．05 無(wú)差異。

2．結(jié)果

2．1 OSCC組及正常對(duì)照組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組標(biāo)本細(xì)胞中Treg含量檢測(cè)結(jié)果的比較(x±s)

2．2 OSCC患者外周血中CD4+CD25highFoxP3+細(xì)胞含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異外周血中Treg細(xì)胞含量(以CD4+CD25++FoxP3+表示)OSCC患者(5．38%±1．05%)和正常對(duì)照(4．42%±0．93%)比較，P=沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

圖1 以CD4+T細(xì)胞含量為100%進(jìn)行流式分析

2．3 OSCC患者外周血中CD4+CD25highCD127low細(xì)胞含量高于正常對(duì)照以CD4+CD25highCD127low代表Treg，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highCD127low細(xì)胞在OSCC患者外周血中含量(7．35%±1．97%)高于對(duì)照組(5．64%±0．88%)，P＜0．05(圖2)。

圖2 以CD4+T細(xì)胞含量為100%進(jìn)行流式分析

2．4 Treg中CD31+Treg比例OSCC患者高于對(duì)照組OSCC患者CD31+Treg(CD31-CD4+ CD25highCD127lowCD31+)占22．2%±1．35%，對(duì)照組CD31+Treg占16．4%±1．17%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05(圖3)。

圖3 以T reg(CD 4+CD 25highCD127low)含量為100%進(jìn)行分析

2．5 OSCC患者腫瘤局部微環(huán)境中存在Treg的浸潤(rùn)為了明確OSCC患者腫瘤微環(huán)境中是否存在Treg的浸潤(rùn)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了OSCC組織內(nèi)Treg的含量，以CD4+FoxP3+代表Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)OSCC腫瘤組織內(nèi)存在Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。以CD4+T細(xì)胞為100%，其百分含量達(dá)到20．178±5．66%(圖4)。

圖4 以CD4+T細(xì)胞含量為100%進(jìn)行流式分析

3．討論

3．1 OSCC患者外周血中Treg含量升高試驗(yàn)中我們檢測(cè)了OSCC患者外周血中Treg水平以確定OSCC患者外周血液中Treg是否存在異常，結(jié)果顯示Treg水平較正常人升高。

我們知道Treg大概可以分為兩類：直接由胸腺釋放的natural Treg(nTreg)和由外周休眠CD4+T細(xì)胞受到特異性抗原刺激并在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化而來(lái)的induced Treg (iTreg)[14,15]。很多研究表明nTreg以細(xì)胞間接觸的方式發(fā)揮抑制作用，而iTreg則是以細(xì)胞因子依賴途徑發(fā)揮抑制作用[16,17]。所以進(jìn)一步我們以區(qū)分Treg來(lái)源的CD31標(biāo)記Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)OSCC患者外周血中CD31+的來(lái)自胸腺的nTreg比例比正常組要高。這說(shuō)明外周血中的Treg水平升高主要是來(lái)自胸腺新近釋放的nTreg增多。雖然外周血中Treg細(xì)胞含量水平還是相對(duì)較低的，但總體的Treg水平提高也許提示機(jī)體處于一種免疫抑制的狀態(tài)，有效的免疫應(yīng)答受到一定的抑制，這在多大程度上以及通過(guò)何種途徑影響OSCC的發(fā)展還需要進(jìn)一步研究。

還有一點(diǎn)值得提出的是Treg的檢測(cè)方法。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的階段我們采用了CD4+CD25highFoxP3+作為T(mén)reg的選擇標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示OSCC患者和正常人外周Treg沒(méi)有差異。但是進(jìn)一步采用最近研究比較多的CD127進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)Treg水平存在差異。兩種檢測(cè)方法結(jié)果不同的原因在于在很多CD25低表達(dá)或不表達(dá)的CD4+ T細(xì)胞中, 甚至一定條件下的CD8+ T 細(xì)胞中也有Foxp3表達(dá)[18]。雖然不知道在其它疾病或者腫瘤中的狀況如何，但是我們認(rèn)為在OSCC的研究中CD4+CD25highCD127low作為篩選Treg細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn),既保證了Treg細(xì)胞的完整性,又避免了效應(yīng)性T細(xì)胞等非Treg細(xì)胞的干擾[19]。

3．2 OSCC腫瘤微環(huán)境中存在Treg的浸潤(rùn)前期研究發(fā)現(xiàn)了OSCC患者外周血Treg水平升高，但在總體免疫細(xì)胞中占比較低，雖然這說(shuō)明了機(jī)體存在明顯的免疫異常，但是在局部組織內(nèi)的免疫狀況如何卻不清楚。畢竟局部的免疫微環(huán)境更加直接的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。所以我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了OSCC患者腫瘤組織內(nèi)的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞TILs。發(fā)現(xiàn)局部腫瘤組織內(nèi)存在明確的Treg浸潤(rùn)并且水平較高，達(dá)到了20%的比例水平。其原因可能是外周細(xì)胞的聚集，也可能是局部微環(huán)境利于Treg的分化?？傊甌reg的浸潤(rùn)機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步探索。既往研究中提示初始CD4+T在TGF-β單獨(dú)作用下可以向Treg分化或許是機(jī)制之一[20]。

4．結(jié)論

綜上所述，OSCC患者存在Treg的水平異常，在外周血中水平升高，在瘤組織內(nèi)存在浸潤(rùn)現(xiàn)象，根據(jù)以往的研究結(jié)果我們提出Treg的浸潤(rùn)有可能抑制了全身及局部微環(huán)境中抗瘤因素的抑瘤效應(yīng)。在后續(xù)的研究中應(yīng)該著眼于這兩類因素的平衡，找到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控靶點(diǎn)，使其向著控制腫瘤生長(zhǎng)的方向發(fā)展。參考文獻(xiàn)

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Study on the relationship between Treg level in peripheralb lood and tumorm icroenvironment of patientsw ith oral squamouscell carcinoma

SHI Yue-yi,REN Yi-peng,ZHANG Lei,BU Rong-fa(Department of Stomatology,Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853,China)

Objective:o investigate the distribution of Treg immune cells in peripheral blood and tumor m icroenvironment of patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC). M ethods:30samples of primary OSCC cancer patients were analyzed w ith flow cytometry for Treg expression. Result:1. There was no significant difference in CD4+CD25highFoxP3+ cells between the venous blood groups and control groups. 2. The CD4+CD25highCD127lowcells in venous blood groups were higher than control groups. 3. The proportion of CD 31+Treg of Treg in OSCC was higher than control groups. 4. There was Treg infiltration in local m icro-environment of OSCC patients. Conclusion:OSCC patients w ith abnormal levels of Treg, w e infer that the infiltration of Treg may inhibit the anti-tumor effects of anti-tumor factors in the whole body and local m icroenvironment.

oral squamous cell carcinoma;T-cell Infiltration;tumor micro-environment

R782

A

1672-2973(2017)02-0077-05

2016-10-26)

史悅怡 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科碩士生北京100853

任儀鵬 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科主治醫(yī)師北京100853

張蕾解 放軍總醫(yī)院口腔頜面外科副主任醫(yī)師北京100853

步榮發(fā) 通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科主任醫(yī)師教授北京100853