蔡洪楨 賀慧霞 王飛翔 張紹清

人牙周膜干細胞與人牙髓干細胞的表型及生長特性比較*

蔡洪楨 賀慧霞 王飛翔 張紹清

目的：比較人牙周膜干細胞(human Periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)和牙髓干細胞(human Dental pulp stem cells, hDPSCs)的表型及生長特性，為深入研究這兩種細胞生物學(xué)特性提供依據(jù)。方法：組織塊法培養(yǎng)獲得原代人牙周膜細胞和牙髓細胞，采用有限稀釋法分別對兩者克隆化培養(yǎng)、分離純化得到hPDLSCs和hDPSCs，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、CCK8法檢測細胞生長活性并繪制兩者生長曲線、流式細胞技術(shù)檢測干細胞表面標志物，分析比較兩種細胞集落形成率(colony formation ratio，CFR)。結(jié)果：hPDLSCs和hDPSCs鏡下形態(tài)相似，生長曲線均呈“S”形，牙周膜細胞中STRO-1表達hPDLSCs陽性率為15．88±0．48%，牙髓細胞中STRO-1表達hDPSCs陽性率為11．86±0．43%，兩者無顯著性差異。兩種干細胞均陽性表達間充質(zhì)干細胞( M esenchymal stem cells，MSCs)表面標志物STRO-1、CD29、CD 44、CD90、CD73和血管內(nèi)皮標志物CD105，其中STRO-1、CD29、CD 90、CD 73、CD 105及CD166百分率達90%以上，陰性表達造血干細胞表面標志物CD34和CD45。hDPSCs的集落形成率(4．31±0．08%)顯著高于hPDLSCs的集落形成率(2．68±0．06%) (P＜0．05)。結(jié)論：hPDLSCs和hDPSCs細胞的形態(tài)相似，均高表達MSCs表面特異性標志物，hDPSCs的集落形成率顯著高于hPDLSCs，說明hDPSC自我更新能力較hPDLSCs強，可為深入研究這兩種干細胞提供實驗依據(jù)。

人牙周膜干細胞；人牙髓干細胞；表型

人牙周膜干細胞(human Periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)和牙髓干細胞(human Dental pulp stem cells, hDPSCs)均具有間充質(zhì)干細胞(Mesenchym al stem cells，MSCs)的生物學(xué)特性，有自我更新和多向分化潛能[1,2]，可向成骨樣細胞、成軟骨樣細胞及成脂樣細胞等多種細胞分化[3,4]，這種特性使hPDLSCs或hDPSCs替代骨髓基質(zhì)干細胞修復(fù)組織缺損成為可能，從而為干細胞的臨床應(yīng)用提供更多選擇，在口腔再生醫(yī)學(xué)研究中有很大的應(yīng)用前景。

本實驗培養(yǎng)克隆hPDLSCs和hDPSCs，并對它們的形態(tài)、生長曲線、干細胞表面標志物及細胞集落形成率(colony form ation ratio, CFR)進行分析比較，為后續(xù)實驗選擇理想干細胞來源時提供實驗依據(jù)。

1．材料和方法

1．1 樣本收集經(jīng)患者或監(jiān)護人的知情同意，收集18-25歲因正畸需要拔除的完整雙尖牙或第三磨牙，排除齲壞、根尖病和牙周病的患牙。

1．2 主要儀器及試劑胎牛血清、牛血清白蛋白(Diagnostic Grade，BSA)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗及PBS(均購自Hyclone公司，美國)，CCK-8試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)有限公司)，試劑盒STRO-1、IgM-FITC、CD29-PE、CD44-APC、CD34-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE、CD166-PE和CD45-PE (均購自BD公司，美國)，4%多聚甲醛(Solarbio)；酶標儀(M 5,MDS,美國)，倒置相差顯微鏡(Leica，德國)，圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS，日本)；流式細胞儀(FACSCalibur，BD Bioscience，美國)，無菌細胞培養(yǎng)室標配(超凈臺，離心機，培養(yǎng)箱等)。

1．3 實驗方法

1．3．1 細胞培養(yǎng)及干細胞純化擴增

hPDLCs培養(yǎng)：取18-25歲拔除的第三磨牙，參照文獻[5,6]采用組織塊法原代培養(yǎng)，簡述如下：清理牙結(jié)石及清除牙齦組織，牙冠朝下用含1%雙抗的PBS液反復(fù)沖洗，無菌條件下刮取根中三分之一牙周膜，剪碎，離心棄上清液，鋪T25培養(yǎng)瓶，倒置加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4h翻瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞匯合達80%時傳代。

hDPCs培養(yǎng):取前述已刮除牙周膜組織的牙齒，參照文獻[2,7]方法原代培養(yǎng)hDPCs，操作要點如下：無菌條件下劈開牙冠，取出牙髓，用含1%雙抗的PBS液反復(fù)漂洗后剪碎，后續(xù)步驟同hPDLCs原代培養(yǎng)。

有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化、擴增hPDLSCs和hDPSCs：參見文獻[8]分別收集的對數(shù)生長期人牙周膜細胞和牙髓細胞培養(yǎng)的上清液制作適應(yīng)性培養(yǎng)基;分別對人牙周膜細胞和牙髓細胞進行消化離心去上清液，加適量適應(yīng)性培養(yǎng)基吹打后過細胞篩制備成單個細胞占細胞懸液的90%以上的細胞懸液,調(diào)整細胞密度并計數(shù),使其為10-15個/m l,以100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h及48h后標記單個細胞孔,并補液至200μl/孔,接種第6天半量換液，此后3 天換一次液，光鏡下觀察克隆形成情況。培養(yǎng)7-14d,至出現(xiàn)細胞克隆(細胞數(shù)≥50為判定標準),待細胞克隆至孔底1/2-2/3后用0．25%不含EDTA的胰酶消化離心去上清液,轉(zhuǎn)移至48孔板擴大培養(yǎng),如是擴到24、12、6孔板，后轉(zhuǎn)入6cm、10cm培養(yǎng)皿、T25培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪至瓶底80%左右時胰酶消化離心去上清液，再轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，至此得到第8代干細胞，按實驗所需，如前制備成單細胞懸液，細胞計數(shù)，使其細胞總量大于1×107/m l，后續(xù)實驗備用。另各取hPDLSCs和hDPSCs兩珠繼續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察10余代。余下消化轉(zhuǎn)入凍存管梯度降溫進液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 細胞生長增殖曲線測定分別將hPDLSCs和hDPSCs細胞懸液，調(diào)整密度為1× 104/ m l接種于96孔板中，分12組，每組設(shè)4個復(fù)孔；24h后每天取一組，吸棄待檢測孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加含10%CCK-8液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基0．1m l，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下避光孵育4h后，于酶標儀450nm波長處測吸光度(OD)值，重復(fù)4次，取均值。連續(xù)檢測10d以上,分別以細胞培養(yǎng)時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1．3．3 流式細胞儀(flow cy tometry，F(xiàn)CM)分析Stro-1陽性hPDLSCs和hDPSCs：分別取備用h PDLSCs和hDPSCs細胞懸液，細胞計數(shù)，使其細胞總量大于5×106，分別加入含5%BSA、20μl純化stro-1一抗體孵育液300μl，4℃避光孵育30m in, PBS清洗3次，去除殘留的抗體，重懸后避光條件下加入1∶32稀釋的異硫氰酸鹽熒光素(FITC)結(jié)合的IgM二抗(即IgM-FITC)在4℃條件下避光孵育30m in，然后進流式細胞儀進行檢測。

另取備用hPDLSCs和hDPSCs細胞懸液，調(diào)整密度至1×106/ m l，重懸并計數(shù)，按測試每種抗體需要1×105個細胞的要求將細胞懸液分裝EP管中，依次標記，每組4管；嚴格按照試劑盒操作說明分別與CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146及CD166相應(yīng)同型抗體濃度為0．2mg/m l的CD29-PE-A、CD34-PE、CD44-APC-H 7、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE-A、CD146-PE、CD166-PE。蓋緊EP管，封口膜封口；放入轉(zhuǎn)盤中4℃條件下避光孵育50m in，PBS洗滌重懸，1600r/m in離心5m in，棄上清；重加PBS重懸過濾后采用流式細胞儀進行細胞表面標志物鑒定分析。

1．3．4 細胞集落形成率(colony form ation ratio，CFR)檢測

取對數(shù)生長期人PDLSCs和DPSCs細胞，常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液并反復(fù)吹打，充分分散細胞使單個細胞百分率在95%以上，各按照每皿5u l含50、100、200個細胞的濃度將細胞懸液接種到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，水平方向輕輕晃動培養(yǎng)皿使細胞分散均勻。置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每日鏡下觀察培養(yǎng)板中細胞集落形成情況，期間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時更換新鮮培養(yǎng)液，3周終止培養(yǎng)，棄原液，PBS洗2遍，以4%多聚甲醛液固定20m in，棄之，PBS洗3遍，加適量甲苯胺藍染色液染色15m in，PBS洗去染色液，空氣干燥后，進行細胞克隆集落計數(shù)，以≥50個細胞為一個集落計數(shù)，集落形成率計算方法：

集落形成率(%)=(集落數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果用SPSS22．0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，檢測結(jié)果以x±s 表示，STRO-1干細胞陽性表達及CFR檢測結(jié)果組間比較，采用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2．結(jié)果

2．1 倒置相差顯微鏡下觀察

2．1．1 細胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)第4d,見hPDLCs從組織塊周邊爬出，多呈紡棰形或長梭形，放射狀排列，胞突細長，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻、豐富，彼此間成星網(wǎng)狀形連接排列(圖1)；原代培養(yǎng)的hDPCs第6d始見組織塊周邊爬出，呈短梭形或三角形,散布于組織塊周圍,胞突鈍圓，胞體豐滿，胞漿均勻、豐富，彼此間相對分散排列(圖2)。

圖1 原代培養(yǎng)4d的hPDLCs(×40)

圖2 原代培養(yǎng)6d的hDPSCs(×40)

2．1．2 有限稀釋法克隆化純化培養(yǎng)、擴增干細胞hPDLSCs在鏡下呈長梭形或三角形，呈放射狀排列，細胞之間排列疏密結(jié)合(圖3)；hDPSCs短三角形或紡棰形，旋渦狀排列，細胞間排列緊致(圖4)。第二代后h PDLSCs和hDPSCs增殖速度快，7-14d部分細胞匯成小集落，10-15d達到匯合，見細胞胞體豐滿，胞漿豐富，狀態(tài)良好。兩干細胞各傳10余代，見其傳代能力皆十分旺盛和穩(wěn)定，各代細胞形態(tài)和生長狀態(tài)大體趨一致，胞體豐滿、胞漿豐富、胞質(zhì)均勻清晰，生長狀況良好。

圖3 分離純化中的hPDLSCs (×100)

圖4 分離純化中的hDPSCs (×100)

2．2 細胞生長增殖曲線CCK-8檢測結(jié)果顯示分離的h PDLSCs 的生長曲線呈S形，包含潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，細胞對數(shù)生長期在第2-7d，吸光度值近7．54，其后進入平臺期(圖5)；hDPSCs生長曲線也呈S形，同樣包含潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，開始的時2d為潛伏期，細胞生長緩慢，細胞增殖從第3d開始加速，進入對數(shù)生長期，至第7d后細胞增殖減緩，約2d時間，吸光度值達7．63，其后細胞增殖進入平臺期。

圖5 人PDLSCs與DPSCs生長增殖曲線比較(兩組細胞相同時間點的吸光度值比較P＞0．05，無統(tǒng)計學(xué)差異)

2．3 FCM分析經(jīng)組織塊法培養(yǎng)所得人牙周膜細胞中STRO-1表達hPDLSCs的陽性率為15．88±0．48%，人牙髓細胞中STRO-1表達hDPSCs陽性率為11．86±0．43%，兩者無顯著性差異(P＞0．05)。流式細胞分析圖中，兩種干細胞STRO-1表達均為陽性，對間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)表面標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD146及CD166和血管內(nèi)皮標志物CD105均高水平表達，低表達造血干細胞表面標志物CD34和CD45(圖6),各標志物陽性表達百分率詳情見(表1)，與干細胞表面標志物表達一致，說明兩者具有干細胞的特性。

圖6 人PDLSCs與DPSCs表面標志物的表達(前10圖為h PDLSCs的相關(guān)表面標志物的表達，后10圖為hDPSCs的相關(guān)表面標志物的表達)

表1 兩種細胞表面標志物表達

2．4 CFR測定兩干細胞于7-14d有細胞集落形成，鏡下觀見細胞形態(tài)呈短梭形，體積較小，排列疏密相間，中心細胞界限不清，形狀不規(guī)則，周邊細胞呈梭形或三角形(圖7)。hPDLSCs STRO-1細胞的CFR為2．68±0．08%，hDPSCs STRO-1細胞的CFR為4．31±0．08%，兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)(圖8)。

圖7 細胞集落鏡下觀(×100)

圖8 人STRO-1PDLSCs與DPSCs集落形成率比較(P＜ 0．05，有統(tǒng)計學(xué)差異)

3．討論

口腔再生醫(yī)學(xué)是通過對牙周組織、牙髓等口腔頜面部組織進行再造和重生方法，來修復(fù)由牙周病、牙髓病及頜面創(chuàng)傷等疾病所造成的組織缺失，是一種替代治療方法，通過組織結(jié)構(gòu)具備的再生功能來改善傳統(tǒng)治療的缺點[9,10]，組織中的干細胞具有在機體內(nèi)外因素作用下不斷進行自我更新和分化活動的有克隆形成能力的未分化細胞，具有對損傷組織的修復(fù)和穩(wěn)定功能[11]。人牙周膜干細胞(hPDLSCs)和牙髓干細胞(hDPSCs)都是牙源性成體干細胞，具有多向分化、高度增殖及自我更新的生物學(xué)特性，可以從醫(yī)療廢棄物如正畸需要拔除的牙、多生牙、埋伏牙、阻生拔除的智齒等中獲得，逐漸成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究干細胞的重要來源，在牙周牙髓等口頜面創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生及重建中表現(xiàn)出越來越廣闊的應(yīng)用前景，具有重要的轉(zhuǎn)化研究價值。組織再生過程的關(guān)鍵是組織缺損區(qū)域有足夠數(shù)量的相關(guān)功能細胞遷移并發(fā)揮干細胞招募、增殖和分化等作用來支持細胞、黏附分子和基質(zhì)構(gòu)成的微環(huán)境，從而實現(xiàn)組織重建。細胞原代培養(yǎng)的方法有組織塊貼附法和酶消化法兩種，相對酶消化法，細胞經(jīng)組織塊貼附法培養(yǎng)損傷較小。有研究[12]認為組織塊貼附法更易于細胞析出貼壁，且細胞生物學(xué)特征更穩(wěn)定。加之人牙周膜和牙髓組織體積小，故更合適采用貼附法進行人牙周膜細胞和牙髓細胞原代培養(yǎng)。但組織塊貼附法培養(yǎng)原代細胞，易混有其他如上皮樣細胞、牙髓成纖維細胞和牙周膜成纖維細胞等，因干細胞具有體外克隆化生長的特性，為進一步分離純化人牙周膜干細胞和牙髓干細胞，本實驗中，我們采用實驗條件要求簡單、花費少的有限稀釋法分別對兩細胞進行克隆化培養(yǎng)，從混合細胞中分離、克隆純化干細胞，形成克隆的人牙周膜干細胞和牙髓干細胞。我們通過兩細胞克隆實驗觀察到兩種細胞均可克隆樣生長，形成克隆集落，在一定程度上說明人牙髓干細胞與牙周膜干細胞類似，均表現(xiàn)干細胞的一些基本特性，實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)hPDLSCs和hDPSCs細胞形態(tài)表現(xiàn)十分相似，生長模式相近；兩干細胞各傳10余代，傳代能力仍十分旺盛和穩(wěn)定，各代細胞形態(tài)和生長狀態(tài)大體趨一致，胞體豐滿、胞漿豐富、胞質(zhì)均勻清晰，生長狀況良好，適合作為各干細胞的種子來源，能保證實驗的可靠性和重復(fù)性。兩者各自STRO-1干細胞表達比例無顯著差異，但兩者細胞集落形成率具有顯著差別，說明hDPSC自我更新能力較強，內(nèi)環(huán)境更穩(wěn)定,這與賀慧霞等[13]研究結(jié)果一致，但兩種細胞作為種子細胞在牙再生中運用的差異，尚需大量的相關(guān)實驗進一步研究，本實驗可為干細胞臨床轉(zhuǎn)化運用選擇理想細胞來源時提供實驗依據(jù)，同時為牙周組織工程獲得理想的種子細胞提供了可靠的獲取方法。

牙源性組織包含著復(fù)雜的細胞群，比如成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞和間充質(zhì)細胞等，其中僅一小部分是具有自我更新能力的干細胞。賀慧霞等[14]經(jīng)人來源的STRO- 1抗體通過免疫磁珠分離系統(tǒng)對犬PDLSCs進行分離并比較兩種細胞的體外生長特性，結(jié)果顯示人與犬PDLSCs的細胞形態(tài)、生長模式相似，同時CFR檢測發(fā)現(xiàn)人STRO-1+細胞的CFR遠高于犬STRO-1+ 細胞的CFR，表明兩種細胞的基本生長特性相似，但其細胞亞群分化層次不同，不同亞群增殖能力和間充質(zhì)干細胞特異性表面標志STRO-1+表達存在差異。STRO-1是間充質(zhì)細胞的表面標志物，其陽性表達是血管來源干細胞的特征性標志[15]，常被用作鑒定牙髓干細胞和牙周膜干細胞的標志物，同時，MSCs是一種多功能分化細胞，可高表達間充質(zhì)干細胞特異的表面標記CD29、CD44、CD105、CD166和CD146(內(nèi)皮細胞表面分子，中胚層標記物)等干細胞特異性標志物，但不表達造血干細胞CD14、CD34和CD45 等特異性標志物[16]。本實驗分離純化的hPDLSCs和hDPSCs具有相似的生長特性，聯(lián)合使用多種抗體進行鑒定，細胞表面標志物表達結(jié)果與以往報道相似[17,18]，說明兩種細胞均有干細胞潛質(zhì),為深入研究兩者的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。不足的是大多數(shù)干細胞目前尚無特異的標志分子表達，需結(jié)合如細胞克隆化培養(yǎng)等其它方法進行干細胞及其細胞亞群的生物學(xué)特性異同，有待進一步深入研究。

綜上所述:人PDLSCs和DPSCs經(jīng)誘導(dǎo)克隆培養(yǎng)，結(jié)果兩細胞都具備自我更新和分化能力等干細胞潛質(zhì)，但發(fā)現(xiàn)hDPSCs相比hPDLSCs自我更新能力較強，內(nèi)環(huán)境更穩(wěn)定；兩者均表達間充質(zhì)干細胞表面標志物，具有牙源性間充質(zhì)干細胞的特點，有望成為牙周組織工程理想的種子細胞。

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The periodontal ligamentstem cellsand biological characteristicsofhuman dentalpulp stem cellsand phenotype

CAIHong-zhen,HEHui-xia,WANG Fei-xiang,ZHANG Shao-qing(Departmentof Stomatology,Chinese PLAGeneral Hospitaland Chinese PLAMedical School,Beijing 100853,China)

Objective:We aim to compare the biological characteristics and phenotypic after cultivating and separating of the human Periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) and human Dental pulp stem cells (hDPSCs). M ethods:HPDLSCs and hDPSCs w ere respectively separated and amplificated from the original generation of cultures by magnetic-activated cell selection system (MACSS). Inverted phase contrast m icroscope was employed to observe the morphology. What is more, we make use of CCK-8 method to check and draw up the grow th curves. Moreover, the expression of stem cell surface markers were analysized by flow cytometry instrument (FCM). Finally, we analyse and compare the colony formation ratio (CFR). Results:Fusiform or triangle, the morphology of hPDLSCs and hDPSCs is similar. The grow th curvesare "S" shape. The expression ratio of STRO-1 in hPDLSCs and hDPSCs is respectively 15.88±0.48% and 11.86±0.43%. There is no significant difference between the two cells. But the hDPSCs colony formation rate (4.31±0.08%) is significantly higher than that of the hPDLSCs (2.68±0.06%)(P＜0.05). Both of the tw o stem cells are positive for the CD 29, CD44, CD90 and CD105 which are characterized by the employed to distinguish hPDLSCs and hDPSCs, and we can conclude that the separated stem cells share sim ilar morphology. HPDLSCs and hDPSCs that can refresh and differentiate multi-directionally are characterized by stem cells due to the expression of stem cell markers. But the hDPSCs owns a significantly stronger colony formation rate than that of hPDLSCs, then we can make a conclusion that hDPSCs is a prom ising stem cells resource.

human periodontal ligament stem cells; human dental pulp stem cell; phenotype

R 781

A

1672-2973(2017)02-0091-06

2016-10-11)

蔡洪楨 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所碩士生北京100853

賀慧霞 通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔科主任醫(yī)師副教授北京100853

王飛翔 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所碩士北京100853

張紹清 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所碩士生北京100853