王哲穎， 隋愛華， 徐文華??， 劉成玉??， 周 泉， 王麗萍， 梁 曄

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，山東 青島 266003)

羧甲基殼聚糖及羧甲基甲殼素對TGF-β誘導(dǎo)的角膜上皮纖維化的抑制作用研究?

王哲穎1， 隋愛華2， 徐文華1??， 劉成玉1??， 周 泉2， 王麗萍2， 梁 曄2

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，山東 青島 266003)

本實驗旨在研究不同分子量的羧甲基殼聚糖 (CMCTS) 和羧甲基甲殼素 (CMCT) 對轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞纖維化的抑制作用，并初探其作用機制。MTT法檢測不同分子量的CMCTS和CMCT對人角膜上皮細(xì)胞系 (HCE) 生長增殖能力的影響；細(xì)胞劃痕實驗研究TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化過程中CMCTS和CMCT的作用；western blot方法在蛋白水平探究不同分子量的CMCTS和CMCT對角膜上皮細(xì)胞纖維化相關(guān)的TGF-β/Smad通路信號分子的影響。結(jié)果表明，在10～1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，4種多糖對HCE細(xì)胞均具有較好的相容性。此外，不論大分子還是小分子的CMCTS對TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化均具有顯著的抑制作用，其作用機制與抑制TGF-β/Smad信號通路Smad2和Smad3分子的磷酸化有關(guān)。然而，兩種分子量的CMCT均沒有抑制纖維化的作用。因此，CMCTS可以作為一種有發(fā)展?jié)摿Φ纳镝t(yī)用材料應(yīng)用于人角膜上皮損傷修復(fù)，發(fā)揮其抗纖維化的作用。

羧甲基殼聚糖； 角膜上皮； 纖維化； TGF-β

羧甲基殼聚糖 (Carboxymethyl chitosan, CMCTS) 和羧甲基甲殼素(Carboxymethyl chitin, CMCT) 是殼聚糖和甲殼素改性研究中應(yīng)用最多的衍生物之一，相較殼聚糖和甲殼素而言，CMCTS和CMCT既保留了它們的優(yōu)點，又極大的改善了其水溶性[1]。經(jīng)研究表明，CMCTS和CMCT不僅具有良好的生物相容性、生物可降解性和成膜性[2-3]，還具有抑菌、抗氧化和抗癌等多種生物學(xué)活性[4-6]。

角膜損傷修復(fù)的過程常常會導(dǎo)致纖維瘢痕的形成，在此過程中轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming growth factor-beta, TGF-β)等細(xì)胞因子的分泌升高，引起正常角膜上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是角膜纖維化過程的重要特點[7]。研究表明，CMCTS在皮膚、腹膜、跟腱、硬腦膜外等多種組織或器官中均表現(xiàn)出抗纖維化和抑制瘢痕粘連的作用[8-11]，據(jù)此推測，CMCTS和CMCT在角膜損傷修復(fù)中也可能具有抗纖維化的作用。但是這種抗纖維化作用的機制目前尚未明確。

因此，本實驗用MTT法檢測不同分子量的CMCTS和CMCT對人角膜上皮細(xì)胞系(HCE) 細(xì)胞的生長增殖能力的影響；用TGF-β體外誘導(dǎo)HCE纖維化，通過細(xì)胞劃痕實驗研究CMCTS和CMCT對TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化的抑制作用；以及通過western blot實驗從蛋白水平探究CMCTS和CMCT對角膜上皮的抗纖維化作用的機理，為其在角膜組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

不同分子量的CMCTS和CMCT：大分子CMCTS (CMCTS-1，脫乙酰度96%，相對分子量134 kDa)，小分子CMCTS (CMCTS-2，脫乙酰度96%，相對分子量42 kDa)，大分子CMCT (CMCT-1，相對分子量115 kDa)，小分子CMCT (CMCT-2，相對分子量37 kDa)均由本實驗室制備。HCE細(xì)胞源自ATCC細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器

1640培養(yǎng)基、胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 及胰蛋白酶 (美國Gibco)，噻唑藍(MTT，美國Sigma)，TGF-β (美國R&D)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

磷酸化Smad2 (phospho-Smad2, P-Smad2, Ser465/467) 抗體、磷酸化Smad3 (phospho-Smad3, P-Smad3, Ser423/425) 抗體、Smad2抗體和Smad3抗體均購自美國CST，GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 抗體購自美國Sigma。

CO2培養(yǎng)箱(芬蘭Thermo)，倒置顯微鏡(日本Olympus)，全波長酶標(biāo)儀 (芬蘭Thermo)，成像分析儀 (法國Vilber Lourmat)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞增殖率實驗 用含10% FBS的1640培養(yǎng)基將對數(shù)生長期的HCE細(xì)胞配制成5 × 104個/mL細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于CO2培養(yǎng)箱 (37 ℃, 5% CO2) 中培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度 (10、 50、 100、 500和1 000 μg/mL)的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2，對照組加入1640培養(yǎng)液，以同樣處理但不接種細(xì)胞的孔作為空白孔，每組設(shè)立3個平行孔。培養(yǎng)24 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，MTT法測定各孔在490 nm波長下的吸光度值。按下式計算細(xì)胞的相對增殖率 (relative growth rate, RGR)：

RGR(%)=(OD1-OD0)/(OD2-OD0)×100%。

其中OD0、OD1、OD2分別表示空白孔、實驗孔和對照孔的吸光度值。

1.3.2 細(xì)胞劃痕實驗 用含10% FBS的1640培養(yǎng)基將對數(shù)生長期的HCE細(xì)胞配制成1×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于CO2培養(yǎng)箱 (37 ℃, 5% CO2)中培養(yǎng)過夜，用1640培養(yǎng)基同步化處理4 h以上。將TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞預(yù)先在10 ng/mL的TGF-β中激活1 h，劃線后，分別換為新的TGF-β (10 ng/mL)和4種不同分子量的糖(10 μg/mL)+TGF-β(10 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)；非TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞劃線后，分別換為4種不同分子量的糖溶液 (10 μg/mL)，對照組直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)；分別于0、24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。按下式計算細(xì)胞相對遷移率：

非TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞相對遷移率(%) = S1/S0× 100%，

TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞相對遷移率 (%) = S3/S2× 100%。

其中S0，S1，S2和S3分別表示對照組、非TGF-β處理組、TGF-β組和糖+TGF-β處理組的細(xì)胞遷移面積。

1.3.3 Western blot實驗 將對數(shù)生長期的HCE細(xì)胞均勻接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱 (37 ℃, 5% CO2) 中培養(yǎng)過夜后，用1640培養(yǎng)基同步化處理4 h以上。將TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞預(yù)先在10 ng/mL的TGF-β中激活1 h，然后分別換為新的TGF-β (10 ng/mL)和4種不同分子量的糖(10 μg/mL)+TGF-β(10 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)；非TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞分別換為4種不同分子量的糖溶液 (10 μg/mL)，對照組直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。最后，于培養(yǎng)后1和24 h分別用含SDS的RIPA蛋白裂解液收取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，定量后取各樣本30 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后加入相應(yīng)目的蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗滌后與發(fā)光試劑反應(yīng)，用成像分析儀顯影后計算各條帶的灰度值，反映各組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)信號分子P-Smad2，P-Smad3以及總Smad2和總Smad3的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用方差分析 (one way ANOVA) 或Student′s t檢驗，P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同分子量的CMCTS和CMCT對HCE細(xì)胞增殖的影響

HCE細(xì)胞在濃度分別為10,50,100,500,1 000 μg/mL的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2中培養(yǎng)24 h后，MTT實驗結(jié)果如圖1、2中所示。各實驗組RGR與對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明當(dāng)濃度范圍在10～1 000 μg/mL時，CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2均不會對HCE的生長增殖造成影響，4種多糖對HCE細(xì)胞均具有較好的相容性。

2.2 CMCTS和CMCT對TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞遷移能力的影響

在TGF-β誘導(dǎo)下，角膜上皮細(xì)胞發(fā)生纖維化，使細(xì)胞的遷移速率增高[12]。本實驗中，分別于培養(yǎng)后0和24 h在倒置顯微鏡下觀察各實驗組和對照組HCE細(xì)胞的遷移情況并拍照。

(n = 3, mean±SD, P>0.05)圖1 不同分子量的CMCTS對HCE細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of CMCTS with different molecular weights on the growth of HCE cells

(n = 3, mean±SD, P>0.05)圖2 不同分子量的CMCT對HCE細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of CMCT with different molecular weights on the growth of HCE cells

實驗結(jié)果如圖3中所示，非TGF-β誘導(dǎo)組中，CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2的細(xì)胞相對遷移率與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明濃度為10 μg/mL的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2不會對正常HCE細(xì)胞的遷移能力造成影響。如圖4所示，在TGF-β誘導(dǎo)組中，CMCTS-1和CMCTS-2的加入會明顯降低HCE細(xì)胞的遷移速率(P<0.05)，其中CMCTS-1 + TGF-β組細(xì)胞遷移速率的降低程度最顯著(P<0.01)；而CMCT-1 + TGF-β和CMCT-2 + TGF-β組HCE細(xì)胞的遷移速率與TGF-β組相比無明顯差異(P>0.05)。

實驗結(jié)果表明，CMCTS-1和CMCTS-2具有抑制TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化的作用，從而抑制了細(xì)胞遷移速率的增高；而CMCT-1和CMCT-2不具有這種作用。

2.3 CMCTS和CMCT對角膜上皮纖維化相關(guān)TGF-β/Smad信號通路的影響

2.3.1 CMCTS和CMCT對TGF-β/Smad信號通路磷酸化水平的影響 TGF-β/Smad信號通路是角膜損傷后纖維化形成的最關(guān)鍵的分子通路[13]，本實驗在蛋白水平進一步探討了不同分子量的CMCTS和CMCT對HCE細(xì)胞TGF-β/Smad信號通路的影響。

在TGF-β/Smad信號通路中，Smad2和Smad3分子的磷酸化過程一般發(fā)生在最初的數(shù)小時內(nèi)[14]。由圖5可見，兩種分子量的CMCTS對TGF-β活化后1 h內(nèi)Smad2和Smad3分子的磷酸化均具有明顯的抑制作用，與TGF-β組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)，而Smad2和Smad3分子的總量沒有明顯的變化(P>0.05)，結(jié)果以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。并且，CMCTS-1對Smad2和Smad3分子磷酸化的抑制作用比CMCTS-2更加顯著(P<0.001)。由圖6可見，兩種分子量的CM-CT對TGF-β活化后1 h內(nèi)Smad2和Smad3分子的磷酸化和總量均沒有明顯的影響(P>0.05)，結(jié)果以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

(n = 3, mean±SD, P>0.05)圖3 非TGF-β誘導(dǎo)組HCE細(xì)胞在培養(yǎng)后0和24 h光鏡下細(xì)胞遷移情況(a)和細(xì)胞相對遷移率(b)Fig.3 Cell migration (a) and the relative migration rate (b) of HCE cells cultured without TGF-β for 0 and 24 h

(n=3, mean±SD,*P<0.05, **P<0.01。* denotes significant difference compared with the group treated only with TGF-β.)圖4 TGF-β誘導(dǎo)組HCE細(xì)胞在培養(yǎng)后0和24 h光鏡下細(xì)胞遷移情況(a)和細(xì)胞相對遷移率(b)Fig.4 Cell migration (a) and the relative migration rate (b) of HCE induced by TGF-β after cultured for 0 and 24 h

實驗結(jié)果表明，兩種分子量的CMCTS均能夠抑制Smad2和Smad3分子的磷酸化，從而阻斷TGF-β/Smad信號通路，發(fā)揮抗纖維化的作用；而兩種分子量的CMCT都不具有這種作用。

(n=3, mean±SD, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。* denotes significant difference compared with the group treated only with TGF-β.)圖5 兩種分子量的CMCTS作用1 h后P-Smad2 (a)，總Smad2 (b)，P-Smad3 (c)和總Smad3 (d) 的western blot結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of P-Smad2 (a), total Smad2 (b), P-Smad3 (c) and total Smad3 (d) treated with CMCTS-1 or CMCTS-2 for 1 h

2.3.2 CMCTS和CMCT作用24 h對TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵因子蛋白總量的影響 由圖7可見，CMCTS和CMCT作用24 h后，TGF-β誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組細(xì)胞Smad2和Smad3分子的總量均沒有明顯的差異(P>0.05)，結(jié)果以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。實驗結(jié)果顯示，CMCTS和CMCT對HCE細(xì)胞內(nèi)源性Smad2、3分子的總量和TGF-β誘導(dǎo)的TGF-β/Smad信號通路激活之后Smad2、3分子的蛋白總量均不會產(chǎn)生影響。

3 討論

本研究探討了不同分子量的CMCTS和CMCT對TGF-β誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞纖維化的抑制作用及其作用機制。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用中，生物大分子通常用于材料的制備，起到細(xì)胞或組織載體支架的作用；而小分子更容易穿過組織細(xì)胞屏障進入靶器官，直接發(fā)揮其生物活性的作用；所以本研究分別選取了不同分子量的多糖作為研究對象，以期為不同應(yīng)用方向提供更全面的理論支持。本實驗表明，不同分子量的CMCTS和CMCT對正常HCE細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的相容性，其中，兩種分子量的CMCTS對TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化均具有顯著的抑制作用，而兩種分子量的CMCT不具有這種作用。

(n=3, mean±SD, P>0.05)圖6 兩種分子量的CMCT作用1 h后P-Smad2 (a)，總Smad2 (b)，P-Smad3 (c)和總Smad3 (d)的western blot結(jié)果Fig.6 Western blot analysis of P-Smad2 (a), total Smad2 (b), P-Smad3 (c) and total Smad3 (d) treated with CMCT-1 or CMCT-2 for 1 h

除此之外，已有多項研究表明，CMCTS在多種組織或器官中表現(xiàn)出抗纖維化和抑制瘢痕粘連的作用。崔娟娟等[15]研究發(fā)現(xiàn)CMCTS能夠有效的抑制術(shù)后腹膜組織的纖維粘連，Huang等[16]證實CMCTS對燒傷后皮膚組織的瘢痕形成具有抑制作用，Ren[17]等的研究也顯示CMCTS能夠阻礙子宮角術(shù)后的粘連。但是，CMCTS抗纖維化作用的機制尚未明確，本實驗對此做出了進一步的探究。

TGF-β被認(rèn)為是角膜纖維化疾病發(fā)生的關(guān)鍵因子[18]，在眼表損傷修復(fù)過程中，其持續(xù)升高最終引起角膜上皮細(xì)胞的纖維化和眼表瘢痕形成。TGF-β/Smad信號通路是TGF-β誘導(dǎo)的纖維化過程中最主要的分子通路[19]，TGF-β通過與細(xì)胞膜表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活Smad2和Smad3分子的磷酸化，活化的P-Smad2和P-Smad3與Smad4分子結(jié)合，進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[20]。因此，本實驗以TGF-β通路Smad分子為研究的起始點，就不同分子量的CMCTS和CMCT對角膜上皮的抗纖維化作用機理進行了研究，為其在角膜損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。

進一步的實驗證明，CMCTS的抗纖維化作用與抑制了TGF-β/Smad信號通路中Smad2和Smad3分子的磷酸化有關(guān)，從而阻斷了TGF-β/Smad信號通路，發(fā)揮其抗纖維化的作用；而CMCT不具備這種性質(zhì)。同時，CMCTS或CMCT不會在磷酸化過程中以及這一過程之后，對Smad分子的總量產(chǎn)生明顯影響。然而，本研究中仍存在一些問題，體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞并不能完全等同于人角膜上皮細(xì)胞，因此，深入研究CMCTS的抗纖維化作用及機理仍需要下一步的動物活體實驗。

(n=3, mean±SD, P>0.05)圖7 CMCTS和CMCT作用24 h后TGF-β非誘導(dǎo)組總Smad2 (a)， 誘導(dǎo)組總Smad2 (b)，非誘導(dǎo)組總Smad3 (c) 和誘導(dǎo)組總Smad3 (d) 的western blot結(jié)果Fig.7 Western blot analysis of total Smad2 (a, b) and Smad3 (c, d) in TGF-β induced and non-induced groups after cultured with CMCTS or CMCT for 24 h

4 結(jié)語

本實驗研究發(fā)現(xiàn)CMCTS對TGF-β誘導(dǎo)的HCE細(xì)胞纖維化具有明顯的抑制作用，并初步證實這種抗纖維化作用與抑制TGF-β/Smad信號通路中Smad2和Smad3分子的磷酸化有關(guān)，為CMCTS在眼組織工程中的應(yīng)用提供了必要依據(jù)，同時也為探究CMCTS抗纖維化作用的機制提供了新思路。

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責(zé)任編輯 徐 環(huán)

Inhibitory Effect of CMCTS or CMCT on Corneal Epithelial Fibrosis Induced by TGF-β

WANG Zhe-Ying1, SUI Ai-Hua2, XU Wen-Hua1,LIU Cheng-Yu1, ZHOU Quan2, WANG Li-Ping2, LIANG Ye2

(1. College of Medicine, Qingdao University,Qingdao 266003, China; 2. Central Laboratory, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

In this study,carboxymethyl chitosan (CMCTS) and carboxymethyl chitin (CMCT) with different molecular weights were explored on their anti-fibrosis effect and the affecting mechanism. The effects of different kinds of CMCTS and CMCT on the growth of the human corneal epithelial cell line (HCE) were measured by MTT assay, while their anti-fibrosis effects on the migration of HCE cells were reflected by wound healing assay. The anti-fibrosis mechanism of different kinds of CMCTS and CMCT in corneal epithelia reconstruction was further studied on protein level. Results showed that CMCTS and CMCT with different molecular weights all suited the proliferation of HCE cells within the concentration of 10～1 000 μg/mL. But the two kinds of CMCTS could exert inhibitory effect on the fibrosis of HCE cells induced by TGF-β, and the anti-fibrosis mechanism was related to reducing phosphorylation of Smad2 and Smad3 protein in the TGF-β/Smad signaling pathway.Therefore, the two kinds of CMCTS could be applied in the repair of human corneal epithelial injury, playing an important role in anti-fibrosis.

carboxymethyl chitosan; corneal epithelia; fibrosis; TGF-β

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GHY115025)；山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金項目(ZR2014HP011)資助 Supported by the Science and Technology Development Foundation of Shandong Province of China(2014GHY115025); Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2014HP011)

2016-04-06；

2016-05-26

王哲穎(1991-)，女，碩士生。E-mail：qd_wzhy@163.com

?? 通訊作者：E-mail：qd_lchy@163.com；qd.wh@163.com

Q539+.7

A

1672-5174(2017)07-096-09

10.16441/j.cnki.hdxb/20160115

王哲穎， 隋愛華， 徐文華, 等. 羧甲基殼聚糖及羧甲基甲殼素對TGF-β誘導(dǎo)的角膜上皮纖維化的抑制作用研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(7): 96-104.

WANG Zhe-Ying, SUI Ai-Hua, XU Wen-Hua, et al. Inhibitory effect of CMCTS or CMCT on corneal epithelial fibrosis induced by TGF-β[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(7): 96-104.