鄭麗雪，郭晨，劉薈，王立梅，齊斌

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500）

葡萄糖、乳酸鈉對(duì)丙酸桿菌生長(zhǎng)的影響

鄭麗雪1，2，郭晨1，劉薈1，王立梅1，2，齊斌2，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500）

對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420）發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高菌體密度。結(jié)果表明，以乳酸鈉作為單一碳源時(shí)，當(dāng)乳酸鈉添加量為32 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.95；以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，當(dāng)葡萄糖添加量為8 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.242；以乳酸鈉和葡萄糖作為復(fù)合碳源時(shí)，當(dāng)碳源添加量為18.8g/L乳酸鈉+1.2g/L葡萄糖時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為2.06，這說(shuō)明，復(fù)合碳源可以有效的提高菌體密度。

費(fèi)氏丙酸桿菌；葡萄糖；乳酸鈉；優(yōu)化

近年來(lái)，天然防腐劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用受到了廣泛的重視。其中，天然防腐劑中的微生物源天然防腐劑乳酸鏈球菌素（Nisin）在1969年被FAO/WHO批準(zhǔn)為高效安全天然食品防腐劑；ε-聚賴氨酸（ε-PL）于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑，美國(guó)、韓國(guó)和日本已經(jīng)允許ε-PL應(yīng)用于食品防腐中[1]；曲酸在食品防腐保鮮等方面有著廣闊的應(yīng)用[2]；溶菌酶已廣泛的應(yīng)用于肉制品、水產(chǎn)品和乳制品等食品防腐中[2]。另外，納他霉素[3]、甲烷氧化菌素、羅伊氏菌素[4]等在食品工業(yè)中也有一定的應(yīng)用。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，丙酸桿菌代謝物也具有一定的抑菌活性[5-9]，梁新樂(lè)[10]、諸曉強(qiáng)[11]、賈彩鳳[12]等人初步探討了丙酸桿菌代謝物做為防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本文以一株費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420）為考察對(duì)象，前期的研究發(fā)現(xiàn)，該丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌、酵母菌、金葡菌及霉菌等都有一定的抑制作用[13]，本文主要研究葡萄糖、乳酸鈉對(duì)丙酸桿菌生長(zhǎng)的影響，旨在提高菌體密度為后續(xù)的培養(yǎng)基優(yōu)化，高密度培養(yǎng)等一系列實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，以下簡(jiǎn)稱為P.freudenreichii CS1420）：常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 主要儀器

DHP-9162303A-5S型電熱恒溫培養(yǎng)箱、LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海索普儀器有限公司；YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；PE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；FA604A型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；Milli-Q Advantage超純水儀：美國(guó)Millipore公司；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CR22GII型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司。

1.3 培養(yǎng)基

丙酸桿菌培養(yǎng)基（SLB培養(yǎng)基）：胰酶水解酪素10.0 g、酵母提取物5.0 g、乳酸鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.4 菌種活化

將斜面菌種劃線到平板SLB固體培養(yǎng)基上，于30℃厭氧罐中培養(yǎng)2.5 d，然后挑取平板上的單菌落劃線到斜面SLB固體培養(yǎng)基上，于30℃厭氧罐中培養(yǎng)2.5 d后取出放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化好的P.freudenreichii CS1420接種到SLB培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)32 h，每隔4小時(shí)吸取一定量的發(fā)酵液，以SLB液體培養(yǎng)基作為空白，在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光度，以此繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.6 P.Freudenreichii CS1420種子液的制備

挑取已經(jīng)活化好的斜面菌種接種到SLB培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)24 h，制成種子液備用。

1.7 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

1.7.1 葡萄糖對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以無(wú)乳酸鈉的SLB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入4、8、12、16、20 g/L的葡萄糖，分裝到5個(gè)100 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，121℃滅菌20 min。然后按照10%接種量接入活化好的種子液，30℃厭氧培養(yǎng)24 h，在600 nm下，用UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。

1.7.2 乳酸鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以無(wú)乳酸鈉的SLB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入20、24、28、32、36 g/L的乳酸鈉，分裝到5個(gè)100 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min。然后按照10%接種量接入活化好的種子液，30℃厭氧培養(yǎng)24 h，在600 nm下，用UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。

1.7.3 復(fù)合碳源（乳酸鈉+葡萄糖）對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以無(wú)乳酸鈉的SLB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入17.6 g/L乳酸鈉+2.4 g/L葡萄糖、17.8 g/L乳酸鈉+2.2 g/L葡萄糖、18 g/L乳酸鈉+2 g/L葡萄糖、18.2 g/L乳酸鈉+ 1.8 g/L葡萄糖、18.4 g/L乳酸鈉+1.6 g/L葡萄糖、18.6 g/L乳酸鈉+1.4 g/L葡萄糖、18.8 g/L乳酸鈉+1.2 g/L葡萄糖、19 g/L乳酸鈉+1 g/L葡萄糖、19.2 g/L乳酸鈉+0.8 g/L葡萄糖、19.4 g/L乳酸鈉+0.6 g/L葡萄糖、19.6 g/L乳酸鈉+0.4 g/L葡萄糖、19.8 g/L乳酸鈉+0.2 g/L葡萄糖、20 g/L乳酸鈉+0 g/L葡萄糖分裝到5個(gè)100 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，121℃滅菌20 min。然后按照10%接種量接入活化好的種子液，30℃厭氧培養(yǎng)24 h，在600 nm下，用UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.Freudenreichii CS1420生長(zhǎng)曲線測(cè)定

P.Freudenreichii CS1420生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1，0～16 h屬于該菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h～24 h生物量趨于平緩，在24 h時(shí)菌體數(shù)達(dá)到最高峰，24 h后菌體數(shù)有下降的趨勢(shì)，菌體進(jìn)入衰亡期。由此確定，P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)量最佳測(cè)量時(shí)間為24 h。

2.2 葡萄糖對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

葡萄糖對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

葡萄糖是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的碳源，所以，本文首先考察了葡萄糖對(duì)P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)的影響。由圖2可知，以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，當(dāng)其添加量為8 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.242。

圖1 P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)曲線Fig.1The growth curve of P.freudenreichii CS1420

圖2 葡萄糖對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2Effects of glucose on the growth of P.freudenreichii CS1420

2.3 乳酸鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

乳酸鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3Effects of sodium lactate on the growth of P.freudenreichii CS1420

有研究表明，乳酸鈉是培養(yǎng)丙酸桿菌最高效利用的碳源[14]。所以，本文接著研究了乳酸鈉對(duì)P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)的影響。由圖3可知，以乳酸鈉作為碳源時(shí)，當(dāng)其添加量為32 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.95。

2.4 復(fù)合碳源（乳酸鈉+葡萄糖）對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

復(fù)合碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 復(fù)合碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4Effects of complex carbon sources on the growth of P.freudenreichii CS1420

有研究表明，在含有葡萄糖和乳酸鈉的復(fù)合培養(yǎng)基中，薛氏丙酸桿菌生長(zhǎng)量最佳，并且以復(fù)合培養(yǎng)基為碳源時(shí)，丙酸桿菌代謝物抑菌活性最高[15]。所以，本研究進(jìn)一步考察了復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)的影響。由圖4可知，當(dāng)以18.8 g/L乳酸鈉+1.2 g/L葡萄糖為碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為2.06。

綜合碳源對(duì)P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)的影響看，在接種量一致的前提下，不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的P.freudenreichii CS1420生物量的大小比較：復(fù)合碳源＞乳酸鈉＞葡萄糖，而且，復(fù)合碳源不僅有效地提高菌體密度，還可以節(jié)約碳源的用量，以更少的量達(dá)到更優(yōu)的效果。

3 結(jié)論

本文考察了碳源對(duì)P.freudenreichii CS1420生長(zhǎng)的影響，得到的結(jié)論如下。

1）以乳酸鈉作為單一碳源時(shí)，當(dāng)乳酸鈉添加量為32 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.95。

2）以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，當(dāng)葡萄糖添加量為8 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為1.242。

3）以乳酸鈉和葡萄糖作為復(fù)合碳源時(shí)，當(dāng)碳源添加量為18.8 g/L乳酸鈉+1.2 g/L葡萄糖時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm為2.06。

陳玉梅[15]等的研究表明，在復(fù)合培養(yǎng)基中，薛氏丙酸桿菌代謝物的抑菌活性最高。本研究已初步考察得出復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)的P.freudenreichii CS1420代謝物的抑菌活性高于單一碳源培養(yǎng)的菌株，擬進(jìn)一步考察具體的復(fù)合培養(yǎng)基的用量對(duì)P.freudenreichii CS1420代謝物抑菌活性的影響。

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Effects of Sodium Lactate and Glucose on the Growth of Propionibacterium freudenreichii CS1420

ZHENG Li-xue1，2，GUO Chen1，LIU Hui1，WANG Li-mei1，2，QI Bin2，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

The effects of the carbon sources of the medium on the growth of Propionibacterium freudenreichii CS1420 were studied in order to increase the cell density.The results showed：the growth rate of the cell was the largest when sodium lactate was used as a single carbon source and the amount of sodium lactate was 32g/L，OD600nmwas 1.95.The growth rate of the cell was the largest when glucose was used as a single carbon source and the amount of sodium lactate was 8 g/L，OD600nmwas 1.242.The growth rate of the cell was the largest when glucose and sodium lactate were used as compounded carbons and the amount of sodium lactate was 18.8 g/L sodium lactate，1.2 g/L glucose，OD600nmwas 2.06.This showed that the composite carbon source can effectively improve the cell density.

Propionibacterium freudenreichii；glucose；sodium lactate；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.039

2016-08-10

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201610333036Y）；常熟理工學(xué)院大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目

鄭麗雪（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者