趙光遠,許艷華,陳美麗,縱 偉,*

(1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.食品生產與安全河南省協同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究

趙光遠1,2,許艷華1,2,陳美麗1,2,縱 偉1,2,*

(1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.食品生產與安全河南省協同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

以石榴渣為實驗原料,優(yōu)化石榴渣多酚提取的工藝,并研究它的抗氧化性質。在單因素實驗的基礎上,利用響應面分析法(Response Surface Methodology,RSM)中的中心組合設計對石榴渣多酚的提取條件進行優(yōu)化。用傳統的溶劑提取法提取石榴渣中的多酚類物質,并利用福林酚法測定其含量。其抗氧化性用DPPH自由基清除能力和還原能力來評價。結果表明,最佳的石榴渣提取工藝條件是:41%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h時多酚的得率最大為4.88 mg GAE/g,與預測值 5.034 mg GAE/g接近。石榴渣多酚有較強的DPPH自由基清除率,且總抗氧化性與提取的石榴渣多酚濃度呈正相關,相關系數為0.9988。

石榴渣，響應面法，多酚，抗氧化

活性氧,如過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等是身體內基礎生理代謝過程中產生的[1]。雖然正常的細胞活動需要活性氧的參與,但過多的活性氧會破壞所有類型大分子的結構,包括碳水化合物、蛋白質、核酸和脂肪?？寡趸瘎┛梢砸种蒲趸^程,防止體內自由基的形成[2],已發(fā)現多酚可以作為抗氧化劑來抵抗有自由基誘導的疾病[3-4]。因此,抗氧化劑在維持身體健康和預防疾病方面越來越受到關注。

石榴(PunicagranntumL.)是一種古老、獨特而神秘的水果,主要種植在亞洲、北非和中東部分地區(qū)[5-6]。石榴一般用于直接食用,或加工成飲料飲用,已報道石榴具有抗病毒和抗癌的作用[7]。石榴渣作為石榴汁生產過程中的副產物,其含有大量的抗炎癥成分、抗氧化物、維生素E、甾醇類物質和石榴酸[8-12]。然而,在過去的幾年研究里,人們主要側重于對石榴皮的研究,所以本文采用響應面分析法對石榴渣多酚的提取條件進行優(yōu)化,得到的多酚得率最大為4.88 mg GAE/g,以期為石榴的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 當地的超市,石榴要求外觀完整,無破裂,八成熟。石榴剝皮后放入原汁機中榨汁,將石榴渣(包含石榴籽)放入真空冷凍干燥機中干燥24 h(真空度為:1 pa,溫度為:-65 ℃),分水含量約為1%,最后石榴渣狀態(tài)為無明顯可見的大顆粒即可。福林酚(Folin-Ciocalteu)(純度為99%)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(純度大于98%) 美國Sigma公司,其他試劑均為分析純。

XY-FD-18真空冷凍干燥機 上海欣諭儀器有限公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠;752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限責任公司;HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中掛科學儀器有限公司;SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器 上海亞萊生化儀器廠;J2Y-13.3E原汁機 中山市金正生活電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴渣中酚類物質的提取方法 稱取4 g的石榴渣加入一定濃度(40%、70%、100%)的乙醇溶劑,在不同溫度(25、45、65 ℃)下水浴震蕩提取不同時間(0.5、2、3.5 h)后進行抽濾,然后定容到100 mL,備用。

1.2.2 酚類物質含量的測定 酚類物質含量的測定采用福林-酚比色法:移液槍吸取0.3 mL的提取液與25 mL的比色管中,加蒸餾水至10 mL,接著加入0.5 mL的福林酚試劑后,振蕩5 min,再加入5%的碳酸鈉溶液5 mL,加入蒸餾水至反應體系25 mL,搖勻,室溫下靜置90 min,在750 nm波長下測定吸光度。同時用蒸餾水作空白對照,每個樣品重復三次。采用沒食子酸為對照品,根據所得標準曲線算出石榴渣中提取液多酚的含量,以沒食子酸當量表示,單位為:mg/g。

Y(mg/g)=C×V/M

式中:C為提取液多酚質量體積分數,mg/mL;V為提取液定容后體積,mL;M為石榴渣質量(g)。

1.2.3 石榴渣提取物的制備 準確稱取10 g的石榴渣于燒瓶中,加入200 mL 42%的乙醇溶液,在62 ℃下水浴3.5 h,然后用真空泵進行抽濾處理,收集到的濾液用旋轉蒸發(fā)儀除去多余的乙醇,最后用真空冷凍干燥機干燥至恒重,得到的石榴渣提取物進行抗氧化實驗。

1.2.4 石榴渣多酚抗氧化性測定

1.2.4.1 石榴渣酚類物質對DPPH自由基的清除能力測定 準確量取2 mL的樣液,加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液,混合均勻,黑暗處反應30 min,以無水乙醇調零,測定其在517 nm處的吸光度值Ai;同時測定2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光度值Ac;再測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光度值Aj。同一測定重復操作三次。計算清除率E[13]。

E(%)=[1-(Ai-Ac)/Aj]×100

1.2.4.2 還原能力的測定 量取0.5 mL的樣液于具塞試管中,加入0.2 mol/L,pH為6.6的磷酸緩沖液(將2.6865 g的Na2HPO4和1.9506 g的NaH2PO4溶解定容于100 mL的容量瓶中)2.5 mL和2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6],置于50 ℃恒溫水浴中反應20 min,然后迅速冷卻至室溫,加入2.5 mL10%的三氯乙酸(trichloroacetonitrile,TCA)溶液,于3000 r/min下離心10 min后取上清液2.5 mL,并加入2.5 mL的蒸餾水及0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混合均勻,10 min后于700 nm下測定吸光度值,同時作空白管調零。同一測定重復操作三次[14-15]。吸光度值越大表示還原能力越強。

1.2.5 響應面實驗設計 響應面法是優(yōu)化實驗過程、描述自變量和因變量之間關系的有效方法[16]。選擇時間、溫度、溶劑濃度和料液比四個因素,以提取率為響應值,通過中心組合設計法(Central Composite Design,CCD)來優(yōu)化提取的最佳條件。

1.2.6 數據分析 利用Design Expert 7.0分析軟件及Excel程序對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 CCD相應曲面設計優(yōu)化石榴渣多酚提取工藝

根據CCD實驗設計步驟進行多酚的提取,如表1所示,實驗結果利用Design Expert進行分析。

表1 石榴渣多酚提取響應面實驗設計及結果

2.1.1 石榴渣多酚提取工藝優(yōu)化 根據CCD實驗結果,進行回歸分析,得多元二次回歸方程:

Y=2.82+0.35A+0.60B-0.84C+0.45D+0.15AB+0.047AC+0.084AD-0.081BC+0.079BD-0.29CD+0.63A2-0.54B2-0.61C2-0.17D2

根據表2統計結果可以看出,該模型在p<0.01水平上極顯著,失擬項0.1415不顯著(p>0.05)說明該模型可以用于石榴渣多酚提取的優(yōu)化分析,相關系數R2=0.9763,校正系數R2=0.9541,說明該模型擬合度較高,可以用于預測石榴渣多酚的優(yōu)化,因素A,B,C,D,CD,A2,B2,C2影響顯著(p<0.01),AB影響顯著(p<0.05),AC,AD,BC,BD不顯著,剔除不顯著項,得到的多元回歸方程為:

Y=-3.58101-1.28536A+0.14400B+0.085937C+0.18370D+5.10417×10-3AB-1.27500×10-3CD+0.27984A2-1.35088×10-3B2-6.72612×10-4C2-2.93957×10-3D2

表2 二次回歸的方差分析

從圖1響應面圖可以看出各因素的交互作用對石榴渣多酚得率的影響,利用Design Expert軟件對多元二次方差模型進行提取條件優(yōu)化,得出石榴渣的最佳提取優(yōu)化條件為:41.59%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在61.80 ℃下提取3.5 h時多酚的得率最大為5.03 mg GAE/g。

進行驗證實驗時,為了便于操作,優(yōu)化條件修改為乙醇濃度41%、液料比20 mL/g、提取溫度62 ℃、提取時間3.5 h,多酚得率可達4.88 mgGAE/g,為預測值的97.02%,與預測值符合度較高,因此此實驗條件可以用于石榴渣多酚提取的優(yōu)化。

2.1.2 多酚含量與DPPH自由基清除能力的關系 多酚含量與DPPH自由基的清除率二者之間的相互關系如圖2所示,石榴渣多酚含量與DPPH自由基清除能力大小相關性顯著,且相關系數為0.9494,說明石榴渣多酚在抗氧化中起了重要作用。多酚濃度與還原能力二者之間的相互關系如圖3所示,石榴渣多酚的得率與還原能力呈線性關系,且其相關系數為0.9988。

圖2 提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of the extract

圖3 石榴渣提取物的還原能力Fig.3 Reducing power of the extract from the pomegranate slag

3 討論與結論

在先前的研究中,利用較少的參數進行提取優(yōu)化,在不同的實驗中對液固比、提取時間、溫度和乙醇濃度進行了研究[17]。響應面法是包括液固比、提取時間、溫度和乙醇濃度的一個全面的實驗方法,在優(yōu)化許多因素時,響應面法是優(yōu)化實驗過程的有效工具,RSM考慮交互作用,并在合理的范圍內優(yōu)化參數,利用更少的重復和所需的總時間來進行實驗[18-19]。

從三維響應面圖,如圖1所示,我們可以更好地理解變量之間的相互關系。在本研究中,可以發(fā)現四個因素都是顯著的。

為評估石榴渣的抗氧化性,本研究利用DPPH自由基清除能力和還原能力兩種實驗,這眾多測定抗氧化方法中被普遍接受的兩種評價方法。

石榴渣多酚的提取條件可以通過響應面法進行優(yōu)化,實驗表明最佳的石榴渣提取工藝條件是:41%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h時多酚的得率最大為4.88 mg GAE/g。并且有很強的DPPH自由基清除能力和還原能力。因此,在醫(yī)藥和食品行業(yè)使用石榴渣提取物必定有很大的前景。

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Extraction and antioxidant activity of polyphenols from pomegranate slag

ZHAO Guang-yuan1,2,XU Yan-hua1,2,CHEN Mei-li1,2,ZONG Wei1,2，*

(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Henan Province,Zhengzhou 450002,China)

To optimize the extraction of polyphenols from pomegranate seed and research its antioxidant activity.Methods:By traditional solvent extration method obtained the polyphenols in pomegranate seed,then determined by Folin-Ciocalteu(FC)method.The levels of the four variables were optimized using response surface methodology(RSM)with central composite design.The antioxidant activity was determined by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability and the assays of deoxidization capability.Results:The optimal conditions were determined as follows:extraction time of 3.5 h,extraction temperature of 62 ℃,ethanol concentration of 41%,and liquid-solid of 20 mL/g.Under these condition,the extraction value of polyphenols was 4.88 mg GAE/g material,which is accordance with the predicted value 5.034 mg GAE/g material.There is a positive correlation between polyphenols concentration from pomegranate seeds and DPPH free radical scavenging,and the correlation coefficient is 0.9988.

pomegranate slag;response surface methodology;phenolics;antioxidant

2016-09-13

趙光遠(1973-),男，博士，教授，主要從事果蔬深加工方向，E-mail:guangyuan-zhao@163.com。

*通訊作者:縱偉(1965-),男，博士，教授，主要從事果蔬深加工方向，E-mail:zongwei1965@126.com。

河南省食品加工過程安全控制技術創(chuàng)新團隊(C20150024);果蔬加工高新技術(16IRTSHN010)；2015年徐州市高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才引進計劃(2015)035號。

TS255.1

B

1002-0306(2017)05-0228-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.035