喻小平 陳謙學(xué)

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丁苯酞對(duì)顱腦損傷大鼠血清S100B、NSE蛋白水平和腦組織含水量的影響

喻小平 陳謙學(xué)*

目的：觀察丁苯酞對(duì)顱腦損傷大鼠腦組織含水量、血清神經(jīng)生化標(biāo)志物S100B和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)蛋白濃度的影響。方法：110只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)、模型組(n=30)、吡拉西坦治療組(陽性對(duì)照組，n=30)和丁苯酞治療組(丁苯酞組，n=30)。后三組大鼠參考Feeney法復(fù)制顱腦損傷模型。成模后24h，陽性對(duì)照組給予吡拉西坦溶液(3.6g/kg/天)灌胃，丁苯酞組給予丁苯酞溶液(160mg/kg/天)灌胃，其余兩組平行灌胃等量純化水，均每天一次，連續(xù)10天。比較各組大鼠治療期間死亡率；于藥物干預(yù)第3天和第10天分批心臟取血及處死大鼠取腦組織，檢測各組大鼠血清S100B和NSE蛋白含量和腦組織含水量。結(jié)果：治療過程中丁苯酞組大鼠死亡率較模型組降低(P<0.01)，與陽性對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。治療后第3、第10天，各組血清S100B、NSE蛋白濃度和腦組織含水量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組較假手術(shù)組血清S100B、NSE蛋白濃度和腦組織含水量明顯升高(P<0.05,P<0.01)；陽性對(duì)照組及丁苯酞組較模型組降低(P<0.05，P<0.01)；陽性對(duì)照組與丁苯酞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對(duì)照組和丁苯酞組血清S100B、NSE蛋白濃度和腦組織含水量在治療后第10天較第3天下降更明顯(P<0.01)。結(jié)論：丁苯酞能改善顱腦損傷后大鼠腦組織水腫，降低血清S100B和NSE蛋白含量，療效與吡拉西坦相當(dāng)，具有腦保護(hù)作用。

S100B；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；顱腦損傷；大鼠

急性顱腦損傷可致腦組織挫裂傷甚至顱內(nèi)血腫，引起顱內(nèi)壓、腦供血改變，以及大量氧自由基產(chǎn)生，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，引起嚴(yán)重并發(fā)癥和后遺癥。有研究[1,2]表明，神經(jīng)生化標(biāo)志物S100B和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase， NSE)等的血清濃度變化可反映顱腦損傷的嚴(yán)重程度及判斷預(yù)后。

丁苯酞膠囊和吡拉西坦片均用于臨床治療顱腦損傷。丁苯酞膠囊屬國家I類新藥，其主要藥效成分為芹菜籽提取物左旋芹菜甲素人工合成的消旋體。臨床研究表明，丁苯酞對(duì)缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能損傷有改善作用，如縮小局部腦梗死面積，減輕腦水腫，改善腦能量代謝，減輕炎癥反應(yīng)，改善腦微循環(huán)及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[3,4]。吡拉西坦是r-氨基丁酸的環(huán)化衍生物，可促進(jìn)磷質(zhì)和氨基酸吸收，增加腦內(nèi)蛋白質(zhì)合成，增進(jìn)生物體內(nèi)激酶活性，提高機(jī)體對(duì)糖的利用率和能量儲(chǔ)存等，具有較強(qiáng)的抗腦缺氧作用，其治療腦損傷療效確切[5,6]。本研究通過復(fù)制大鼠顱腦損傷模型，觀察其腦組織水腫及血清S100B、NSE水平的變化，并以吡拉西坦治療作為對(duì)照，分析丁苯酞對(duì)顱腦損傷的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

SPF級(jí)健康SD雄性大鼠110只，體重250g-300g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=20)、腦損傷模型對(duì)照組(模型組，n=30)、吡拉西坦治療組(陽性對(duì)照組，n=30)和丁苯酞治療組(丁苯酞組，n=30)。

1.2 主要藥物、儀器和試劑

丁苯酞膠囊由河北石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(0.1g/粒，國藥準(zhǔn)字118151025)；吡拉西坦片由湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(0.4g/片，國藥準(zhǔn)字150318)。兩藥物(丁苯酞膠囊去除膠囊外殼)分別研磨成粉末后用純化水溶解乳化，丁苯酞濃度為8mg/ml，吡拉西坦?jié)舛葹?80mg/ml。S100B和NSE ELISA檢測試劑盒均為美國R&D Systems公司產(chǎn)品。

1.3 復(fù)制腦損傷大鼠模型

參照Feeney法[7]復(fù)制閉合性腦損傷模型。四組大鼠采用3%戊巴比妥鈉(40-50mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于鼠板上，頭部剃毛、皮膚消毒，沿正中線切開頭皮(長約2cm)，剝離骨膜暴露右頂骨，用牙科鉆于冠狀縫后1.5mm，中線右旁開2.5mm鉆一直徑5mm圓形骨窗(保持硬腦膜完整)。安裝自制自由落體打擊架，采用20g擊錘從30cm高處自由落下，造成右頂葉腦組織損傷。骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，創(chuàng)口涂抹紅霉素軟膏，放回鼠籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組不予打擊，其余同它組。造模24h內(nèi)，模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組共有12只大鼠死亡，其余均符合成模標(biāo)準(zhǔn)[7]；假手術(shù)組有1只大鼠死亡(喂養(yǎng)過程中意外死亡)。

1.4 藥物治療

成模24h后，陽性對(duì)照組給予吡拉西坦溶液(3. 6g/kg)灌胃；丁苯酞組給予丁苯酞溶液(160mg/kg)灌胃；假手術(shù)組和模型組平行灌胃等量純化水。每天一次，連續(xù)10天。

1.5 血清S100B、NSE含量測定

分別于成模后第3、第10天分批處死大鼠前心臟采血，離心分離血清，采用ELISA測定S100B、NSE水平，操作按試劑盒說明書。

1.6 腦組織含水量檢測

各組大鼠心臟取血后斷頭處死，30s內(nèi)取出腦組織，用濾紙吸盡腦表面血漬，銳性分離右側(cè)頂葉皮質(zhì)約100mg，置于已稱重的帶蓋玻璃稱樣杯中，用電子分析天平(分度值0.1mg)稱量濕重，然后再置于110℃恒溫干燥箱內(nèi)烘烤24h至恒重(兩次稱重之差≤0.2mg)稱量干重，計(jì)算腦組織含水量(%)[=(濕重—干重)/濕重×100%]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠死亡率比較

造模后24h死亡大鼠13只，余下97只大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分別為假手術(shù)組19只，模型組25只，陽性對(duì)照組26只，丁苯酞組27只。在其后10天藥物治療過程中又有12只大鼠死亡，其中假手術(shù)組0只，模型組7只，陽性對(duì)照組2只，丁苯酞組3只。丁苯酞組死亡率(11.11%，3/27)明顯低于模型組(28.00%，7/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.53，P<0.05)，與陽性對(duì)照組(7.69%，2/26)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P>0.05)。

2.2 各組大鼠血清S100B蛋白水平比較

各組大鼠藥物治療后第3天、第10天，血清S100B蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天血清S100B蛋白水平均較假手術(shù)組升高(P<0.05)；陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天血清S100B蛋白水平均較模型組降低(P<0.05)；丁苯酞組與陽性對(duì)照組治療后第3天和第10天的S100B蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組治療后第3天和第10天S100B水平無明顯差異(P>0.05)；模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第10天S100B水平較第3天顯著下降(均P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清S100B蛋白水平比較

注：與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與同組治療后第3天比較，3)P<0.05

2.3 各組大鼠血清NSE蛋白水平

各組大鼠治療后第3天、第10天血清NSE蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天血清NSE蛋白水平均較假手術(shù)組升高(P<0.05，P<0.01)；陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天血清NSE蛋白水平均較模型組降低(P<0.01)；丁苯酞組治療后第3天和第10天的NSE蛋白水平與陽性對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組治療后第10天與第3天的NSE水平無明顯差異(P>0.05)；模型組陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第10天較第3天的NSE水平顯著降低(均P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清NSE蛋白水平的比較

注：與假手術(shù)組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較，3)P<0.01；與同組治療后第3天比較，4)P<0.05

2.4 各組大鼠腦組織含水量比較

各組大鼠治療后第3天、第10天腦組織含水量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天腦組織含水量均較假手術(shù)組升高(P<0.01)；陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第3天和第10天腦組織含水量均較模型組降低(P<0.01)；丁苯酞組治療后第3天和第10天腦組織含水量與陽性對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組治療后第3天和第10天腦含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組、陽性對(duì)照組和丁苯酞組治療后第10天腦組織含水量較第3天顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 丁苯酞對(duì)顱腦損傷大鼠腦組織含水量的影響±s)

注：與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與同組治療后第3天比較，3)P<0.01

3 討 論

顱腦創(chuàng)傷是神經(jīng)外科常見疾病，腦損傷后導(dǎo)致的嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，以及高致殘率和致死率已成為全球性難題。本研究采用自由落體方法造成顱腦損傷模型，給予丁苯酞灌胃治療10天后，其死亡率較模型組明顯降低，效果與陽性對(duì)照組相當(dāng)，表明丁苯酞是治療顱腦創(chuàng)傷的有效藥物之一。

S100B蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，屬于S100蛋白家族成員之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)細(xì)胞中，主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。有研究[8,9]表明，低濃度S100B蛋白具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，高濃度則有神經(jīng)毒性作用，主要通過晚期糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)受體刺激炎性因子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并通過一氧化氮依賴途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，業(yè)已成為判斷顱腦損傷程度及評(píng)估預(yù)后的一項(xiàng)可靠指標(biāo)[8]。NSE是神經(jīng)元細(xì)胞中的一種可溶性胞漿蛋白，僅存在于神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞漿中，是神經(jīng)元損傷的敏感標(biāo)志物。腦損傷后，神經(jīng)細(xì)胞胞膜破壞，NSE從細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞間隙，最終進(jìn)入血液循壞，使血液中NSE含量升高，其升高幅度可反映腦損傷的程度和范圍[10]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠顱腦損傷后3天，血清S100B和NSE蛋白水平均升高，腦組織含水量也增加，表明成模大鼠腦組織已明顯損傷。此時(shí)丁苯酞組血清S100B和NSE蛋白水平均下降，腦組織含水量也減少，至治療后第10天，這種效應(yīng)更明顯，尤其腦組織含水量恢復(fù)接近至假手術(shù)組水平；且其治療作用與陽性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。丁苯酞的這種腦保護(hù)作用與其能調(diào)節(jié)腦能量代謝、增加腦血流量、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，其具體機(jī)制可能為：(1)避免線粒體酶的自我損傷，保護(hù)線粒體功能，改善再灌注引起的線粒體腫脹和功能異常[11]；(2)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，加快側(cè)支循環(huán)建立，增加腦血流量[12]；(3)減少線粒體電子傳遞鏈細(xì)胞色素C的釋放，減少半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表達(dá)和激活，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[13]。

綜上所述，丁苯酞可緩解大鼠顱腦損傷引起的腦水腫，降低血清S100B和NSE蛋白水平，對(duì)顱腦損傷具有保護(hù)作用，其療效與吡拉西坦相當(dāng)。該結(jié)果為丁苯酞的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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本文第一作者簡介：

喻小平(1984-)，男，漢族，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科及相關(guān)專業(yè)的臨床研究

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Effects of dl-3n-Butylphthalide on Content of Brain Water, Serum S100B and Neuron Specific Enolase in Traumatic Brain Injuried Rats

YU Xiao-ping， CHEN Qian-xue*

Department of Neurosurgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China；*

Objective: To explore the effect of dl-3n-butyphthalide(NBP) on the content of brain water，serum S100B and neuron specific enolase (NSE) in traumatic brain injuried rats.Method: 110 healthy male SD rats were randomly divided into the sham group (n=20), model group(n=30), piracetam treatment group(the positive control group,n=30), and NBP treatment group(NBP group,n=30). The last three groups were made into models. The brain injury model was induced by free-falling method. Then drug was used after the traumatic brain injuriy. The positive control group was intragastric administration with pyrazole raschig solution(3.6g/kg/d). The NBP group was intragastric administration with Butylphthalide solution(160mg/kg/d). Blood samples were collected from heart on 3rd and 10th day after the drug intervention. The expression of serum S100B and NSE levels were detected by ELISA. The content of brain water of some killed rats from each group was compared. Results: Death rate in model group was higher than positive group and NBP group (P<0.01). The 3rd and 10th day after traumatic brain injury, compared with the sham group, the content of brain water，serum S100B and NSE in traumatic brain injuried rats were all increased(P<0.01). Compared with the model group, the content of brain water，serum S100B and NSE in NBP group and the positive group were all decreased(P<0.01). There was no statistically significantin positive control group and NBP group (P>0.05). Compared with the 3rd day, above detection targets on the 10th day were decreased in positive control group and NBP group (P<0.01). Conclusion: NBP can improve tissue edema rats after traumatic brain injury, down-regulate S100B and NSE level in blood. It's efficacy is equal to piracetam. NBP has the neuroprotective effect against traumatic brain injury.

S100B；Neuron specific enolase；Traumatic brain injury；Rat

武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430060；*

，E-mail:chenqx666@sohu.com

本文2017-01-18收到，2017-04-10修回

R651.1+5

A

1005-1740(2017)02-0017-04