覃偉峰 仉紅剛 張秋菊 修瑞娟

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原發(fā)性高血壓大鼠血漿外泌體水平及其與微循環(huán)變化的相關(guān)性研究*

覃偉峰 仉紅剛#張秋菊 修瑞娟

目的：研究13周齡原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)外周血外泌體數(shù)量和大小分布與微循環(huán)功能的相關(guān)性。方法：市購13周齡雄性SHR(實(shí)驗(yàn)組)和相同周齡的WKY大鼠(對照組)各7只。采用多功能激光多普勒血流探測儀(LDF)檢測兩組大鼠耳廓、趾及腦皮質(zhì)血流量、血細(xì)胞聚集度和血流速度，采用血流成像技術(shù)(LDPI)觀察腦皮質(zhì)血流分布。取外周血，提取血漿外泌體，采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，以Apogee流式細(xì)胞術(shù)檢測總外泌體水平和直徑<100nm的外泌體水平，分析實(shí)驗(yàn)組大鼠外泌體水平與其微循環(huán)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：LDF結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮質(zhì)血流量和血流速度均顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01),而實(shí)驗(yàn)組大鼠趾血流量和血流速度明顯低于對照組(P<0.05)，兩組大鼠的耳廓血流量、血流速度及耳廓、趾和腦皮質(zhì)的血細(xì)胞聚集度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LDPI結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮質(zhì)血流灌注量顯著高于對照組(P<0.01)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)大鼠血漿外泌體大小分布不均，但以直徑<100nm者居多；實(shí)驗(yàn)組總外泌體水平和直徑<100nm外泌體水平均明顯高于對照組(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿總外泌體和直徑<100nm外泌體水平與腦皮質(zhì)血流量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論：腦微循環(huán)功能改變與血漿總外泌體含量，尤其直徑<100nm的外泌體水平顯著相關(guān)，提示外泌體水平的升高可能預(yù)警原發(fā)性高血壓發(fā)生和發(fā)展過程中的微循環(huán)變化，或可作為高血壓早期的監(jiān)測標(biāo)記物。

原發(fā)性高血壓；外泌體；微循環(huán)；大鼠

原發(fā)性高血壓由于其高發(fā)病率和高致死率已成為危害人類健康的主要疾病之一[1]，外泌體在其中扮演的角色受到越來越廣泛關(guān)注。外泌體是一種由機(jī)體多種細(xì)胞分泌的直徑在30-300nm的囊泡或多囊泡體，研究證實(shí)分泌到外周血中的外泌體既能通過攜帶功能性血管緊張素Ⅱ受體調(diào)控血壓變化[2]，還能通過攜帶的miRNA調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈高壓[3]，故在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要病理生理作用。本文報(bào)道原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)外周血中外泌體大小和數(shù)量變化及其與微循環(huán)功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組

SPF級13周齡雄性SHR 7只，體重270g±11g(實(shí)驗(yàn)組)；同周齡SPF級雄性正常WKY大鼠7只，體重270g±10g(對照組)；均購自北京維通利華公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)后處理均遵照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會要求。

1.2 主要儀器和試劑

激光多普勒檢測儀(LDF)和激光多普勒血流成像儀(LDPI)均為英國Moor公司產(chǎn)品，型號分別為moor VMS-LDF1-HP和moor LDI-HIR；儀器配套數(shù)據(jù)分析軟件分別為moor VMS-PC Version 3.1 for Vascular Monitor System 和moor LDI Image Review Version 5.3。流式細(xì)胞儀為英國Apogee Flow System Ltd產(chǎn)品,型號為Apogee A50 Micro，配套分析軟件為Histogram Software。電子顯微鏡為日本電子公司產(chǎn)品，型號：JEM-1400Plus，拍照軟件為Radius。外泌體提取試劑盒購自美國101Bio公司(PureExo?Exosome Isolation Kit P101)，負(fù)染色試劑(1%醋酸鈾)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室提供。

1.3 微循環(huán)指標(biāo)觀測方法

參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[4]，3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。室溫下，大鼠左側(cè)臥位，分別于右耳耳廓邊緣近心端5mm處或右后肢中趾背側(cè)向心端5mm處放置LDF探頭，連續(xù)測量記錄耳廓、趾血流量和血流速度、血細(xì)胞聚集度2min；再將大鼠俯臥位，頭部備皮，矢狀位剪開額頂部皮膚2cm,暴露顱骨前囟及左側(cè)顱骨，標(biāo)定于前囟左5mm后3mm處放置LDF探頭，連續(xù)測量記錄腦皮質(zhì)血流量、血流速度和血細(xì)胞聚集度2min。最后將腦皮質(zhì)暴露部位置于LDPI下，檢測記錄腦血流成像。利用儀器配套數(shù)據(jù)分析軟件直接輸出上述檢測部位2min內(nèi)的各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值，選取較平穩(wěn)時(shí)段的均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 血漿外泌體檢測

1.4.1 外泌體提取及形態(tài)觀察：采集外周血，于16℃、1 500g離心10min分離血漿。取500μl血漿，采用外泌體提取試劑盒，按照其操作說明提取外泌體，主要過程包括：首先于3 000g、4℃條件下離心血漿樣本15min，以移除細(xì)胞碎片；然后加試劑A、B、C于上清液，靜置30min；再次離心后出現(xiàn)三層，移除上層和下層，提取中層，外泌體即在該層；最后將外泌體重懸于100μl PBS中。按常規(guī)方法進(jìn)行負(fù)染色后用透射電鏡觀察，不著色小囊泡即為外泌體。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)測定外泌體水平：按照流式細(xì)胞儀操作手冊要求校正儀器，檢測PBS溶劑中的微粒濃度作為本底，然后用同樣的PBS將外泌體樣本稀釋10倍后再上Apogee流式細(xì)胞儀檢測，外泌體水平計(jì)算方法為：稀釋后的樣本中外泌體濃度(個(gè)/μl)=稀釋后樣本中微?？倽舛?PBS中微粒濃度。分別檢測總外泌體濃度和通過閾值設(shè)門檢測直徑<100nm的外泌體濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠耳廓、趾、腦皮質(zhì)血流量、血流速度和血細(xì)胞聚集度比較

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠耳廓血流量無明顯差異(t=-0.492，P>0.05)；但趾血流量明顯降低(U=8.000，P<0.05)，腦皮質(zhì)血流量顯著升高(t=3.968，P<0.01)，見表1。

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠耳廓血流速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.470，P>0.05)，但趾血流速度明顯變慢(U=4.000，P<0.01)，腦皮質(zhì)血流速度較快(t=2.514，P<0.05)，見表2。

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組耳廓、趾和腦皮質(zhì)的血細(xì)胞聚集度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表1 兩組大鼠不同部位血流量比較均=7)

注：與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表2 兩組大鼠不同部位血流速度比較±s，n均=7)

注：與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表3 兩組大鼠不同部位血細(xì)胞聚集度比較±s，n均=7)

2.2 兩組大鼠腦皮質(zhì)血流量比較

LDPI可以監(jiān)測微循環(huán)的血液灌注量，包括毛細(xì)血管(營養(yǎng)血管)、微動(dòng)脈、微靜脈和吻合支。結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮質(zhì)血流量升高(988.01±70.19PU vs 883.23+79.03PU)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=7.000，P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠腦皮質(zhì)血流成像圖(LDPI，A為實(shí)驗(yàn)組；B為對照組)

2.3 兩組血漿外泌體形態(tài)和水平比較

透射電鏡見血漿中單個(gè)或多個(gè)聚集分布的圓形或橢圓形小囊泡狀外泌體，直徑50-200nm，以直徑<100nm者居多，外泌體囊泡內(nèi)有較多電子致密物(圖2)。定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組血漿總外泌體水平和直徑小于100nm的外泌體水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.313、2.591，P<0.05)，見表4。

圖2 血漿外泌體形態(tài)(透射電鏡，A×4 000，B×80 000)

表4 兩組大鼠血漿總外泌體水平比較(個(gè)±s，n均=7)

注：與對照組比較，1)P<0.05

2.4 實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿外泌體水平與其腦皮質(zhì)血流量的相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿總外泌體水平和直徑<100nm的外泌體水平均與腦皮質(zhì)血流量呈直線正相關(guān)，后者更顯著(r=0.898、0.908，P<0.01)，見圖3。

注：A為總外泌體水平與腦皮質(zhì)血流量相關(guān)性曲線；B為直徑<100nm外泌體水平與腦皮質(zhì)血流量的相關(guān)性曲線

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，SHR趾血流量和血流速度均明顯低于WKY大鼠，與之前臨床相關(guān)報(bào)道[5，6]一致，進(jìn)一步表明高血壓可致末梢微循環(huán)受損。其原因可能由調(diào)節(jié)皮膚血流的肌源性機(jī)制障礙所致[7]。但本研究中13周齡SHR腦皮質(zhì)血流量卻顯著高于同周齡WKY大鼠，這可能與高血壓病程的病理生理特征密切相關(guān)，即與高血壓大鼠的周齡密切相關(guān)。有研究[8]證實(shí)，20周齡以下的SHR處于高血壓早期(本文大鼠為13周齡)，機(jī)體的大、小血管功能均處于可調(diào)節(jié)階段，此時(shí)大血管管腔開始變窄，而機(jī)體能夠通過自適應(yīng)的血管平滑肌肌源性反應(yīng)保護(hù)下游的微血管，使其血流量增加。這種現(xiàn)象也在腦卒中易感型高血壓大鼠(SHRSP)中被觀察到[9]。隨著年齡增長或病程延長，這種調(diào)節(jié)作用可能降低，從而引起腦血流量減少。

本文采用敏感且高通量外泌體分析技術(shù)Apogee流式細(xì)胞儀，對SHR和WKY大鼠血漿外泌體的大小分布進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示SHR總外泌體水平顯著高于WKY大鼠，并且絕大多數(shù)外泌體直徑均在100nm以下，這一現(xiàn)象尚未見到相關(guān)報(bào)道，其形成機(jī)制及其在微循環(huán)障礙中的作用有待進(jìn)一步探討。

本文研究結(jié)果還顯示，SHR血漿外泌體水平升高與腦皮質(zhì)血流量呈正相關(guān)，即提示外泌體可能參與微循環(huán)功能調(diào)控。有研究證實(shí)，將微小RNA(miR)-143轉(zhuǎn)移到外泌體中能提高微血管密度，而來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體能攜帶miR-143至血管平滑肌細(xì)胞，從而影響血管功能和血管重塑[10-12]，更何況外泌體能穩(wěn)定地通過血腦屏障，并且攜帶RNA[13，14]，因而對腦皮質(zhì)血流的影響更顯著。

綜上所述，血漿外泌體水平，尤其直徑<100nm外泌體水平升高可能預(yù)警原發(fā)性高血壓發(fā)生和發(fā)展過程中的早期微循環(huán)變化，或可作為高血壓微循環(huán)功能障礙的監(jiān)測標(biāo)記物。進(jìn)一步探索其調(diào)控分子和機(jī)制對高血壓及其并發(fā)癥防治可能提供新的途徑和策略。

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本文第一作者簡介：

覃偉峰(1990-), 男，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)楦哐獕何⒀h(huán)功能障礙及其病理生理機(jī)制

1 Li H, Zhang X, Wang F, et al. MicroRNA-21 lowers blood pressure in spontaneous hypertensive rats by upregulating mitochondrial translation[J]. Circulation, 2016, 134(10): 734-751.

2 Pironti G, Strachan RT, Abraham D, et al. Circulating exosomes induced by cardiac pressure overload contain functional angiotensin II type 1 receptors[J]. Circulation, 2015, 131(24): 2 120-2 130.

3 Aliotta JM, Pereira M, Wen S, et al. Exosomes induce and reverse monocrotaline-induced pulmonary hypertension in mice[J]. Cardiovasc Res, 2016, 110(3): 319-330.

4 劉曉慶, 仉紅剛, 張秋菊, 等.高功率多普勒血流探測儀結(jié)合血流成像儀觀察氯吡格雷對高血壓大鼠微循環(huán)的影響[J]. 微循環(huán)學(xué)雜志, 2015, 25(2): 30-33.

5 Esen F, Caglar S, Ata N, et al. Fractal scaling of laser doppler flowmetry time series in patients with essential hypertension[J]. Microvasc Res, 2011, 82(3): 291-295.

6 Catalano M, Schioppa S, Sampietro G, et al. Skin blood flow during vasoconstrictive and vasodilative stimuli in essential hypertension patients: a laser Doppler flowmetry study[J]. Int J Microcirc Clin Exp, 1997, 17(2): 80-85.

7 Rossi M, Carpi A, Di Maria C, et al. Spectral analysis of laser Doppler skin blood flow oscillations in human essential arterial hypertension[J]. Microvasc Res, 2006, 72(1-2): 34-41.

8 Li Y, Shen Q, Huang S, et al. Cerebral angiography, blood flow and vascular reactivity in progressive hypertension[J]. Neuroimage, 2015, 111:329-337.

9 Henning EC, Warach S, Spatz M. Hypertension-induced vascular remodeling contributes to reduced cerebral perfusion and the development of spontaneous stroke in aged SHRSP rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010, 30(4): 827-836.

10 Su SA, Xie Y, Fu Z, et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling[J]. Oncotarget, 2017, [in press].

11 Deng L, Blanco FJ, Stevens H, et al. MicroRNA-143 activation regulates smooth muscle and endothelial cell crosstalk in pulmonary arterial hypertension[J]. Circ Res, 2017, 117(10)：870-883.

12 Aliotta JM, Pereira M, Wen S, et al. Exosomes induce and reverse monocrotaline-induced pulmonary hypertension in mice[J]. Cardiovasc Res, 2016, 110(3): 319-330.

13 Xiong Y, Mahmood A, Chopp M. Emerging potential of exosomes for treatment of traumatic brain injury[J]. Neural Regen Res, 2017, 12(1):19-22.

14 Yang T, Fogarty B, Laforge B. et al. Delivery of small interfering RNA to inhibit vascular endothelial growth factor in zebrafish using natural brain endothelia cell-secreted exosome nanovesicles for the treatment of brain cancer[J]. AAPS J, 2017, 19(2):475-486.

The Concentration of Exosomes from Plasma in Hypertensive Rats and its Correlation to Microcirculation Function

QIN Wei-feng, ZHANG Hong-gang#, ZHANG Qiu-ju, XIU Rui-juan

Institute of Microcirculation, Peking University of Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Key Laboratory of Microcirculation, Ministry of Health, Beijing 100005，China；#

Objective: To investigate the microcirculation function and its correlation to the concentration and size distribution of circulating exosomes in spontaneous hypertensive rats(SHR). Method: Study group included seven 13-week-old male SHR, control group included seven 13-week-old male Wistar-Kyoto(WKY) rats. The blood flow, blood flow velocity, blood cell aggregation of all animals' cerebral cortices, auricles and toes were detected by the high power laser doppler flowmetry(LDF), and the whole distribution curve of blood flow of their cerebral cortices were measured by the laser doppler perfusion imaging(LDPI). The exosomes were extracted from the plasma, and then detected by transmission electron microscopy. Last, the total concentration of exosomes and the concentration of exosomes with diameter less than 100nm were measured using Apogee flow cytometry. Results: LDF showedthat the blood flow and blood flow velocity of cerebral cortex were both significantly higher in study group than controls(P<0.05 orP<0.01), while the blood flow and blood flow velocity of toes were both significantly lower in study group than in control group(P<0.05 orP<0.01), and the blood cell aggregation of cerebral cortices, auricles and toes showed no differences between the two groups(P>0.05).LDPI showed that the blood flow of cerebral cortex was significantly higher in study group than in control group(P<0.01). Furthermore, the total concentration of exosomes from plasma was significantly higher in study group than control group(P<0.05), and the same as the exosomes with diameter less than 100nm (P<0.05). And most importantly, we found that the total concentration of exosomes and the concentration of exosomes with diameter less than 100nm from plasma were both positively related to the blood flow in cerebral cortex detected by LDPI(P<0.01).Conclusion: The change of brain microcirculation function was significantly related to circulating total concentration of exosomes, especially to the concentration of exosomes with diameter less than 100nm.This indicated that the increase of exosomes might predict microcirculation change in the processes and development of essential hypertension and could be a potential biomarker in the early stage of hypertension.

Essential hypertension; Exosome; Microcirculation; Rat

國家自然科學(xué)基金(11274046)；協(xié)和青年基金(3332016081)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康創(chuàng)新項(xiàng)目(2016-12M-3006)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基金(2016ZX310046)

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所；衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；#

，E-mail:zhanghg1966126@imc.pumc.edu.cn

本文2017-01-20收到，2017-02-24修回

R544.1 R331.3+5

A

1005-1740(2017)02-0008-05