楊華鋒　紀(jì)術(shù)峰　李占文　鐘鎮(zhèn)鏵　史國(guó)軍　范鳳鳳　唐魯兵

[摘要] 目的 探討PGRMC1與三陰性乳腺癌（TNBC）分期、分級(jí)等各臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，建立患者隨訪系統(tǒng)，并分析其與腫瘤增殖性抗原ki-67的相關(guān)性。 方法 利用免疫組化檢測(cè)90例TNBC患者組織中PGRMC1和ki-67的表達(dá)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，用 Kaplan-Meier方法分析PGRMC1表達(dá)與生存情況，Log-rank檢驗(yàn)比較生存率，用相關(guān)性分析和ROC曲線探索其內(nèi)在相關(guān)性。 結(jié)果 90例TNBC組織中PGRMC1呈現(xiàn)高表達(dá)50例。PGRMC1的表達(dá)與腫瘤的體積、ki-67的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)（P<0.05）；TNBC組織中PGRMC1與年齡和腫瘤病理分級(jí)無關(guān)（P>0.05）。TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)與患者的總生存率（Log-rank=15.614，P=0.0001）和無瘤生存率（Log-rank=14.371，P=0.031）密切相關(guān)。 結(jié)論 TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期以及ki-67的增殖呈正相關(guān)，多因素分析結(jié)果提示PGRMC1可作為TNBC的潛在腫瘤生物標(biāo)志物以及癌干細(xì)胞的治療靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 三陰性乳腺癌；PGRMC1；ki-67；靶向

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）34-0008-05

Expression of PGRMC1 in triple negative breast cancer and its correlation with ki-67

YANG Huafeng1 JI Shufeng2 LI Zhanwen1 ZHONG Zhenhua1 SHI Guojun3 FAN Fengfeng1 TANG Lubing1

1.Department of Breast Surgery， the Affiliated Hospital of School of Medicine of Ningbo University， Ningbo 315000， China； 2.Department of General Surgery， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510282， China； 3.Department of Oncology， Ningbo Hosptial of TCM， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To explore the correlation between PGRMC1 and TNBC staging and grading and other clinicopathological indicators， establish a patient follow-up system， and analyze its correlation with tumor proliferating antigen ki-67. Methods The expression of PGRMC1 and ki-67 in 90 cases of TNBC was detected by immunohistochemistry. The Kaplan-Meier method was used to analyze the expression and survival of PGRMC1 by χ2 test. Log-rank test was used to compare the survival rate， and the relativity analysis and ROC curve were used to explore the intrinsic correlation. Results In 90 cases of TNBC tissues， PGRMC1 was expressed highly in 50 cases. The expression of PGRMC1 was closely related to tumor volume， ki-67 expression， lymph node metastasis and clinical staging（P<0.05）； there was no correlation between PGRMC1 and age and tumor pathological grade in TNBC tissues（P>0.05）. The expression of PGRMC1 in TNBC tissues was closely related to the tumor-free survival rate（Log-rank=14.371， P=0.031） and overall survival rate（Log-rank=15.614， P=0.0001）. Conclusion The expression level of PGRMC1 in TNBC tissues is positively correlated with tumor metastasis， clinical staging and proliferation of ki-67. Multivariate analysis indicates that PGRMC1 can be a potential tumor biomarker for TNBC and a therapeutic target for cancer stem cells.

[Key words] Triple negative breast cancer； PGRMC1； ki-67； Target

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）患者約占乳腺癌人群的10%～24%，患者發(fā)病年齡小，淋巴結(jié)陽(yáng)性率和組織學(xué)分級(jí)較高，臨床行為更具有侵襲性，局部復(fù)發(fā)和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后最差，緩解期最短，平均42.3個(gè)月[1]。由于三陰性乳腺癌既缺乏內(nèi)分泌治療受體又缺乏靶向治療，目前尚無針對(duì)三陰性乳腺癌的個(gè)體化的治療方案，這就使得其成為臨床生存期最短的乳腺癌。此前很多學(xué)者研究認(rèn)為雌激素受體和孕激素受體為細(xì)胞內(nèi)受體，而最近大量基礎(chǔ)研究和臨床研究發(fā)現(xiàn)，在很多組織的細(xì)胞膜上有孕激素結(jié)合位點(diǎn)，被稱之為孕激素膜受體（progesterone receptor membrane component，PGRMC1）[2]。PGRMC1參與孕激素抗正常顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控，PGRMC與三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后是否有相關(guān)性？本課題通過對(duì)90例三陰性乳腺癌患者PGRMC1的表達(dá)情況進(jìn)行回顧性分析，利用不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探索PGRMC的表達(dá)水平與病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及與腫瘤增殖性抗原ki-67表達(dá)等臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。探討PGRMC1作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤生物標(biāo)志物，以及癌干細(xì)胞的治療靶標(biāo)的可行性，為三陰性乳腺癌治療需找新的路徑。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寧波婦女兒童醫(yī)院乳腺外科2012年1月～2015年12月住院的三陰性乳腺癌患者的石蠟標(biāo)本（經(jīng)病理證實(shí)），入組患者共90例，年齡27～70歲，平均年齡（45.6土6.5）歲，入組患者均為女性，所有患者術(shù)前未進(jìn)行相關(guān)的治療，術(shù)后給予標(biāo)準(zhǔn)的化療各8周期。病例資料和隨訪資料完整。病理分級(jí)依據(jù)WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為：高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3）。臨床病理分期根據(jù)2009年公布的UICC新PTNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。

1.2 主要試劑

無水乙醇、二甲苯、切片石蠟、40%甲醛、30%雙氧水，購(gòu)于廣州市化學(xué)工業(yè)公司；DAB顯色試劑盒、陽(yáng)性白片、SABC免疫組化試劑盒（即用型）、EnVision檢測(cè)試劑盒（即用型），購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素、伊紅、多聚賴氨酸磷酸二氫鈉、枸櫞酸鈉中性樹脂，購(gòu)于北京中山生物有限公司；PGRMC1羊抗人多克隆抗體購(gòu)于Abcom公司；ki-67鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于Dako公司；S-P試劑盒（KIT-9710）購(gòu)自福州邁新公司（即用型）。

1.3 PGRMC1的免疫組織化學(xué)染色及評(píng)估

標(biāo)本的石蠟切片60℃烘烤30 min，常規(guī)脫蠟、梯度脫水水化后，室溫條件下，滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min。滴加山羊血清封閉液15 min，微波爐加熱，常溫下加入抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，15 min后再加入1：200稀釋的一抗，4℃條件下濕盒反應(yīng)8 h，37℃復(fù)溫20 min后PBS洗滌，然后每張貼片滴加生物素化二抗（兔抗人），室溫濕盒反應(yīng)45 min，PBS洗滌后，室溫下加入顯色劑DAB，根據(jù)鏡下觀察顯色信息停止顯色劑反應(yīng)，蘇木素復(fù)染核，脫水，透明，封片。孕激素膜受體陽(yáng)性表達(dá)的判定：每張切片在高倍鏡視野下隨機(jī)選擇5個(gè)有代表性區(qū)域，進(jìn)行視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后再低倍鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，利用半定量積分法，對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分，然后根據(jù)兩項(xiàng)之積的平均數(shù)定其陽(yáng)性強(qiáng)度。孕激素膜受體陽(yáng)性表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)：在胞漿中染色以棕黃色顆粒為主要成分為陽(yáng)性表達(dá)。胞漿中顆粒染色強(qiáng)弱評(píng)判：無棕黃顆粒顯色為0分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞<1/3為1分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞為1/3～2/3為2分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞>2/3為3分；再按棕黃顆粒顯色細(xì)胞所占比評(píng)判：棕黃顆粒顯色細(xì)胞<5%為0分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞介于5%～25%之間為1分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞介于26%～50%之間為2分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞介于51%～75%之間為3分，棕黃顆粒顯色細(xì)胞>75%為4分。PGRMC1染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積≤1分為陰性，PGRMC1染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積>1分為陽(yáng)性。

1.4 ki-67免疫組織化學(xué)染色及評(píng)估

標(biāo)本的石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度脫水水化后，嚴(yán)格按照ki-67免疫組織化學(xué)操作程序說明進(jìn)行，切片中ki-67陽(yáng)性表達(dá)的判定：上皮細(xì)胞核中呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性表達(dá)，按任意5個(gè)高倍鏡視野中得陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)比率的平均值并參照文獻(xiàn)資料[3]進(jìn)行分類：陰性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<3%；陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)14%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組臨床數(shù)據(jù)。用Fisher確切概率法分析TNBC臨床計(jì)數(shù)資料和孕激素膜受體的陽(yáng)性表達(dá)，用χ2檢驗(yàn)判斷分析孕激素膜受體的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法分析患者生存情況，用Log-rank檢驗(yàn)分析比較患者的生存率。PGRMC1與ki-67關(guān)系采用相關(guān)性分析及ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 TNBC組織中PGRMC1、ki-67的表達(dá)

90例TNBC組織標(biāo)本中，PGRMC1陰性表達(dá)為40例，50例為陽(yáng)性表達(dá)。鏡下在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒狀染色，PGRMC1在正常乳腺組織不表達(dá)。ki-67陰性表達(dá)25例（27.8%），陽(yáng)性表達(dá)為65例（72.2%）。陽(yáng)性表達(dá)主要以腫瘤細(xì)胞上皮細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒（封三圖3）。

2.2 TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

本組計(jì)數(shù)資料和等級(jí)資料經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：患者年齡（P=0.193）與TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)沒有相關(guān)性，而PGRMC1的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)（P=0.003），PGRMC1的表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)和腫瘤的臨床分期并不一致，與腫瘤的病理分級(jí)無關(guān)（P=0.125），但與腫瘤的臨床分期密切相關(guān)（P=0.027）；而PGRMC1的表達(dá)腫瘤體積（P=0.020）緊密相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 TNBC患者PGRMC1表達(dá)的生存曲線圖

本組臨床資料經(jīng)Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示：PGRMC1的表達(dá)與患者無瘤生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Log-rank（Mantel-cox）=14.371，P=0.031]，PGRMC1的表達(dá)與患者總生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Log-rank（Mantel-cox）=15.614，P=0.001]，TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)與患者的無瘤生存率及總生存率密切相關(guān)。多因素分析結(jié)果提示PGRMC1是TNBC獨(dú)立的腫瘤生物標(biāo)志物（P=0.001）（圖1）。

2.4 三陰性乳腺癌組織中PGRMC1和ki-67表達(dá)及相關(guān)性

2.4.1 TNBC組織中PGRMCI和ki-67的表達(dá)情況 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表2）：PGRMC1組：陽(yáng)性表達(dá)占55.6%，陰性表達(dá)占44.4%；陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；陽(yáng)性表達(dá)主要以高表達(dá)為主，與低中陽(yáng)性表達(dá)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ki-67組：陽(yáng)性表達(dá)占72.2%，陰性表達(dá)占27.8%；陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；陽(yáng)性表達(dá)主要以高表達(dá)為主，與低中陽(yáng)性表達(dá)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4.2 三陰性乳腺癌PGRMCI與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析 相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：三陰性乳腺癌PGRMCI與ki-67的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（r=0.622，P=0.000）。

2.4.3 診斷特征曲線對(duì)PGRMC1和ki-67診斷三陰性乳腺癌的評(píng)價(jià)與比較 曲線圖顯示（圖2）：PGRMCI與ki-67的ROC曲線均位于標(biāo)準(zhǔn)參考線的上方，遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)參考線，兩條曲線近乎重疊，說明PGRMCI與ki-67對(duì)三陰性乳腺癌的診斷敏感性基本接近，而且診斷的敏感性比較高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示：PGRMCI的ROC曲線下面積為0.558，面積標(biāo)準(zhǔn)誤為0.064；ki-67的ROC曲線下面積為0.567，面積標(biāo)準(zhǔn)誤為0.064；兩組曲線面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示兩個(gè)指標(biāo)診斷價(jià)值等同。

3 討論

激素信號(hào)通路是能將細(xì)胞外具有蛋白活性的分子信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)的通路，外在因素和條件下導(dǎo)致激素信號(hào)通路的異常激活，從而引起一系列的差異信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)引起異常的物質(zhì)代謝，異?；罨蟮男盘?hào)通路及由此引起的異常的物質(zhì)代謝可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中起重要作用[4，5]。三陰性乳腺癌分子表達(dá)為ER-/PR-/HER-，組織學(xué)分級(jí)差、預(yù)后差，內(nèi)分泌治療基本無效，以往研究認(rèn)為ER、PR為胞內(nèi)受體，近年來研究發(fā)現(xiàn)PGRMC1作為一種新型的膜受體在多種組織都有表達(dá)[6]，可以特異性結(jié)合雌、孕激素，該受體與腫瘤細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[7-9]，孕激素通過受體結(jié)構(gòu)中C末端的70-130氨基酸的位點(diǎn)結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)沉默PGRMC1基因的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖受到明顯抑制[10]，PGRMC1能影響3-H孕激素入胞率，導(dǎo)致孕激素介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞抗凋亡功能喪失[11，12]。以往的研究發(fā)現(xiàn)該受體為阿片類受體，但是他又與經(jīng)典的阿片類受體不具有同源性，而與細(xì)胞色素b5有高度的同源性，PGRMC1分子結(jié)構(gòu)上具有細(xì)胞色素b5配體結(jié)合位點(diǎn)，可與血紅素Hemel分子結(jié)合而成為具有多功能活性的靶蛋白。很多實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)PGRMC1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[13-16]。而對(duì)三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與PGRMC1有無內(nèi)在的相關(guān)性方面的研究資料很少，本研究試圖通過分析其腫瘤預(yù)后相關(guān)的諸多病理指標(biāo)和生物因子之間內(nèi)在的相關(guān)性，以探索其內(nèi)在聯(lián)系。

ki-67是近年來在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中“明星”因子，日益受到臨床醫(yī)生高度重視，其本質(zhì)是一種腫瘤增殖相關(guān)的核抗原蛋白，組織結(jié)構(gòu)由兩條345kd、395kd的多肽鏈組成。在細(xì)胞的有絲分裂周期中發(fā)揮重要生理作用，細(xì)胞有絲分裂G1期后半期出現(xiàn)，M期達(dá)到鋒值，而之后迅速降解而失活。研究發(fā)現(xiàn)[17-20]ki-67高表達(dá)的乳腺癌患者，腫瘤細(xì)胞增殖活躍，腫瘤的生物學(xué)行為較差，生長(zhǎng)速度快侵襲性大，惡性程度高，易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后一般都比較差。研究發(fā)現(xiàn)[3]，ki-67在正常乳腺組織也有極低水平的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比率基本都<3%以下。

目前臨床上判斷乳腺癌預(yù)后的方法和指標(biāo)很多：包括常規(guī)的評(píng)估乳腺癌預(yù)后的臨床病理指標(biāo)、激素受體表達(dá)狀況、her-2表達(dá)情況、乳腺癌危險(xiǎn)因子預(yù)測(cè)模型等，但是腫瘤的異形性和異質(zhì)性決定了現(xiàn)行的預(yù)測(cè)手段無法理想地判斷預(yù)后，進(jìn)而無法取得滿意的療效，從而導(dǎo)致腫瘤早期出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者生存質(zhì)量下降和生存時(shí)間縮短。本課題研究發(fā)現(xiàn)ki-67與PGRMC1在三陰性乳腺癌的表達(dá)呈正相關(guān)，在三陰性乳腺癌的表達(dá)中陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的趨勢(shì)基本一致，二者在三陰性乳腺癌中均為高表達(dá)。診斷特征曲線對(duì)PGRMC1和ki-67診斷三陰性乳腺癌敏感度也是基本接近，有較高的敏感度。那么兩者之間是否存在內(nèi)在的必然的聯(lián)系，目前有關(guān)這方面的研究很少[21]，是否存在PGRMC1結(jié)合胞漿游離雌、孕激素而激活下游基因從而引起ki-67的高表達(dá)？那么敲除PGRMC1基因后ki-67增殖活性降低？從而降低腫瘤的侵襲性。ki-67在有絲分裂周期中需要經(jīng)過磷酸化和去磷酸化然后才能降解，雙肽鏈的結(jié)構(gòu)或可提示我們ki-67表達(dá)可能受蛋白酶旁路調(diào)控。PGRMC1能激活細(xì)胞內(nèi)的Akt激酶，從而引起Akt的磷酸化。由此可以推測(cè)PGRMC1作為一種活性轉(zhuǎn)換蛋白直接參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化?；罨腁kt參與了ki-67磷酸化，從而干預(yù)有絲分裂的進(jìn)程。本臨床研究只是發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律，要揭示這些真相有待后續(xù)的基礎(chǔ)研究進(jìn)行驗(yàn)證和考量。

既往研究證實(shí)PGRMC1既具有孕激素受體功用，同時(shí)也具有雌激素受體的效能，在乳腺癌發(fā)展途中雌激素受體陰性的乳腺癌有著更強(qiáng)的侵襲性，以及與雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌有著不同的代謝通路和模式。因此，PGRMC1作為雌激素的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，在三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用，可能成為三陰性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。本課題分析了PGRMC1和ki-67在正常乳腺組織及三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGRMC1在三陰性乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PGRMC1陽(yáng)性表達(dá)在三陰性乳腺癌組織中呈現(xiàn)不均衡性，強(qiáng)弱不等，不同組織切片中PGRMC1表達(dá)有差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)同一張組織切片PGRMC1表達(dá)在不同區(qū)域顆粒著色不均一。進(jìn)而探索分析TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)和ki-67之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNBC組織中PGRMC1的表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為、總體生存率、無瘤生存率以及ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)性；多因素統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示PGRMC1可作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤生物標(biāo)志物，以及癌干細(xì)胞的治療靶標(biāo)（P=0.002）。

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（收稿日期：2016-08-19）