高 倩,秦小明,鐘賽意,陳建平

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

黑曲霉中β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵優(yōu)化及純化研究

高 倩,秦小明*,鐘賽意,陳建平

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

為研究黑曲霉CICC 2475產β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件及其分離純化過程。利用JMP 7.0中的神經網絡平臺,對黑曲霉CICC 2475產β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。通過硫酸銨分級鹽析,DEAE-52陰離子交換層析和Sephacryl S-300 High resolution對粗酶液進行純化,采用SDS-PAGE凝膠電泳測定其分子量。實驗結果表明,黑曲霉產酶的最佳發(fā)酵條件:接種量11.0%、初始pH5.6、發(fā)酵時間130.0 h、裝液量70.0 mL,在該條件下所產β-葡萄糖苷酶的酶活力達118.73 U/mL;經離子交換和凝膠色譜層析可有效純化β-葡萄糖苷酶,得其分子量約為1.3×105。

黑曲霉CICC2475,β-葡萄糖苷酶,神經網絡,純化

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase)是一種纖維素酶類水解酶,廣泛存在于各類生物體中,作用于芳基或羥基與糖基原子團之間的糖苷鍵,生成β-D-葡萄糖及相應配基[1]。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶中的一種,可促進纖維二糖的水解,提高纖維素酶系的水解活性,在纖維素降解過程中發(fā)揮著關鍵作用[2],同時在食品[3-5]、醫(yī)藥[6-7]、煙草[8]、農業(yè)[9]等領域具有重要的作用。

研究學者先后從各種植物和微生物中分離純化出β-葡萄糖苷酶,并研究其生物化學特性[10-12],但是國內研究所純化出的β-葡萄糖苷酶酶活力較低、成本高,且來源不同、培養(yǎng)條件不同所產生的不同分子量的β-葡萄糖苷酶結構和組成研究不足等問題仍然是目前β-葡萄糖苷酶的研究瓶頸。因此需要在產酶的條件優(yōu)化及其分離純化技術的研究上取得突破。

黑曲霉發(fā)酵周期較短,安全可靠,無有毒物質,其所產β-葡萄糖苷酶的安全性是國際公認的[13],廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)。本文利用JMP 7.0中的神經網絡,在接種量、初始pH、發(fā)酵時間和裝液量等四個方面對黑曲霉CICC 2475發(fā)酵產β-葡萄糖苷酶工藝條件進行優(yōu)化,并先后通過硫酸銨分級鹽析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析,對該酶進行分離純化,以獲得酶活力較高及純度較好的β-葡萄糖苷酶,為后續(xù)研究該酶的結構組成及酶解機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2475,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。將菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基中,25 ℃活化5 d。

種子培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20,葡萄糖10,MgSO4·7H2O 1,KH2PO41,酵母膏5,自然pH(不加調整),121 ℃滅菌20 min;

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[14]:麩皮20,硫酸銨1.5,KH2PO42,MgSO4·7H2O 1,吐溫-80 2 mL,pH5.6,121 ℃滅菌20 min。

DEAE-52,SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 購于廣州鼎國生物科技有限公司;對硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG),Sephacryl S-300 High resolution 購于上海源葉生物科技有限公司;考馬斯亮藍 購于南京建成生物科技有限公司;檸檬酸,檸檬酸鈉,無水碳酸鈉、硫酸銨均為國產分析純。

SW-CJ-270凈化工作臺 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;UV-3200PC紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HZQ-A全溫培養(yǎng)搖床 蘇州威爾實驗用品有限公司;高速落地離心機 Thermo Lynx6000,Thermo Scientific;冷凍干燥機 KA1013,韓國;pHS-2C pH計 德國賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活性測定 1.8 mL、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中加入0.1 mL、10 mmol/L對硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG)作為反應底物,加入0.1 mL酶液,45 ℃反應30 min后加入2 mL、1 mol/L Na2CO3終止反應并顯色,在410 nm處測定吸光值。45 ℃時,每分鐘每毫升酶液酶解1 μmol pNPG的酶活力為一個酶活單位(U/mL)。

1.2.2 蛋白含量的測定 蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1.2.3 酶蛋白純度的測定 酶蛋白純度的測定采用SDS-PAGE法。

1.2.4 粗酶液的制備 在PDA斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌種,接種于裝有200 mL種子培養(yǎng)液的500 mL搖瓶中,28 ℃下培養(yǎng)48 h,按一定接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中,28 ℃,170 r/min下培養(yǎng),4500 r/min條件下離心10 min,取上清液。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)稀釋5倍,用于酶活性的測定。

1.2.5 神經網絡模型建立 本研究以接種量(X1)、初始pH(X2)、發(fā)酵時間(X3)、裝液量(X4)4個實驗因素為主,以酶活(U/mL)為響應因素。采用Box-Behnken設計因素水平編碼表(表1)。采用JMP 7.0數據處理軟件中的神經網絡平臺,建立神經網絡模型及對產酶工藝條件的優(yōu)化分析。

在經過多次對交叉驗證組數K及隱藏節(jié)點的神經網絡訓練之后,確定交叉驗證組數K值為5,采用4×5×1結構的三層神經網絡(圖1)。設置隱藏節(jié)點數5,過擬合罰項0.001,歷程數16,最大迭代數50,收斂準則0.00001,交叉驗證組數K為5,執(zhí)行神經網絡模型的擬合迭代過程,擬合決定系數R2值為0.99以上。

表1 因素水平編碼表

圖1 神經網絡結構圖Fig.1 Structure of artificial neural network

1.2.6 酶的分離純化 利用優(yōu)化后的產酶參數進行發(fā)酵實驗,離心得到粗酶液。將一定體積的粗酶液分成15份,每份50 mL,分別加入硫酸銨使硫酸銨飽和度分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,4 ℃條件下靜置過夜后10000 r/min離心10 min。分離沉淀和上清,沉淀溶于50 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,分別測定上清和沉淀的相對酶活,確定硫酸銨的分級飽和度。經初步純化后的樣品依次經過DEAE-52陰離子交換柱及Sephacryl S-300 High resolution層析,收集活性部分用SDS-PAGE電泳檢測純度。

2 結果與討論

2.1 產酶工藝條件優(yōu)化

2.1.1 Box-Behnken設計及實驗 結果如表2。

表2 Box-Behnken設計及結果

圖2 接種量、初始pH、發(fā)酵時間和裝液量對產酶的影響Fig.2 Effect of inoculation amount、fermentation pH、fermentation time and broth content on production of enzymes

2.1.2 神經網絡模型分析 固定接種量(X1)、初始pH(X2)、發(fā)酵時間(X3)和裝液量(X4)四個因素中的兩個因素為中間水平,作三維曲面圖,將得到四個因素對黑曲霉發(fā)酵產β-葡萄糖苷酶的酶活力的影響規(guī)律進行預測分析,結果見圖2。

從圖2a、圖2b、圖2c中可以看出,在pH約低于5.5時,酶活逐漸增加;而高于5.5后,酶活逐漸降低,可見環(huán)境的酸堿程度會明顯影響酶的活力。菌體的生長及產物的合成都有一個最適的酸堿環(huán)境,偏酸或偏堿的環(huán)境會改變膜的通透性,進而影響黑曲霉的正常生長,進而導致產酶量及酶活力降低[15]。

圖2a、圖2d和圖2e中顯示,隨著發(fā)酵時間的延長,酶活明顯增加,在發(fā)酵時間達到約130 h后逐漸平穩(wěn)。這是因為在一定的發(fā)酵時間內,產酶量逐漸增加,隨著發(fā)酵時間的延長,培養(yǎng)基內的營養(yǎng)逐漸減少,這導致菌體停止產酶并開始衰亡。

圖3 神經網絡模型的預測刻畫器Fig.3 Prediction plot of the neural network

從圖2b、圖2d和圖2f中顯示出酶活隨著接種量的增加,呈現出先增加后降低的趨勢。接種量過低,產酶活力則低;接種量過大,可能會使菌體的濃度增大,培養(yǎng)液對菌體的供養(yǎng)不足,則產酶降低[16]。圖中顯示在約小于11%時,酶活逐漸增加;當約大于11%后,酶活逐漸下降,這說明接種量存在一個最適值。

從圖2c、圖2e和圖2f中可以看出,裝液量對黑曲霉產酶的影響顯著,在裝液量大于約70 mL時,酶活有顯著下降的趨勢。這是因為黑曲霉為好氧微生物,裝液量過大,則溶氧量減少,致使菌體的生長緩慢,產酶隨之降低[17]。

根據接種量、初始pH、發(fā)酵時間和裝液量四個因素對黑曲霉產β-葡萄糖苷酶的影響規(guī)律,采用JMP 7.0軟件中的預測刻畫器,優(yōu)化黑曲霉產酶的條件,預測刻畫見圖3。

從圖3中得出,在接種量為11.09%,初始pH為5.65,發(fā)酵時間為130.91 h,裝液量為70.38 mL時,黑曲霉發(fā)酵生產β-葡萄糖苷酶的預測酶活值達到最大?？紤]到實驗條件的可控性,確定在接種量11.0%,初始pH5.6,發(fā)酵時間130 h,裝液量70 mL條件下進行產酶實驗,該條件下預測酶活值120.24 U/mL,實驗得到的平均酶活118.73 U/mL,相對誤差0.63%,說明可利用神經網絡模型對黑曲霉產β-葡萄糖苷酶進行預測分析。

2.2 硫酸銨分級鹽析

不同百分飽和度的硫酸銨鹽析曲線如圖4。

圖4 硫酸銨分級鹽析曲線Fig.4 Precipitation fractional curve by saturated ammonium sulfate注：相同小寫字母和大寫字母分別表示上清液相對酶活 和沉淀相對酶活在不同硫酸銨飽和度之間的 差異不顯著(p>0.05),否則差異顯著(p<0.05)。

由圖4可知,當硫酸銨飽和度在0～35%時,上清和沉淀的相對酶活差異性不顯著,說明在此區(qū)間內,硫酸銨對酶的作用很小;當硫酸銨飽和度在35%～60%時,上清和沉淀的相對酶活開始出現顯著差異,但曲線相對平穩(wěn),原因是此階段鹽離子與溶液中的自由態(tài)水分子結合,對酶表面的水分子影響較小[18],當硫酸銨飽和度在60%～80%時,鹽析作用增強,原因可能是在該濃度下,鹽離子大量爭奪酶表面的水分子,破壞了酶表面水化膜,暴露出疏水區(qū)域,降低溶解度[19];當硫酸銨飽和度大于80%時,雖然上清液相對酶活存在差異,但沉淀相對酶活差異性不顯著。從以上分析來看,先選用飽和度為35%的硫酸銨除去雜蛋白,再采用80%飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白。

2.3 離子交換層析

鹽析后的蛋白沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,4 ℃下透析脫鹽,樣品經0.22 μm的水系微孔濾膜過濾除去雜質,上樣至DEAE-52陰離子交換層析柱中。依次用pH為5.0的20 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、含0.1 mol/L NaCl的緩沖液、0.3 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,每8 mL收集1管。洗脫得到3個蛋白峰如圖5。

圖5 β-葡萄糖苷酶DEAE-52陰離子交換層析Fig.5 The ion-exchange chromatography for β-glucosidase on DEAE-52

從圖中可以看出,β-葡萄糖苷酶經過離子交換層析后在280 nm下檢測出現3個峰。收集各峰組分在410 nm下檢測則出現2個明顯的峰,且峰值較高,其中第1個蛋白峰在410 nm時沒有吸收峰,可以斷定該峰為雜蛋白峰,峰2比酶活相對較低,且收集量較少。因此收集第3峰的酶液進行后續(xù)分離純化。

2.4 凝膠柱層析

表3 β-葡萄糖苷酶純化及結果

將離子交換層析后收集到的樣品經蒸餾水透析,冷凍干燥濃縮及0.22 μm的水系微孔濾膜過濾,上樣于Sephacryl S-300 High resolution中層析,用pH為5.0的20 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫,流速為0.5 mL/min,每4 mL收集1管。洗脫結果如圖6。

圖6 β-葡萄糖苷酶Sephacryl S-300 High resolution層析Fig.6 The chromatography for β-glucosidase by Sephacryl S-300 High resolution

凝膠柱層析的結果如圖所示,經過Sephacryl S-300 High resolution層析后,樣品得到兩個蛋白峰。經過酶活力測定后發(fā)現峰1相比峰2酶活性較高且蛋白量較多,從經濟方面考慮收集第1個峰的蛋白組分進行后續(xù)應用研究。

2.5 純度檢測及得率

將收集得到的各純化步驟的葡萄糖苷酶進行SDS-PAGE電泳,結果如圖7。

圖7 SDS-PAGE電泳結果Fig.7 SDS-PAGE result of β-glucosidase注：1.蛋白Marker;2.粗酶液;3.鹽析透析液; 4.離子后收集液;5.凝膠后收集液。

經過SDS-PAGE電泳后可看出,每步的分離純化均達到了一定的純化效果且純化后酶液呈單一條帶,說明純化的程度較高。與蛋白Marker相比較,純化后的酶液蛋白分子量約為1.3×105Da。

經過硫酸銨分級鹽析,DEAE-52陰離子交換層析及Sephacryl S-300 High resolution凝膠柱層析后,β-葡萄糖苷酶的比活力從初始的481.15提高到854.57,純化倍數逐漸增加到1.78,最終得率為27.94%。

3 結論

本研究利用JMP 7.0軟件中的神經網絡模型,從接種量、初始pH、發(fā)酵時間及裝液量四個方面優(yōu)化了黑曲霉CICC 2475產β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝,得到最佳發(fā)酵工藝條件為接種量11.0%,初始pH5.6,發(fā)酵時間130 h,裝液量70.0 mL,制備的β-葡萄糖苷酶的最大酶活力平均為118.73 U/mL。同時經過分級鹽析及柱層析對該酶進行分離純化,得到分子量約為1.3×105Da的β-葡萄糖苷酶,為β-葡萄糖苷酶的提取純化、結構性質及應用研究提供進一步實驗基礎。

[1]Mei C,Qin Y,Liu Z,et al. Isolation and characterization of aβ-glucosidase from Penicillium decumbens,and improving hydrolysis of corncob residue by using it as cellulase supplementation[J]. Enzyme & Microbial Technology,2010,46(6):444-449.

[2]Kolbe J,Kubicek C P. Quantification and identification of the main components of the Trichoderma,cellulase complex with monoclonal antibodies using an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,1990,34(1):26-30.

[3]Ren J N,Yang Z Y,Tai Y N,et al. Characteristics ofβ-glucosidase from oranges during maturation and its relationship with changes in bound volatile compounds[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2015,95(11):2345-2352.

[4]Agrawal R,Verma A K,Satlewal A. Application of nanoparticle-immobilized thermostableβ-glucosidase for improving the sugarcane juice properties[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2016,33:472-482.

[5]Vernocchi P,Patrignani F,Ndagijimana M,et al. Trebbiano wine produced by usingSaccharomycescerevisiaestrains endowed withβ-glucosidase activity[J]. Annals of Microbiology,2015:1-7.

[6]Lima F S D,Ida E I. Optimization of soybean hydrothermal treatment for the conversion ofβ-glucoside isoflavones to aglycones[J]. Food Science and Technology,2014,56(2):232-239.

[7]Singh N D,Kumar S,Daniell H. Expression ofβ-glucosidase increases trichome density and artemisinin content in transgenic Artemisia annua plants[J]. Plant Biotechnology Journal,2016,14(3):1034-1045.

[8]DongHeng Guo,YanShan Xu,YaJun Kang,et al. Synthesis ofoctyl-β-D-glucopyranoside catalyzed by Thai rosewoodβ-glucosidase-displaying Pichia pastoris in an aqueous/organic two-phase system[J]. Enzyme Microbial Technology,2016,85:90-97.

[9]Li D,Li X,Dang W,et al. Characterization and application of an acidophilic and thermostableβ-glucosidase from Thermofilum pendens[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2013,115(5):490-496.

[12]Narasimha Golla,Sridevi Ayla,Ramanjaneyulu Golla,et al. Purification and characterization ofβ-glucosidase fromAspergillusniger[J]. International Journal of Food Properties,2016,19(3):652-661.

[13]先天敏,陳介南,張林. 黑曲霉改良株C112產β-葡萄糖苷酶的誘導及條件優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學學報,2013,11:154-161.

[14]徐星,肖華,黃琳琳,等. 黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的純化及酶學性質的研究[J]. 天津科技大學學報,2015,05:15-19.

[15]Oncu S,Tari C,Unluturk S. Effect of Various Process Parameters on Morphology,Rheology,and Polygalacturonase Production by Aspergillus sojae,in a Batch Bioreactor[J]. Biotechnology Progress,2007,23(23):836-45.

[16]馬旭光,張宗舟,霍建泰,等. 航天誘變黑曲霉ZM-8發(fā)酵玉米秸稈粉產β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基組分優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(6):236-239,243.

[17]王蕊,王林風,閆德冉,等. 畢赤酵母表達β-葡萄糖苷酶中試條件優(yōu)化[J]. 食品科技,2015,12:15-19.

[18]楊亞東. 凡納濱對蝦腸道產蛋白酶菌株的篩選鑒定及酶學性質研究[D]. 湛江：廣東海洋大學,2015.

[19]朱麗萍,顏世敢,李雁冰,等. 硫酸銨鹽析條件對多管藻R-藻紅蛋白和R-藻藍蛋白得率和純度的影響[J]. 科技導報,2010(4):37-41.

Study on the fermentation conditions and purification ofβ-glucosidase fromAspergillusniger

GAO Qian,QIN Xiao-ming*,ZHONG Sai-yi,CHEN Jian-ping

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

To find the conditions of fermentation and purification process ofβ-glucosidase fromAspergillusnigerCICC 2475. The fermentation conditions ofβ-glucosidase fromAspergillusnigerCICC 2475 were optimized by artificial neural network in JMP 7.0. The crude enzyme was precipitated with ammonium sulfate,purified with DEAE-52 anion exchange chromatography and Sephacryl S-300 High resolution,and the enzyme molecular weights were identified by SDS-PAGE. The results showed that,the optimal fermentation conditions were as follows,inoculation amount 11.0%,initial pH5.6,fermentation time 130 h and broth content 70.0 mL,at this point,the enzyme activity reached 118.73 U/mL. Theβ-glucosidase could be efficiently purify by anion exchange chromatography and gel chromatography,and the enzyme molecular weights were about 1.3×105.

AspergillusnigerCICC2475;β-glucosidase;artificial neural network;purification

2016-09-13

高倩(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏,E-mail:spygaoqian2010@sina.com。

*通訊作者:秦小明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：亞熱帶食品新資源開發(fā)與利用,E-mail:xiaoming0502@21cn.com。

亞熱帶果蔬加工與利用技術研究(廣東省教育廳創(chuàng)新強校工程項目2013050214)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.024