聞奮亮，王銀海，趙 蓮，賴曉芳,2,3，閻斌倫,2,3，高 煥,2,3

(1．淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222001; 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺，南京 210014)

不同地理群體三疣梭子蟹mtDNA本底甲基化水平分析

聞奮亮1，王銀海1，趙 蓮1，賴曉芳1,2,3，閻斌倫1,2,3，高 煥1,2,3

(1．淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222001; 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺，南京 210014)

利用重亞硫酸鹽測序法，對適于三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)線粒體基因組甲基化分析的BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物進行了篩選，在設計的21對引物中，獲得了12對BSP引物。利用這12對引物分析了三疣梭子蟹海州灣群體(江蘇連云港)和萊州灣群體(山東東營)線粒體基因組本底甲基化水平，結果表明：海州灣群體不存在甲基化現(xiàn)象，萊州灣群體發(fā)現(xiàn)了2個個體在ND2基因(NADH脫氫酶亞基2)位點存在甲基化現(xiàn)象；在存在甲基化的個體中，甲基化類型主要為CHG和CHH類型，還有少量CpG類型。該研究結果說明，萊州灣群體和海州灣群體線粒體基因組本底水平上的甲基化特征存在一定差異，相關研究值得進一步深入探討。

三疣梭子蟹; 線粒體基因組; 甲基化; 地理群體

表觀遺傳學闡釋了內(nèi)在遺傳物質和環(huán)境互作的關系，因不斷有新的發(fā)現(xiàn)被報道，因此一直是生命科學研究的熱點之一[1]。表觀遺傳的主要機制包括DNA甲基化、核染色質修飾、基因組印記及非編碼microRNA變化等[2]，其中DNA甲基化是從細菌到高等生物都普遍存在的表觀修飾現(xiàn)象[3]。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶(DNMT)的催化下, 以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體, 將甲基轉移到特定堿基上的過程[4]。DNA甲基化與基因表達密切相關，其通過與反式作用因子相互作用或通過改變?nèi)旧|結構而影響表達, 在細胞分化、發(fā)育、X 染色體失活、基因組印記及腫瘤發(fā)生中都起著重要的作用[5]。

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我國黃渤海沿海地區(qū)最重要的經(jīng)濟蟹類之一，關于其種質資源的研究一直受到廣泛的關注[6-7]。按照地理分布情況，三疣梭子蟹通常被劃分成不同的地理群體，如舟山群體、海州灣群體、萊州灣群體等[8]。有學者認為，萊州灣群體是一個比較特殊的群體，幾乎是封閉在萊州灣內(nèi)，與其它群體基因交流的機會很少，而舟山和海州灣自然群體間則存在著比較廣泛的基因交流[9-10]。目前，這些不同地理群體遺傳特征的研究方法主要是采用核基因組序列標記[11-12]、線粒體序列標記[13-14]等方法展開的，這些不同的技術方法多角度反映出三疣梭子蟹不同地理群體的遺傳差異特征，但一直未見表觀遺傳學特征差異方面的文獻報道。本文對萊州灣和海州灣兩個地理群體線粒體基因組本底水平的甲基化情況進行了研究，以期為更好地了解三疣梭子蟹種質資源的狀況提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三疣梭子蟹海州灣群體和萊州灣群體分別采自江蘇連云港和山東東營近海自然海捕個體，均為成年個體，其中海州灣群體平均體質量為(260±14) g，萊州灣群體平均體質量為(185±11) g。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

利用DNA提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取兩個群體三疣梭子蟹的總基因組DNA(內(nèi)含線粒體基因組DNA)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA樣本的完整性，并利用蛋白核酸定量儀(Nano drop 2000)對DNA質量進行檢測。

1.2.2 mtDNA甲基化引物設計、篩選

根據(jù)三疣梭子蟹線粒體基因組全序列[15]，利用甲基化引物設計軟件Methprimer(www.urogene.org/methprimer)尋找三疣梭子蟹mtDNA序列中富含CG的區(qū)域，并據(jù)此設計了21對甲基化BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物(見表1)。

利用重亞硫酸測序法試劑盒(EpiMarkTM, New Englang Biolabs Inc.)對由6個海州灣個體組成的混合基因組DNA進行處理，并以處理后的基因組DNA為PCR模板進行BSP 引物的驗證和篩選；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證有無，對有擴增條帶的片段進行膠回收，經(jīng)過克隆和測序獲得引物擴增序列，與三疣梭子蟹線粒體基因組原序列對比確認是否為線粒體基因組的擴增產(chǎn)物。

1.2.3 不同地理群體線粒體基因組的甲基化分析

利用Ezup柱式動物基因組抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取海州灣和萊州灣群體各20 ind個體的基因組DNA，利用重亞硫酸測序法試劑盒(EpiMarkTM, New Englang Biolabs Inc.)對這些個體DNA分別進行處理，以上述篩選出的BSP引物對處理后的基因組進行PCR擴增，擴增體系為25 μL(5 μL EpiMark Buffer，0.5 μL 10 mM dNTPs，10 μM 正反向引物各0.5 μL，DNA模板6 μL，EpiMark 熱啟動酶1U,其余為ddH2O)。采用Touch-down PCR程序進行擴增：95 ℃起始變性30 s，然后執(zhí)行95 ℃變性15 s，55 ℃復性30 s，68 ℃延伸45 s的循環(huán)，其中退火溫度每個循環(huán)降低0.5 ℃，進行14個循環(huán)后再以48 ℃固定退火溫度進行20個循環(huán)，循環(huán)結束后以68 ℃延伸5min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序，采用QUMA軟件( http://quma.cdb.riken.jp)把測序序列與原線粒體基因組序列進行對比，以確認甲基化的有無及特征。

2 結果

2.1 甲基化引物篩選結果

對設計的每一個引物，根據(jù)其在三疣梭子蟹線粒體基因組中位置進行了命名編號。在設計的21對BSP引物中，共獲得12對PCR產(chǎn)物清晰、可重復的引物對，具體見表1，經(jīng)過克隆測序驗證，這些引物的PCR擴增區(qū)均為三疣梭子蟹線粒體基因組序列。部分引物的篩選結果見圖1，其中1、2、3、4、5、6和7分別為表1中編號為9～15號的引物。

圖1 部分BSP引物篩選結果Fig.1 Screening results of partial BSP prime pairs by PCR amplification

2.2 不同地理群體mtDNA甲基化特征

分別利用上述12對BSP引物對海州灣和萊州灣群體進行了甲基化特征分析。在海州灣20 ind個體中，沒有發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象；而在萊州灣群體中發(fā)現(xiàn)2 ind個體存在甲基化現(xiàn)象，其位置都是第21號BSP引物對的擴增區(qū)，即線粒體基因組序列中的14902～15120 bp區(qū)間，為ND2(NADH脫氫酶亞基2)基因中的部分序列，具體見圖2。圖2中的A為mtDNA中14902～15120區(qū)間的原序列，B為測序獲得的此區(qū)間發(fā)生甲基化后的序列；與B中的序列相比，A中利用方框標出了發(fā)生甲基化的位點(當兩個甲基化位點連在一起時，則把前一個加粗顯示)，而作為對照，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶C(黃色標出)則在B中轉化為了胸腺嘧啶T(下劃線標注)。

從圖2中也可以看出，三疣梭子蟹線粒體基因組中甲基化類型主要為CHG和CHH類型，還有少量CpG類型(CGG 和CGH)(H為A、C或T)。在三疣梭子蟹線粒體14902～15120區(qū)間，共發(fā)現(xiàn)25個甲基化位點，其中CHG和CHH類型共計22個，占88%；CpG類型(CGG 和CGH)3個，占12%。

表1 三疣梭子蟹線粒體基因組BSP引物Tab.1 BSP primer pairs for mtDNA in P.trituberculatus

續(xù)表1

圖2 21#引物擴增區(qū)的甲基化模式(框中標出的C位點為發(fā)生甲基化的位點)Fig.2 Methylation pattern of the amplification zone of primers 21#

3 討論

線粒體基因組DNA為閉合環(huán)狀雙鏈結構，由于其富含AT序列，因此缺少典型的CpG島結構，這給線粒體基因組甲基化位點的尋找?guī)砹死щy。之前的研究曾經(jīng)在脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)線粒體基因組中利用Methprimer軟件通過覆蓋全基因組的設計方法來考查整個線粒體基因組水平上的甲基化特征，設計了51對引物，但只有10對引物具有有效的擴增結果[16]。本研究利用Methprimer軟件先對CG富含區(qū)(序列中CG含量超過30%)進行篩選，然后以這些CG富含區(qū)為中心設計了21對引物，其中12對引物具有有效的擴增結果，這說明該策略對于線粒體基因組DNA甲基化BSP引物的篩選效果較好，對于指導類似研究具有參考價值。

已有研究證實萊州灣群體和海州灣群體在線粒體基因組DNA序列上存在遺傳多樣性差異[7]，本研究發(fā)現(xiàn)在線粒體基因組甲基化本底水平上，海州灣群體和萊州灣群體也存在一定差異：萊州灣群體存在一些甲基化的個體，而海州灣群體則沒有。當然，這是否是兩個群體間特定差異特征還有待進一步驗證。一方面，限于人力和物力條件(重亞硫酸鹽測序法試劑盒價格高、需要克隆測序的數(shù)量也很大)，只分析了兩個群體的各20 ind個體；另一方面已有的研究表明，多種環(huán)境因素和生理狀況都會影響基因組或者線粒體基因組DNA水平上的甲基化狀況，包括重金屬[17]、飼料營養(yǎng)成分[18]、饑餓狀態(tài)[16]等，因此取樣背景的差異也可能造成結果的不同。

本研究結果表明,三疣梭子蟹線粒體基因組甲基化類型主要為CHG和CHH類型，還有少量CpG類型(CGG 和CGH)(H為A、C或T)，這與同屬甲殼動物的脊尾白蝦中發(fā)現(xiàn)的線粒體基因組甲基化特征略有不同，與哺乳動物相比更存在較大差異。在脊尾白蝦中，是以CpG類型為主，而CHG和CHH類型較少[16]。在哺乳動物中，DNA甲基化類型主要是CpG，而植物中除了CpG甲基化外，還有CHG和CHH的甲基化[19]。由此也提出了一個新的值得深入研究和探討的問題，即甲基化類型是否也揭示了生物的進化程度。

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Analysis of methylation profile level in the background for the blue swimming crabPortunustrituberculatusof different geographical populations

WEN Fen-liang1, WANG Yin-hai1, ZHAO Lian1, LAI Xiao-fang1,2,3, YAN Bin-lun1,2,3, GAO Huan1,2,3

(1.CollegeofMarineLifeandFisheries,JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China; 2.JiangsuProvinceMarineResourcesDevelopmentResearchInstitute,Lianyungang222001,China; 3.JiangsuProvincialPlatformforConservationandUtilizationofAgriculturalGermplasm,Nanjing210014,China)

For the high scientific and commercial value, the protection and utilization of germplasm resource of the blue swimming crab,Portunustrituberculatus, has attracted more and more attentions in past decades. The blue swimming crab is widely distributed in the coastal areas along the Bohai Sea, the Yellow Sea, the East China Sea and the South China Sea. Previous studies showed that the wild population located in Laizhou bay of Bohai Sea was different from the other populations, and only obseved in the Laizhou bay. The evidences supporting the conclusions above mainly came from the comparative analysis of nuclear DNA and mtDNA sequences among different populations. To obtain more evidences, the genetic differences between Laizhou bay population and other populations were compared at the level of epigenetics. Based on the Bisulphite Sequencing, the BSP (Bisulfite sequencing PCR) primer pairs of mtDNA were screened inP.trituberculatus. In the designed 21 primer pairs, twelve were useful for analyzing the methylation profiles of mtDNA. Then the methylation background levels of two geographical populations, Haizhou bay (Lianyungang of Jiangsu province) and Laizhou bay (Dongying of Shandong province) were clarified by the 12 primer pairs. The results showed that no methylation phenomenon was found in Haizhou bay population, while 2 individuals with methylation were found in the Laizhou bay population. The methylation sites were located in the gene of ND2. Excluding few CpG type, the main methylation types in the methylated individuals were CHG and CHH (H is A, C or T). The findings provide further evidences for proving that the Laizhou bay population is different from the Haizhou bay population.

P.trituberculatus; mtDNA; methylation; geographical populations

1004-2490(2017)02-0190-07

2016-06-15

江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖學品牌專業(yè)建設經(jīng)費；2014年度江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目(5509013)；國家自然科學基金(31472282)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(13KJA240001)；“江蘇省水產(chǎn)三新工程(D2014-17)；江蘇省高校“青藍工程”培養(yǎng)基金

聞奮亮(1993-)，男，2012級水產(chǎn)養(yǎng)殖學專業(yè)本科生,主要從事甲殼類遺傳學研究。 E-mail:451460713@qq.com

高 煥，副教授。E-mail: huanmr@163.com

S 965.199

A