孟曉華

市售酸奶中乳酸菌的分離與鑒定

孟曉華

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

采用MRS培養(yǎng)基和普通肉汁培養(yǎng)基平板涂布法，分離鶴壁市市售三劍客酸奶和三劍客老酸奶產(chǎn)品中的乳酸菌，并進行革蘭氏染色初步鑒定；采用糖發(fā)酵試驗和生理生化試驗對菌種進行鑒定，通過平板菌落計數(shù)法計算酸奶中的乳酸菌數(shù)和桿球比。結(jié)果表明，三劍客老酸奶產(chǎn)品中的乳酸菌數(shù)比三劍客酸奶中的乳酸菌數(shù)高。

酸奶；乳酸菌；革蘭氏染色；糖發(fā)酵管

酸奶是以鮮乳（或乳粉）和白砂糖為主要原料，加入經(jīng)特殊篩選的乳酸菌，在適宜溫度下（30～40℃）發(fā)酵制成含活性乳酸菌的乳產(chǎn)品。酸奶中含活力強的乳酸菌，能加強腸的蠕動和機體的物質(zhì)代謝，促進消化吸收，是一種非常有利于人體健康的乳制品。試驗利用平板涂布法、革蘭氏染色法、糖發(fā)酵試驗和生理生化試驗對市售三劍客酸奶和老酸奶中的乳酸菌進行分離和鑒定，并通過平板菌落計數(shù)計算三劍客酸奶及三劍客老酸奶中的乳酸菌數(shù)和桿球比，為人們消費提供合理化建議。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

三劍客酸奶和三劍客老酸奶，市售。2種酸奶均采用同一天生產(chǎn)、容量相同的瓶裝原味發(fā)酵酸奶。

MRS培養(yǎng)基、普通肉汁培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管等。

酪蛋白胨、牛肉浸取物、酵母提取液、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸二胺、吐溫80、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸錳、碳酸鈣、瓊脂、1.6%溴甲酚紫酒精溶液、草酸銨結(jié)晶紫溶液、盧哥氏碘液、95%乙醇、番紅、香柏油、二甲苯、葡萄糖、白砂糖、乳糖、酒精、氫氧化鈉、pH值試紙、生理鹽水、蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器、DH3600型恒溫培養(yǎng)箱、101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、XSP-2C型雙筒生物顯微鏡、SW-CJ-2D型凈化工作臺、XK97-A型菌落計數(shù)器、電子萬用爐。

1.3 酸奶中乳酸菌的分離

1.3.1 初篩

（1）培養(yǎng)基的制備。①MRS培養(yǎng)基[1]。酪蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，吐溫80 1.0g，磷酸氫二鉀2.0g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05g，碳酸鈣20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8。②普通肉汁培養(yǎng)基。蛋白胨10g，牛肉浸提物3g，NaCl5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH值7.0。③糖發(fā)酵管的制作。牛肉膏5.0g，酵母浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，吐溫800.5mL，瓊脂1.5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL，蒸餾水1L，按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖、白砂糖、乳糖，分裝于試管中121℃高壓滅菌15min。

（2）平板涂布分離法。按照無菌操作要求，從市售新鮮三劍客酸奶和三劍客老酸奶中各吸取10mL檢樣，放入裝有90mL無菌水的燒杯內(nèi)，振搖混勻。將樣品充分搖勻后，用10倍稀釋法稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4各種稀釋度的樣品液。梯度稀釋樣液后，將稀釋液分別進行平板涂布分離。將MRS培養(yǎng)基平板置于厭氧條件下37℃培養(yǎng)48h；普通肉汁培養(yǎng)基放在需氧條件下37℃培養(yǎng)48h；隔一段時間觀察1次。菌落及周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌[2]，挑取單菌落，做革蘭氏染色、鏡檢。

（3）酸奶中乳酸菌鏡檢涂片的特殊染色法。取1塊干凈載玻片，滴上1滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量單菌落于載玻片上，涂成薄薄的涂面，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次固定。在載玻片上滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染色液（美藍染液）染色約1min，用水小心沖洗后滴加盧哥氏碘液媒染1min，洗去碘液并將玻片傾斜連續(xù)滴加95%乙醇脫色20～25s至流出液無色再水洗，滴加番紅復(fù)染5min洗去涂片上的番紅染液，晾干。分別用不同倍數(shù)的顯微鏡鏡檢。

1.3.2 復(fù)篩

（1）糖發(fā)酵試驗[3]。取葡萄糖、乳糖、白砂糖3種糖發(fā)酵半固體培養(yǎng)基，分裝試管，高度為4～5cm。用接種環(huán)以無菌操作從培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基的疑似菌落中挑取菌種穿刺接種，置于37℃下培養(yǎng)2～3d，觀察有無培養(yǎng)基變色現(xiàn)象。

（2）平板菌落計數(shù)法。大部分保加利亞乳桿菌在普通肉汁培養(yǎng)基上形成小點狀菌落，特別是當(dāng)樣品中乳桿菌的數(shù)量遠遠高于鏈球菌的情況下，這些小粗糙菌落通常是羊毛狀或模糊不清的，它們很容易用肉眼使其同光滑凸起的嗜熱鏈球菌大菌落區(qū)別開來[4]。操作時，對三劍客酸奶10-4梯度、三劍客老酸奶10-4梯度的稀釋菌液取樣，盡快向上述盛有不同稀釋液的平皿中對號倒入融化后冷卻至45℃的MRS培養(yǎng)基和普通肉汁培養(yǎng)基約15mL/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后，將MRS培養(yǎng)基厭氧條件下37℃培養(yǎng)48h和普通肉汁培養(yǎng)基需氧條件下37℃培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)基，算出同一菌液3個平板上的乳酸菌總菌數(shù)并計算桿球比。

1.4 酸奶中乳酸菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定[5]：對分離到的球菌和乳桿菌分別進行糖發(fā)酵試驗；

生理生化試驗：依據(jù)伯杰氏細菌鑒定手冊（第8版）中的方法對幾種乳桿菌和乳酸鏈球菌進行溫度、pH值、發(fā)酵糖特性等方面的檢測，鑒定出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

三劍客酸奶1×10-4梯度在MRS和普通肉汁培養(yǎng)基上的菌落見圖1，普通肉汁培養(yǎng)基三劍客老酸奶10-4梯度下的菌落見圖2。

圖1 三劍客酸奶1×10-4梯度在MRS和普通肉汁培養(yǎng)基上的菌落

圖2 普通肉汁培養(yǎng)基三劍客老酸奶1×10-4梯度下的菌落

經(jīng)觀察，MRS培養(yǎng)基4個平板上1×10-4稀釋度為最佳（見圖1左），普通肉汁培養(yǎng)基4個平板上1×10-4稀釋度為最佳（一般在培養(yǎng)基上長出30～300個菌落的稀釋度為最佳，見圖1右）。利用MRS培養(yǎng)基分離的菌株，菌落較大、透明、灰白色、兩面凸起、呈不規(guī)則的形態(tài)，菌落的直徑為1～3mm，細胞兩端鈍圓，呈細桿狀，即為乳桿菌。用普通肉汁培養(yǎng)基分離出的菌種，兩面凸起且呈不規(guī)則的圓形或橢圓形，菌落的直徑為1～2mm，球形或卵圓形，即為乳球菌。

2.2 單菌落革蘭氏染色

雙筒生物顯微鏡下的乳桿菌見圖3，雙筒生物顯微鏡下的乳球菌見圖4。

圖3 雙筒生物顯微鏡下的乳桿菌

圖4 雙筒生物顯微鏡下的乳球菌

經(jīng)觀察，從MRS培養(yǎng)基挑取出的單菌落進行染色，鏡檢為革蘭氏陽性菌，呈桿狀；從普通肉汁培養(yǎng)基上挑取出的單菌落進行染色，鏡檢為革蘭氏陽性菌，呈球狀。

2.3 酸奶中乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定結(jié)果乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定結(jié)果

對分離到的乳球菌進行糖發(fā)酵試驗，結(jié)果表明葡萄糖、白砂糖發(fā)酵試管中培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，并且45℃也能生長的即為嗜熱鏈球菌。

對分離到的乳桿菌進行糖發(fā)酵試驗，結(jié)果表明乳糖發(fā)酵試管中培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，其余2種糖發(fā)酵培養(yǎng)基均未變色的菌落為保加利亞乳桿菌。

2.4 不同酸奶中乳酸菌總數(shù)比較

三劍客酸奶和三劍客老酸奶的1×10-4稀釋液在

2種培養(yǎng)基下的乳酸菌總數(shù)見表2。

表2 三劍客酸奶和三劍客老酸奶的10-4稀釋液在2種培養(yǎng)基下的乳酸菌總數(shù)

酸奶國家標(biāo)準(zhǔn)（GB2746—1999）中乳酸菌數(shù)不得低于1×10-6CFU/mL。試驗研究的鶴壁市市售的三劍客酸奶和老酸奶適宜稀釋度菌液經(jīng)培養(yǎng)后，培養(yǎng)基內(nèi)可見菌落數(shù)達到了國家標(biāo)準(zhǔn)，且桿球比結(jié)果1∶1也達到了國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)語

此次試驗對鶴壁市2種酸奶的乳酸菌總數(shù)和桿球比作了分析，從乳酸菌的含量看，2種酸奶均達到國家標(biāo)準(zhǔn)要求，為人們消費和企業(yè)生產(chǎn)提供合理化建議。

[1]凌代文，東秀珠．乳酸細菌分類鑒定及試驗方法[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：53-60.

[2]霍貴成．乳酸菌的研究與應(yīng)用[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，2007：27.

[3]鄔敏辰．食品工業(yè)生物技術(shù)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：73.

[4]朱明，姚茂軍．食品工業(yè)分離技術(shù)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：68-92.

[5]伍時華，黃翠姬，石緩靖，等．酸乳菌種分離純化方法[J]．食品科學(xué)，2004，25（10）：162-166.◇

TheSeparationandIdentificationofLacticAcidBacteria fromtheYogurtSoldinHebiCity

MENGXiaohua
（HebiPolytechnic，Hebi，He'nan458030，China）

MRSculturemediumandordinarymeatmediumplatecoatingmethodareusedtoseparatelacticacidbacteriafrom differentsunjockdairyinHebicity，whilegramstainingusedinpreliminaryidentification.Sugarfermentationexperimentand physiologicalandbiochemicalidentificationareusedinspeciesidentification，throughplatecountmethodtocalculatecolony countindifferentyoghurtandtheleverthantheball.Theresultsshowthatthenumberoflacticacidbacteriainsunjockold yogurtishigherthansunjockyogurt.

yogurt；lacticacidbacteria；gramstaining；sugarfermentationtube

R155.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.039

1671-9646（2017）04b-0040-03

2017-03-29

孟曉華（1987—），女，碩士，助教，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)。