王寧寧徐李薇高 暉何融封尚云濤范寶莉王振英*

（1天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

秋水仙素對(duì)大蒜愈傷組織四倍體的誘導(dǎo)效應(yīng)及試管鱗莖快繁體系構(gòu)建

王寧寧1徐李薇1高 暉1何融封1尚云濤2范寶莉1王振英1*

（1天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

以大蒜品種六瓣紅鱗莖片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，用秋水仙素作為誘變劑對(duì)大蒜愈傷組織進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，并比較了不同秋水仙素濃度及處理時(shí)間對(duì)大蒜愈傷組織多倍體誘導(dǎo)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，大蒜愈傷組織四倍體誘導(dǎo)率隨秋水仙素處理濃度遞增而升高，隨處理時(shí)間遞增呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；染色體畸變率隨秋水仙素濃度升高及處理時(shí)間延長而升高。當(dāng)秋水仙素濃度為0.200%，處理時(shí)間為18 h時(shí)，四倍體誘導(dǎo)率最高，為36.36%，可以作為最適誘導(dǎo)體系。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后的愈傷組織成功再生出試管苗并獲得試管鱗莖。

多倍體育種；大蒜；秋水仙素；愈傷組織；試管鱗莖大蒜（Allium sativumL.）是百合科蔥屬一年生草本植物，在我國種植歷史悠久，栽培廣泛，在蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中占有非常重要的地位。大蒜為二倍體植株，其染色體數(shù)為 2n=16，主要以肥大的肉質(zhì)鱗莖和鮮嫩的花莖器官為產(chǎn)品。大蒜品種資源較為豐富，但由于花器官退化花粉敗育，長期利用鱗莖進(jìn)行無性繁殖而無法雜交育種，大蒜的遺傳學(xué)和生物學(xué)多樣性不能得到充分利用，同時(shí)一些優(yōu)良種質(zhì)也因種性退化而瀕臨滅絕，因此大蒜的種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種培育勢(shì)在必行（Kondo et al.，2000；徐培文 等，2006；楊茹 等，2010；孫奇，2012；張雨 等，2012；Cheng et al.，2012；Dixit & Chaudhary，2014）。自1937年開創(chuàng)倍性育種先河以來，全球掀起了多倍體育種熱潮。多倍體育種是近代作物育種常用方法之一，對(duì)改良無性繁殖作物的營養(yǎng)器官具有明顯的優(yōu)越性。多倍體植株最明顯的特征是相對(duì)的“巨大化”、植株生物量及次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等（Dhawan & Lavania，1996；Gao et al.，1996；周玉麗 等，2011）。因此，多倍體育種可以提高作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆性，是作物品種改良的重要途徑（于文艷 等，2008；董飛 等，2011）。常規(guī)多倍體誘導(dǎo)技術(shù)由于誘變發(fā)生在單個(gè)細(xì)胞中，利用整體植株或器官為材料時(shí)常產(chǎn)生嵌合體現(xiàn)象，誘變率低，受環(huán)境干擾大，畸變率高，可能發(fā)生回復(fù)突變等（余建明 等，1991）。而以植物愈傷組織作為誘變材料，在離體條件下染色體加倍具有顯著的優(yōu)越性：試驗(yàn)條件容易控制，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)，工作效率高，嵌合體發(fā)生率低，因此，離體組織的染色體加倍日益受到重視（周香君，2008；薛小艷 等，2014）。

作為潛在的多倍體育種優(yōu)勢(shì)材料，大蒜多倍體育種研究也受到關(guān)注，但進(jìn)展緩慢。目前大蒜的多倍體育種研究，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了采用大蒜莖尖、根尖、花苞（孔祥禎，1990；張素芝和李紀(jì)蓉，2006；周香君和程智慧，2008；武延生，2012；薛小艷 等，2014）等為材料經(jīng)秋水仙素處理后獲得染色體加倍的效果，部分研究獲得了染色體加倍的再生植株，但利用大蒜愈傷組織進(jìn)行多倍體細(xì)胞誘導(dǎo)的研究鮮有報(bào)道。愈傷組織繁殖系數(shù)高，以愈傷組織為誘變材料，處理離體培養(yǎng)的細(xì)胞，為大蒜多倍體育種提供了新的途徑?；瘜W(xué)誘變是多倍體技術(shù)誘導(dǎo)普遍采用的方法之一，目前已報(bào)道的多倍體誘導(dǎo)劑多屬于有絲分裂中期抑制劑，其中秋水仙素是誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體加倍最普遍的藥劑（張數(shù)鑫 等，2005；賈美麗 等，2011；孔素萍 等，2014）。已報(bào)道的研究中，直接將大蒜再生植株試管苗種植于田間，由于其根系不能發(fā)揮功能，需要重新發(fā)生新的根系，在生長過程中幼苗纖細(xì)脆弱，恢復(fù)生長慢，移栽成活率很低，需較多的人力物力，成本高，同時(shí)，試管苗生產(chǎn)與大田栽培對(duì)季節(jié)依賴性不同，造成微繁工作忙閑不勻，影響設(shè)備的周年利用率，這些問題致使大蒜品種改良技術(shù)仍受到限制，難以推廣。而將試管苗先形成試管鱗莖后再直接種植于大田，雖然增加了離體培養(yǎng)的工作量，但試管鱗莖本身具有較強(qiáng)的抗逆能力，無需馴化，易于管理，能明顯提高試管苗的移栽成活率（劉高瓊 等，1996；劉偉偉 等，2013）。

本試驗(yàn)以寶坻大蒜品種六瓣紅的鱗莖為材料，以橫切得到的鱗莖片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，用不同濃度的秋水仙素浸泡處理愈傷組織不同時(shí)間后，恢復(fù)培養(yǎng)后再生試管苗繼而誘導(dǎo)試管鱗莖，以期得到四倍體大蒜試管鱗莖。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試大蒜品種為種植于天津師范大學(xué)生物科技園的寶坻大蒜品種六瓣紅，通常大蒜的形態(tài)規(guī)則呈六瓣，表皮紫紅色，故稱為六瓣紅。于2014年10底種植于天津師范大學(xué)生物科技園中，翌年5月收獲，放置于陰涼處備用。誘導(dǎo)愈傷組織的試劑為秋水仙素（Genview，美國）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 以大蒜鱗莖片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織及繼代培養(yǎng) 選取新鮮飽滿、沒有病斑的大蒜鱗莖，剝?nèi)ネ馄ず笥米詠硭疀_洗30 min以上，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺(tái)中用0.10%的 HgCl2浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2～3次，再用75%的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3～5次。將大蒜鱗莖切成0.2～0.5 cm厚的片狀，太薄或太厚均不利于愈傷組織的形成。然后將鱗莖片接到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS + 1.5 mg·L-12，4-D + 0.5 mg·L-1KT + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH=5.8，置于人工氣候箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 （25±2）℃。

當(dāng)誘導(dǎo)出淡黃色顆粒狀的愈傷組織并且愈傷組織足夠多時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，約28 d后進(jìn)行第2次繼代。

1.2.2 秋水仙素誘導(dǎo)愈傷組織加倍體系構(gòu)建 愈傷組織繼代2次后，取生長旺盛的愈傷組織，將其分散成約0.1 cm3大小的顆粒狀，試驗(yàn)組用0.025%、0.050%、0.100%、0.200% 4種不同濃度（m∶V，溶劑為蒸餾水）的秋水仙素在培養(yǎng)瓶中分別浸泡處理愈傷組織4、8、12、18、24 h（顆粒狀愈傷組織剛好平鋪于培養(yǎng)瓶底部，秋水仙素溶液能沒過愈傷組織即可），共20個(gè)處理，于室溫暗處靜置處理；空白對(duì)照組（CK）不經(jīng)過任何濃度秋水仙素處理，試驗(yàn)組每個(gè)處理及空白對(duì)照組均做3次平行試驗(yàn)。處理結(jié)束后（時(shí)間選在細(xì)胞分裂最為旺盛的 10：00～11：00），分別用蒸餾水沖洗愈傷組織3～4次，在濾紙上吸干。用卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3V∶1V）過夜固定，固定時(shí)間不超過24 h。再用蒸餾水沖洗愈傷組織3～4次，于濾紙上吸干。分別將經(jīng)過不同處理的愈傷組織材料置于保存液（70%乙醇）中保存，待進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組及對(duì)照組愈傷組織的分裂指數(shù)、四倍體率及畸變率。

取保存液中的愈傷組織，蒸餾水沖洗3～4次，于濾紙上吸干，用1 M HCl 在60 ℃水浴中酸解8 min，蒸餾水沖洗3～4次后濾紙吸干，卡寶品紅染色10 min后壓片，顯微鏡下（10×20倍及10×40倍）觀察染色體形態(tài)。分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組及試驗(yàn)組愈傷組織細(xì)胞的分裂指數(shù)、四倍體率及畸變率。3次重復(fù)，每次重復(fù)中，不同處理下的愈傷組織細(xì)胞分別觀察并統(tǒng)計(jì)了1 000個(gè)以上（每個(gè)視野約100個(gè)細(xì)胞，一次重復(fù)為10個(gè)視野）。四倍體率相對(duì)較高并且畸變率相對(duì)較低的處理為最適誘導(dǎo)體系。

分裂指數(shù)=視野中分裂期細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)×100%

四倍體率=視野中四倍體細(xì)胞數(shù)/視野中分裂期細(xì)胞數(shù)×100%

畸變率=視野中染色體畸變的細(xì)胞數(shù)/視野中分裂期細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.3 秋水仙素處理愈傷組織及再分化不定芽 用最適誘導(dǎo)體系的秋水仙素浸泡處理愈傷組織，無菌蒸餾水沖洗干凈后接入繼代培養(yǎng)基（MS + 1.5 mg·L-12，4-D + 0.5 mg·L-1KT + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g· L-1瓊脂，pH=5.8）進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，置于人工氣候箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25 ± 2）℃。

恢復(fù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，將秋水仙素處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至再分化培養(yǎng)基（MS + 3 mg·L-16-BA + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH=5.8）誘導(dǎo)不定芽，對(duì)照組的愈傷組織繼代2次后直接再分化不定芽。置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25 ± 2）℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為6：00～ 22：00，共16 h·d-1。

1.2.4 試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲 將長至5 cm左右的試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為MS + 120 g·L-1綿白糖 + 6.8 g·L-1瓊脂，pH=7.5，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25 ± 2）℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為6：00～22：00，共16 h·d-1，觀察并記錄試管鱗莖的生長狀況。

試管鱗莖成熟后，從培養(yǎng)瓶中將其取出，并將表層培養(yǎng)基清洗干凈后陰干，4 ℃低溫貯存21 d左右田間種植。

2 結(jié)果與分析

2.1以大蒜鱗莖片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織及繼代培養(yǎng)

將大蒜鱗莖片作為外植體接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中（圖1-a），14 d左右可觀察到外植體表面增厚膨大并變得蓬松，隨后可觀察到鱗莖片表面持續(xù)膨大形成透明的突起狀結(jié)構(gòu)（圖1-b），約42 d后開始出現(xiàn)顆粒狀的愈傷組織（圖1-c），56 d左右可觀察到大量愈傷組織生成（圖1-d）。為保證組織活力，防止有毒代謝物積累及培養(yǎng)基枯竭，精選健康的愈傷組織作為新的外植體繼代2次，將顆粒狀愈傷組織切下轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代28 d后，愈傷組織增殖明顯（圖1-e），進(jìn)行第2次繼代培養(yǎng)，繼代后的愈傷組織生長良好（圖1-f）。

2.2秋水仙素誘導(dǎo)愈傷組織加倍體系構(gòu)建

圖1大蒜愈傷組織誘導(dǎo)與繼代

對(duì)照組二倍體大蒜愈傷組織壓片鏡檢可以清晰觀察到16條染色體，染色體分裂期形態(tài)如圖2-a～e所示。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后，大蒜愈傷組織染色體出現(xiàn)加倍現(xiàn)象，可以觀察到四倍體染色體，染色體分裂期形態(tài)如圖2-f～l所示。誘導(dǎo)后大蒜愈傷組織有絲分裂中期細(xì)胞染色體清晰，染色體的著絲點(diǎn)排列在赤道板上（圖2-g～j），有絲分裂后期及末期加倍后的染色體分別進(jìn)入細(xì)胞兩極（圖2-k、l）。

當(dāng)秋水仙素濃度高于0.100%、誘導(dǎo)時(shí)間12 h以上，大蒜愈傷組織染色體畸變現(xiàn)象明顯增多，出現(xiàn)多于四倍體現(xiàn)象（圖3-a～d），并能觀察到部分二倍體愈傷組織染色體分裂異常，出現(xiàn)染色體單橋（圖3-e）、多橋（圖3-f）、染色體多橋及染色體不均等分裂（圖3-g）、微核（圖3-h）、染色體滯后 （圖3-i）及染色體多極化（圖3-j、k），部分加倍得到的四倍體細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)染色體畸變現(xiàn)象，如染色體散亂（圖3-l）等。

圖2二倍體與四倍體大蒜愈傷組織分裂期染色體形態(tài)（10×40倍）

圖3大蒜愈傷組織染色體畸變類型（10×40倍）

表1不同秋水仙素處理對(duì)大蒜愈傷組織的分裂指數(shù)、四倍體率及畸變率的影響

從表1可以看出，秋水仙素處理18 h的中期分裂指數(shù)較高，繼續(xù)延長處理時(shí)間反而不利于細(xì)胞分裂。相同秋水仙素濃度下隨處理時(shí)間的延長，四倍體率呈先上升后下降的趨勢(shì)。相同處理時(shí)間下秋水仙素濃度越高，四倍體率越高。當(dāng)秋水仙素濃度為0.200%，處理時(shí)間為18 h時(shí)，四倍體率最高，達(dá)36.36%，且與其他處理差異達(dá)極顯著水平。過高的秋水仙素濃度及處理時(shí)間不能持續(xù)提高細(xì)胞四倍體率，反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞畸變率上升。

圖4是以二倍體大蒜六瓣紅為對(duì)照，用優(yōu)化后的體系處理愈傷組織的染色體倍性對(duì)比，結(jié)果表明，二倍體大蒜染色體數(shù)為2n=2X=16（圖4-a），四倍體大蒜染色體數(shù)為2n=4X=32（圖4-b）。

圖4二倍體與四倍體大蒜愈傷組織染色體形態(tài)（10×20倍）

2.3秋水仙素處理愈傷組織及再分化不定芽

利用秋水仙素浸泡處理愈傷組織（圖5-a），置于繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)（圖5-b）。7 d后，愈傷組織表面出現(xiàn)新生的組織（圖5-c）；28 d后，愈傷組織生長旺盛（圖5-d），可用于再生分化。部分愈傷組織在恢復(fù)培養(yǎng)中出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖5-e、f），可能是由于秋水仙素毒性造成細(xì)胞生理活性降低甚至死亡。

圖5秋水仙素誘導(dǎo)大蒜愈傷組織加倍及恢復(fù)培養(yǎng)

將恢復(fù)培養(yǎng)后生長旺盛的愈傷組織置于再分化培養(yǎng)基上（圖6-a），7 d左右愈傷組織沒有明顯再分化現(xiàn)象（圖6-b），14 d左右可以觀察到愈傷組織表面開始出現(xiàn)綠點(diǎn)（圖6-c），綠點(diǎn)不斷生長，逐漸形成不定芽（圖6-d），28 d左右不定芽長至約2 cm（圖6-e），42 d后不定芽生長旺盛，約5 cm，可用于誘導(dǎo)試管鱗莖（圖6-f）。

2.4試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲

將生長至5 cm左右的試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基（圖7-a），移植7 d左右試管苗基部開始膨大，逐漸形成試管鱗莖（圖7-b），試管鱗莖不斷膨大（圖7-c、d），28 d左右試管鱗莖表皮開始呈現(xiàn)紫色，趨于成熟（圖7-e），42 d后試管苗枯 萎，試管鱗莖完全成熟（圖7-f），可以收獲。

圖6秋水仙素處理后大蒜愈傷組織再分化及再生試管苗

將收獲的試管鱗莖（圖8-a）進(jìn)行解剖觀察，可清晰觀察到生長點(diǎn)（圖8-b），表明收獲的試管鱗莖可于田間再生出植株，這為后期再生植株田間性狀觀察及細(xì)胞學(xué)倍性鑒定奠定了基礎(chǔ)。

圖8大蒜試管鱗莖形態(tài)及生長點(diǎn)

3 討論

秋水仙素是常見的多倍體化學(xué)誘導(dǎo)劑之一。不同材料對(duì)秋水仙素的耐受性存在差異，因此加倍處理時(shí)所用秋水仙素的最適濃度和最佳處理時(shí)間也不相同。目前已有應(yīng)用于大蒜多倍體育種的報(bào)道，謝曉玲和鄧自發(fā)（2009）用秋水仙素處理嘉定白蒜生長點(diǎn)，結(jié)果表明秋水仙素濃度為0.05%，處理時(shí)間為6 d時(shí)染色體加倍率最高，達(dá)28.67%；孔素萍等（2014）研究了秋水仙素對(duì)山東蒼山蒲棵、四川正月早和新疆紫皮3個(gè)不同品種大蒜莖尖試管苗成苗率的影響及染色體加倍率效應(yīng)，結(jié)果顯示3個(gè)品種的大蒜最適誘導(dǎo)條件均不同，其中正月早的成苗率和加倍率最高，分別為48.69%和9.15%，最適秋水仙素濃度為0.268%～0.694%，處理時(shí)間為61.1～113.8 h。武延生（2012）以不同濃度秋水仙素處理邢臺(tái)當(dāng)?shù)刈掀に飧?，結(jié)果表明秋水仙素濃度為0.50 g·L-1，處理時(shí)間為24～48 h的大蒜根尖膨大率高于82%，并且觀察到細(xì)胞核顯著增大。薛小艷等（2014）用秋水仙素注射蒼山糙蒜和金蒜3號(hào)花苞，發(fā)現(xiàn)隨秋水仙素濃度升高，氣生鱗莖數(shù)不斷降低，染色體加倍率升高，兩個(gè)品種大蒜的最適秋水仙素處理濃度及四倍體誘導(dǎo)率分別為0.20%、7.69%和0.15%、11.76%。前人研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)過程中常常導(dǎo)致細(xì)胞染色體組自然發(fā)生內(nèi)源多倍化（李士生和張玉玲，1991），愈傷組織本身的這種染色體不穩(wěn)定性可能有利于加倍誘導(dǎo)多倍體細(xì)胞的發(fā)生，且愈傷組織再生能力強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，秋水仙素濃度及處理時(shí)間是大蒜愈傷組織多倍體誘導(dǎo)的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)中，大蒜愈傷組織四倍體率隨秋水仙素濃度遞增呈逐漸上升趨勢(shì)，隨處理時(shí)間延長呈先上升后下降趨勢(shì)。染色體畸變率隨秋水仙素濃度遞增及處理時(shí)間延長而升高。過高的處理濃度及過長的處理時(shí)間不一定能增加大蒜愈傷組織四倍體率，反而增加對(duì)細(xì)胞的毒害作用，這與張素芝和李紀(jì)蓉（2006）關(guān)于大蒜四倍體的研究結(jié)果相一致。秋水仙素已被證實(shí)具有誘導(dǎo)染色體畸變效應(yīng)，這可能是由于秋水仙素與微管蛋白二聚體結(jié)合，導(dǎo)致紡錘體微管不能聚合，影響有絲分裂而造成的（翟中和，1995）。李卓等（2009）研究了秋水仙素對(duì)黑麥根尖細(xì)胞染色體的誘導(dǎo)畸變效應(yīng)，結(jié)果表明，隨處理時(shí)間的延長和秋水仙素濃度的升高，染色體畸變率呈先上升后下降趨勢(shì)，最高為8.10%。

秋水仙素具有毒性，譚德冠等（2005）認(rèn)為，在暗條件下或弱光條件下可減輕秋水仙素對(duì)植物的傷害，因此本試驗(yàn)浸泡處理愈傷組織在暗處進(jìn)行。結(jié)果顯示，秋水仙素處理后大蒜愈傷組織細(xì)胞染色體在加倍的同時(shí)也存在畸變現(xiàn)象，這可能是高濃度秋水仙素及長時(shí)間處理干擾了細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，染色體不能被紡錘絲正常拉向兩極，在有絲分裂中后期染色體分布不規(guī)則，形成如染色體單橋、染色體多橋、染色體滯后、染色體多極化、染色體散亂及微核等畸變現(xiàn)象。其中微核的出現(xiàn)表明有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片不能進(jìn)入主核，是真核細(xì)胞遺傳毒性的直觀體現(xiàn)，表示秋水仙素對(duì)細(xì)胞毒害作用加劇?？梢姶_定適宜的處理濃度及時(shí)間對(duì)提高細(xì)胞加倍效率、降低畸變率、減輕誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的毒害以及節(jié)約藥劑等方面都是十分必 要的。

目前由組織培養(yǎng)獲得大蒜脫毒快繁種苗已成為大蒜組培快繁的常見技術(shù)手段，但試管苗的煉苗、移栽及馴化對(duì)環(huán)境條件要求極高，移栽成活率低，不宜在大田試驗(yàn)推廣。通過組培途徑誘導(dǎo)發(fā)育的試管鱗莖對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、耐貯藏、易成活，是理想的大蒜快繁育種技術(shù)（劉高瓊 等，1996）。本試驗(yàn)將愈傷組織的高誘導(dǎo)率與試管鱗莖的高成活率相結(jié)合，對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)愈傷組織加倍做了初步研究，觀察到了四倍體細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)出試管苗及試管鱗莖，且可明顯觀察到試管鱗莖的生長點(diǎn)，這為大蒜多倍體育種提出了新的研究思路。再生植株的田間性狀觀察及細(xì)胞學(xué)染色體鑒定，有待進(jìn)一步 研究。

4 結(jié)論

4種 不 同 濃 度（m∶V=0.025%、0.050%、0.100%、0.200%）的秋水仙素分別浸泡處理大蒜愈傷組織4、8、12、18、24 h后，四倍體率隨秋水仙素處理濃度遞增而升高，隨處理時(shí)間遞增呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；染色體畸變率隨秋水仙素濃度遞增及處理時(shí)間延長而升高。最優(yōu)處理為0.200%的秋水仙素處理愈傷組織18 h。采用最優(yōu)處理來浸泡愈傷組織，恢復(fù)培養(yǎng)后可再生出試管苗并獲得試管鱗莖。

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Tetraploid Inductive Effect of Colchicine in Garlic Callus and Construction of Rapid Propagation System of Bulblets in vitro

WANG Ning-ning1，XU Li-wei1，GAO Hui1，HE Rong-feng1，SHANG Yun-tao2，F(xiàn)AN Bao-li1，WANG Zhen-ying1*

（1CollegeofLifeScience，TianjinNormalUniversity，TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantResistance，Tianjin300387，China；2TianjinCityKeyLaboratoryofWaterResourcesandEnvironment，Tianjin300387，China）

Taking garlic cultivar ‘Liubanhong’ bulb pies as explants to induce callus，and colchicine as mutagenic agent，this paper conducted polyploid induction on the callus and compared the effect of different colchicine concentrations and treating time on garlic callus. The results showed that the tetraploid inducing rate was increased along with the increasing of colchicine concentration，while showing a tendency of first increasing then decreasing along with the increase of colchicine treatment time. The chromosomal aberration rate was increased along with the increasing of colchicine concentration and treatment time. When the concentration of colchicine was 0.200%，the treating time was 18 h，the highest tetraploid inductivity was 36.36%，which could be used as the optimum induction system. The callus treated by colchicine could successfully regenerate test-tube plantlet and then bulblet in vitro was gained.

Polyploidy breeding；Garlic；Colchicine；Callus；Bulblet in vitro

王寧寧，女，碩士研究生，專業(yè)方向：細(xì)胞生物學(xué)，E-mail：lbxq0801@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：王振英，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方 向：植物抗性分子生物學(xué)，E-mail：wzycell@163.com

2017-01-03；接受日期：2017-03-02

天津市農(nóng)委科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201302030），天津師范大學(xué)應(yīng)用開發(fā)基金項(xiàng)目（52XK1505，52XK1210），天津市科委面上項(xiàng)目（14JCYBJC29900）