代惠潔劉 錦劉永杰喬 寧馬井玉張安盛

（1濰坊科技學院，山東壽光 262700；2山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271018；3濟寧市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東濟寧 272100；4山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山東濟南 250100）

山東地區(qū)棕櫚薊馬對甜瓜黃斑病毒的傳播

代惠潔1，2劉 錦2劉永杰2喬 寧2馬井玉3張安盛4*

（1濰坊科技學院，山東壽光 262700；2山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271018；3濟寧市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東濟寧 272100；4山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山東濟南 250100）

在山東濟南董家鎮(zhèn)溫室內發(fā)現(xiàn)疑似感染甜瓜黃斑病毒（Melon yellow spot virus，MYSV）的黃瓜植株，通過RT-PCR檢測，獲得大約500 bp的特異性片段。經(jīng)測序確認，該病毒為MYSV；對發(fā)病植株溫室內采集的棕櫚薊馬進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)33.3%的棕櫚薊馬體內攜帶MYSV。室內試驗中，MYSV感病株率隨著帶毒棕櫚薊馬數(shù)量和取食時間增加而明顯升高，表明棕櫚薊馬能有效傳播MYSV，其種群數(shù)量和取食時間對MYSV的傳播具有顯著的影響，生產(chǎn)中可通過防控棕櫚薊馬預防MYSV的傳播。

甜瓜黃斑病毒；棕櫚薊馬；傳毒

甜 瓜 黃 斑 病 毒（Melon yellow spot virus，MYSV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），主要危害甜瓜、西瓜、黃瓜和苦瓜（Kato et al.，2000；Takeuchi et al.，2001；Chen et al.，2008）。MYSV侵染植株后葉片出現(xiàn)明脈、褪綠斑點，嚴重時形成大的壞死斑，導致葉片發(fā)黃、干枯，影響果實的品質和產(chǎn)量。甜瓜黃斑病毒2000年首次在日本被發(fā)現(xiàn)（Kato et al.，2000），隨后泰國也報道了該病毒的發(fā)生（Bhunchoth et al.，2005）。我國最早在臺灣報道（Chen et al.，2008），而后在海南、山東等地也有報道（Gu et al.，2011；喬寧 等，2015）。MYSV主要是通過棕櫚薊馬（Thrip palmiKarny）以持久性增殖方式傳播，也可通過汁液摩擦接種傳播（古勤生 等，2012）。

棕櫚薊馬又叫節(jié)瓜薊馬、棕黃薊馬、瓜薊馬，是近年來我國尤其是北方地區(qū)新發(fā)生的一種災難性害蟲。該蟲體型微小，隱蔽性強，在保護地可以常年繁殖，寄主范圍廣；喜食茄科、葫蘆科等多種蔬菜，受害后植株葉片出現(xiàn)銀灰色斑點，發(fā)育緩慢，果實畸形、脫落。棕櫚薊馬除了直接取食為害植株外，還能以持久性方式高效傳播植物病毒，如番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）（Yeh et al.，1992；楊英華 等，2011）、甜瓜黃斑病毒（MYSV）（Kato et al.，2000）等多種病毒病，嚴重影響蔬菜的產(chǎn)量和質量，給設施蔬菜安全生產(chǎn)帶來極大威脅。本試驗對田間采集的疑似感染MYSV的黃瓜植株進行分子鑒定，并對棕櫚薊馬體內MYSV進行了檢測；室內測定了帶毒棕櫚薊馬種群數(shù)量和取食時間對MYSV感病株率的影響，以期明確棕櫚薊馬傳播MYSV的發(fā)生規(guī)律，為甜瓜黃斑病毒的預測預報和綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集

1.1.1 疑似感染病毒樣品的采集 2015年5月從濟南市董家鎮(zhèn)張爾村溫室黃瓜棚采集疑似感染MYSV的黃瓜葉片30份，放于-80℃冰箱內備用。健康對照為置于山東省農(nóng)業(yè)科學院溫室內嚴格防蟲的健康黃瓜苗，經(jīng)檢測未感染MYSV。

1.1.2 棕櫚薊馬樣本的采集 采用5點取樣法在感病黃瓜植株上采集300頭棕櫚薊馬成蟲，采集的樣品置于95%的乙醇中，-80 ℃冰箱保存。

1.2試驗方法

1.2.1 引物合成 利用根據(jù)甜瓜黃斑病毒的sRNA上N基因保守序列設計的特異性引物MYSV-F/ MYSV-R（楊英華 等，2011）來檢測樣品。引物由上海生工生物技術有限公司合成，其引物序列如下，MYSV-F：5′- GACAACAGGGCAGAGCGAAT G-3′，MYSV-R：5′- TACCGTTACTAAGCTGACAA AGGAGAA-3′。

1.2.2 黃瓜葉片RNA的提取及RT-PCR檢測 取黃瓜植株葉片0.1 g，放入液氮預冷的研缽中，加液氮研磨成粉末，利用TRIzol法提取植物葉片總RNA，用于cDNA合成。

反轉錄體系：Random6 2 μL、dNTP 1 μL、模板RNA 10 μL、RNase-freeH2O 1.5 μL混勻，70 ℃變性5 min，冰上放置2 min，再加入5×PrimeScript Buffer 4 μL、RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL、PrimeScriptRTase（200 U·μL-1）1 μL，混勻，總體積為20 μL。30 ℃預熱10 min，42 ℃保溫50 min，95 ℃保溫5 min。

病毒檢測采用MYSV通用引物MYSV-F/ MYSV-R擴增，擴增體系如下：PCR MasterMix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 7 μL、模板1 μL，總體積為20 μL。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR擴增產(chǎn)物委托華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 棕櫚薊馬RNA的提取及RT-PCR檢測 取單頭棕櫚薊馬置于1.5 mL無RNA酶的離心管中，加入10 μL TRIzol研磨，再加入240 μL TRIzol，混勻。室內放置5 min，加入50 μL氯仿混合物（氯仿∶異戊醇=24∶1），振蕩器混勻3 min，將樣品在4 ℃冷凍離心機離心10 min（12 000 r·min-1）。將上清液移至另一離心管中，加入同等量冷的異丙醇混勻，放置10 min，在4 ℃冷凍離心機離心10 min（12 000 r·min-1），棄上清，加入250 μL 75%預冷的乙醇洗滌，在4 ℃冷凍離心機離心5 min（12 000 r·min-1），棄乙醇，獲得單頭棕櫚薊馬RNA樣品。干燥處理后加入10 μL無菌水，進行下一步試驗。反轉錄及病毒擴增方法同1.2.2。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物回收、克隆和測序 用DNA回收試劑盒對目的片段進行回收，連接到載體pMD-18T上，轉入大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞中，篩選陽性菌落，進行測序。

1.2.5 帶毒棕櫚薊馬數(shù)量對MYSV發(fā)病的影響 將具有3～4片真葉的健康黃瓜苗置于防蟲網(wǎng)罩內隔離，分別將5、10、15、20頭帶毒棕櫚薊馬接在黃瓜苗上，48 h后移除帶毒棕櫚薊馬。接種30 d后通過RT-PCR檢測黃瓜感病株數(shù)，并計算感病株率。每個處理3次重復，每個重復10株黃瓜植株。所有處理均在（28±1）℃，相對濕度70%±5%，光周期16∶8（L∶D）條件下進行。

1.2.6 帶毒棕櫚薊馬取食時間對MYSV發(fā)病的影響

現(xiàn)如今，先天性心臟病診斷的金標準當屬X線心血管造影（CAG），然而，CAG法是一種有創(chuàng)檢查方法，且存在輻射劑量大、對比劑用量大等不足，對人體存在不同程度上的危害[2]。基于此，臨床醫(yī)師十分關注先天性心臟病診斷方法的研究。多層螺旋電子計算機斷層掃描（CT），掃描速度快，時間及空間分辨率較高，在兒童先天性心臟病診斷中，具有較高的應用價值。近期有研究發(fā)現(xiàn)，CT掃描中對比劑腎病發(fā)病風險系數(shù)高達7%，需重視[3]。本文用到的270mgI/ml碘克沙醇是一種低碘濃度、低黏度、等滲透壓對比劑，不僅可滿足心臟兒童CT掃描要求，而且可降低造影劑腎病發(fā)生機率，值得推廣。

將具有3～4片真葉的健康黃瓜苗置于防蟲網(wǎng)罩內隔離，將5頭帶毒棕櫚薊馬接在黃瓜苗上，分別取 食 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0、24.0、48.0、96.0 h后移除帶毒棕櫚薊馬。接種30 d后通過RTPCR檢測黃瓜感病株數(shù)，并計算感病株率。每個處理3次重復，每個重復10株黃瓜植株。所有處理均在（28±1）℃，相對濕度70%±5%，光周期16∶8（L∶D）條件下進行。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差法進行方差分析，Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1黃瓜樣品的病毒檢測

對田間采集的30份疑似感病的黃瓜樣品進行總RNA提取，利用引物MYSV-F/MYSV-R進行RT-PCR擴增，并經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳檢測，結果表明，部分樣品獲得了大約500 bp的特異性片段（圖1），與MYSV山東壽光分離物的檢測結果一致（喬寧 等，2015），初步證明該溫室內黃瓜植株感染了MYSV。

圖1田間黃瓜樣品病毒檢測結果

用DNA回收試劑盒回收目的片段，克隆到載體pMD-18T上進行測序，結果顯示，該目的片段由505個堿基組成。將測得的基因序列進行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)該分離物與GenBank中MYSV序列相似性達到99%以上，表明檢測樣品攜帶MYSV，檢出率為50%。

通過提取田間采集的棕櫚薊馬RNA，利用特異性引物MYSV-F/MYSV-R進行RT-PCR擴增，經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳檢測，33.3%的棕櫚薊馬體內檢測出500 bp左右的目的片段（圖2）。對目的片段進行回收、克隆和測序，結果顯示該目的片段由505個堿基組成，Blast檢索結果發(fā)現(xiàn)該分離物與GenBank中MYSV序列相似性達到99%以上，表明棕櫚薊馬體內攜帶MYSV。

圖2田間棕櫚薊馬帶毒檢測結果

2.3棕櫚薊馬數(shù)量和取食時間對MYSV感病株率的影響

圖3帶毒棕櫚薊馬取食時間對黃瓜感病株率的影響

在健康黃瓜苗上分別接1、5、10、15、20頭帶毒棕櫚薊馬后，黃瓜植株MYSV感病株率分別為3.3%、16.7%、33.3%、46.7%、56.7%，表明黃瓜植株MYSV發(fā)病率隨著棕櫚薊馬數(shù)量的增加而 升高。

由圖3可以看出，帶毒棕櫚薊馬成蟲在健康黃瓜苗上取食0.5～96.0 h，黃瓜感病株率隨著棕櫚薊馬取食時間的延長呈上升趨勢，各處理間存在明顯差異；取食48.0 h時感病株率達到最高，為53.33%；取食96.0 h時，感病株率有所下降，但和48.0 h時無顯著差異。

3 討論

甜瓜黃斑病毒是近幾年發(fā)現(xiàn)的1種番茄斑萎病毒屬病毒，主要危害甜瓜等葫蘆科作物。繼在中國臺灣（Chen et al.，2008）、海南（Gu et al.，2011）發(fā)生危害以來，現(xiàn)已在我國北方地區(qū)部分蔬菜產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)（喬寧 等，2015）。筆者在濟南董家溫室黃瓜棚內證實了MYSV的發(fā)生，發(fā)病率高達50%，說明該病毒在山東境內有蔓延趨勢，應加強對其監(jiān)控。

甜瓜黃斑病毒主要通過棕櫚薊馬以持久性增殖方式傳播（Gu et al.，2011），筆者在樣品采集的溫室內發(fā)現(xiàn)了棕櫚薊馬的暴發(fā)。通過對棕櫚薊馬MYSV的特異性檢測發(fā)現(xiàn)，33.3%的棕櫚薊馬體內攜帶MYSV，表明棕櫚薊馬是MYSV的攜帶者。室內試驗表明，黃瓜植株MYSV感病株率隨著帶毒棕櫚薊馬取食時間的延長和種群數(shù)量的增加而明顯升高，加強對棕櫚薊馬攜帶MYSV的監(jiān)測將有利于預防、預測該病毒的暴發(fā)，減少其危害。當前生產(chǎn)中對甜瓜黃斑病毒還沒有足夠的認識，但隨著設施蔬菜集約化生產(chǎn)的擴大，棕櫚薊馬呈發(fā)生頻繁、危害加重的趨勢，甜瓜黃斑病毒勢必會暴發(fā)，需要加強監(jiān)控。有關棕櫚薊馬如何獲取和傳播甜瓜黃斑病毒，以及影響有效傳播的因素，將會在今后的試驗中作進一步研究。

古勤生，吳會杰，彭斌，劉麗鋒．2012．瓜類新病毒病害（三）：甜瓜黃化斑點?。袊喜耍?5（1）：32-33．

喬寧，王興翠，田素波，劉永光，姜會霞，李美芹，竺小平．2015． 黃瓜上甜瓜黃斑病毒壽光分離物的初步鑒定及序列分析．中國蔬菜，（7）：25-28．

楊英華，陳青，廖富榮，陳紅運，林石明，王建國．2011．番茄斑萎病毒屬6種病毒的多重RT-PCR檢測．植物檢疫，25（6）：25-29．

Bhunchoth A，Warin N，Chiemsombat P，Seepiban C，Wong yam S．2005．Molecular characterization ofMelon yellow spot virusinfecting cucubits in Thailand．BioThailand 2005 National Conference organized by National Center for Genetic Engineering and Biotechnology．

Chen T C，Lu Y Y，Cheng Y H．2008．Melon yellow spot virusin watermelon a first record from Taiwan．Plant Pathology，57：765．Gu Q S，Wu H J，Zhang X J．2011．Melon yellow spot virusidentified in China for the first time．Plant Pathology，25：7．

Kato K，Hanada K，Kameya-Iwaki M．2000．Melon yellow spot virus：a distinct species of the genusTospovirusisolated from melon．Phytopathology，90：422-426．

Takeuchi S，Okuda M，Hanada K．2001．Spotted wilt disease of cucumber（Cumumis sativus）caused byMelon yellow spot virus．Annals of the Phytopathological Society of Japan，67： 46-51．

Yeh S D，Lin Y C，Cheng Y H，Jih C L，Chen M J．1992．Identification of tomato spotted wilt-like virus on watermelon in Taiwan．Plant Disease，76：835-840．

Melon yellow spot virus（MYSV）Transmitted by Thrip palmi in Shandong

Dai Hui-jie1，2，Liu Jin2，Liu Yong-jie2，Qiao Ning2，Ma Jing-yu3，Zhang An-sheng4*

（1WeifangUniversityofScienceandTechnology，Shouguang262700，Shandong，China；2CollegeofPlantProtection，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，Shandong，China；3JiningAcademyofAgriculturalSciences，Jining272100，Shandong，China;4InstituteofPlantProtection，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，Shandong，China）

Cucumber samples infected possibly byMelon yellow spot virus（MYSV） were found in Jinan，Shandong．A Reverse Transcript-PCR assay was performed with total RNA isolated from diseased samples by specific primers for MYSV，and amplified DNA fragments（500 bp）were obtained．After sequencing，we confirmed that the diseased samples were infected by MYSV．A Reverse Transcript-PCR assay was performed withThrip palmicollecting in the greenhouse，and the results showed that 33.3% ofThrip palmicarried MYSV，meaning thatThrip palmiwas vector of MYSV．MYSV incidence rate increased with viruliferousThrip palmipopulation increasing and feeding time extending．The results indicated that MYSV could be effectively transmitted byThrip palmi，and the prevention and control ofThrip palmiwas an effective measure for controlling MYSV in the fields．

Melon yellow spot virus；Thrip palmiKarny；Viral transmission

代惠潔，女，博士研究生，專業(yè)方向：昆蟲生理生化，E-mail：climsion@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：張安盛，男，研究員，專業(yè)方向：蔬菜病蟲害防治，E-mail：zhangansheng2003@163.com

2016-11-02；接受日期：2017-03-12

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303028），山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目