吳桃芬，李寶臣，方維煥

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司)

試驗(yàn)研究

豬圓環(huán)病毒2a和2b雙亞型Cap蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及對(duì)小鼠的免疫效果試驗(yàn)

吳桃芬1,2，李寶臣2，方維煥1

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司)

試驗(yàn)通過PCR分別獲得PCV2a和PCV2b的Cap基因，順次克隆入pFastBac-Dual載體質(zhì)粒，獲得攜帶2a和2b型Cap基因的重組質(zhì)粒Cap-pFastBacDual，轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選獲得重組桿粒Cap-Bacmid，以脂質(zhì)體法將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得表達(dá)Cap蛋白的重組桿狀病毒。PCR能從重組桿狀病毒中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的Cap基因片段，蛋白電泳和ELISA法鑒定表明，Cap蛋白成功表達(dá)。采用重組桿狀病毒肌內(nèi)注射免疫小鼠(每只相當(dāng)于8 μg Cap蛋白)，免疫后14 d血清中產(chǎn)生PCV2抗體，免疫后28 d用PCV2a和PCV2b強(qiáng)毒株攻擊，熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟中PCV2基因組拷貝數(shù)極顯著低于未免疫對(duì)照組。結(jié)果表明，PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白能開發(fā)成豬圓環(huán)病毒防控的新型疫苗。

PCV;Cap基因；重組質(zhì)粒；免疫效果

豬圓環(huán)病毒(PCV)屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是最小的動(dòng)物病毒之一，可分為PCV1和PCV2，其中PCV2對(duì)豬有致病性。PCV2基因組含有1767-1768個(gè)核苷酸，主要編碼3個(gè)蛋白：ORF1編碼非結(jié)構(gòu)復(fù)制酶蛋白R(shí)ep(314個(gè)AAs)；ORF2編碼核衣殼蛋白Cap，是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白(233-234個(gè)AAs)，是主要免疫原性蛋白，可以自我組裝成病毒樣粒子；ORF3與ORF1基因完全重疊，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(105個(gè)AAs)[1,2]。

PCV2毒株可分為PCV2a、PCV2b和PCV2c。2003年前，PCV2a在臨床感染的豬群中是最為流行的基因型，之后則以PCV2b為主要的基因型，而PCV2c只有2008年左右曾在丹麥豬群中發(fā)現(xiàn)過，未在其他地方流行。PCV2除了感染豬，還可以在小鼠體內(nèi)復(fù)制，因此小鼠可能成為中間宿主和傳播媒介。市面上已有針對(duì)PCV的疫苗，主要是針對(duì)單一基因型的疫苗。近年來，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用廣泛，具有安全、高效等特點(diǎn)，且可同時(shí)插入多個(gè)外源基因。

本試驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)PCV2a和2b雙亞型Cap蛋白的重組桿狀病毒，并探索了其免疫小鼠后對(duì)強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)性。研究結(jié)果為PCV新型亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 商品化重組桿狀病毒載體pFastBac-Dual購(gòu)自Invitrogen公司，菌種E.coliDH10Bac購(gòu)自上海某生物科技有限公司，Sf9細(xì)胞、PCV2a和PCV2b病毒為本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠購(gòu)自浙江省某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶(BamHI、NotI、XhoI和KpnI)、T4 DNA連接酶和rTaq聚合酶均購(gòu)自TAKARA公司；Cellfectin II轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；SF-900II培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)自AXYGEN公司；羊抗鼠酶標(biāo)二抗購(gòu)自Abcam公司；PNPP購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因Cap的克隆 根據(jù)PCV2a和PCV2b的基因序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表1)，擴(kuò)增PCV2a和PCV2b的Cap基因，根據(jù)桿狀病毒載體pFastBac-Dual啟動(dòng)子的酶切位點(diǎn)特征，在上、下游引物加入合適的酶切位點(diǎn)。

從PCV2a和PCV2b全病毒提取核酸，分別用以上引物擴(kuò)增出目的基因片段。PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 1 μL、上下游引物(20 μmol/mL)各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、DNA模板5 μL，補(bǔ)加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并分別回收目的片段，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)所用引物設(shè)計(jì)

1.2.2 重組Cap-pFast質(zhì)粒構(gòu)建 取回收的2a型PCV2目的基因片段和pFastBac-Dual空載體質(zhì)粒，分別用XhoI和KpnI進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切后的目的條帶，并用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR鑒定，采用陽(yáng)性菌液測(cè)序。提取測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒PCV2a-Cap-pFast，于-20℃保存?zhèn)溆?。再取回收?a型PCV2目的基因片段和PCV2a-Cap-pFast質(zhì)粒分別用BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收酶切后的目的條帶，并用T4連接酶將其連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，用P10和PH載體引物進(jìn)行PCR鑒定，采用陽(yáng)性菌液測(cè)序。提取重組質(zhì)粒PCV2a-2b-Cap-pFast，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組Cap-Bacmid質(zhì)粒構(gòu)建 取攜帶PCV2a和PCV2bCap基因的pFast重組質(zhì)粒(PCV2a-2b-Cap-pFast)轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過兩次藍(lán)白斑篩選后，挑取白色單個(gè)菌落培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR鑒定，取陽(yáng)性菌液分別用PCV2a和PCV2b的Cap基因引物及載體通用引物M13進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒(攜帶PCV2a和PCV2b雙亞型Cap基因的Bacmid，Cap-Bacmid)提取后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 表達(dá)Cap蛋白的重組桿狀病毒制備 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，稀釋至密度為0.5×106個(gè)/mL，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 mL/孔，27℃靜置培養(yǎng)30 min。同時(shí)將Cap-Bacmid質(zhì)粒和Cellfectin II轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置20 min后，轉(zhuǎn)染6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的Sf9細(xì)胞，27℃靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至大部分細(xì)胞出現(xiàn)變大、漂浮和破碎等病變時(shí)收集細(xì)胞懸液，經(jīng)3000 rpm 4℃離心10 min，收集上清液分裝保存至-80℃，即為第一代重組病毒。取病毒液分別用PCV2a和PCV2b的Cap基因引物擴(kuò)增鑒定。繼續(xù)傳代獲第二代和第三代重組病毒，保存?zhèn)溆?，短期保?℃，長(zhǎng)期保存-80℃。

采用MTT法檢測(cè)重組桿狀病毒滴度[3]：稀釋Sf9細(xì)胞為1.25×105個(gè)/mL，鋪制96孔細(xì)胞板，0.1 mL/孔；稀釋待檢測(cè)病毒液至10-2、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，每個(gè)稀釋度接種12孔，每孔10 μL；置27℃培養(yǎng)6～7 d，觀察病變情況；加MTT，10 μL/孔，放置室溫?fù)u床上100 rpm反應(yīng)2 h；3200 rpm離心10 min，吸棄上清液；加DMSO，50 μL/孔，室溫?fù)u晃10 min；酶標(biāo)儀492 nm讀數(shù)。使用PFU計(jì)算軟件計(jì)算病毒滴度。

1.2.5 重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，稀釋至密度為1×106個(gè)/mL，加入錐形瓶中27℃、120 rpm培養(yǎng)過夜，待其細(xì)胞密度至2×106個(gè)/mL左右，按照MOI=0.02接種第三代重組病毒，27℃、120 rpm培養(yǎng)，每天取樣觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)有80%以上細(xì)胞病變時(shí)，收取細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次后，3000 rpm、4℃離心10 min取上清，4℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)取空載桿狀病毒按同樣方法感染Sf9細(xì)胞，收集上清。分別取兩種上清20 μL，加入5×上樣緩沖液煮沸10 min，取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

利用捕獲ELISA法檢測(cè)PCV2-Cap蛋白表達(dá)量[4]：用包被液對(duì)兔抗-PCV2 IgG進(jìn)行1∶10000倍稀釋后，包被于微量滴定板中，100 μL/孔，4℃密封培育過夜；用含有1%吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗板3次；用1%BSA封閉液進(jìn)行封閉，37℃密封作用60 min；用含有1%吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗板3次；將預(yù)先稀釋200倍或500倍的待測(cè)抗原樣品和Cap蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(60 μg/mL，本實(shí)驗(yàn)室制備)加入至平板第一列各孔中，依次倍比稀釋，37℃密封作用60 min，用洗液洗滌3次；抗PCV2-Cap蛋白的單抗(購(gòu)自VMRD,Inc.)用稀釋液進(jìn)行1∶500倍稀釋后加入各孔中，100 μL/孔，37℃密封作用60 min，3次洗滌后用含有1%BSA的稀釋液1∶10000稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，每孔100 μL，37℃密封作用60 min，洗滌3次；加入100 μL底物顯色，37℃密封作用30 min；每孔100 μL 3M的NaOH終止反應(yīng)；通過酶標(biāo)儀(OD405)進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)，確定蛋白抗原稀釋終點(diǎn)，以此為基準(zhǔn)，計(jì)算蛋白抗原含量。

1.2.6 重組PCV2a+PCV2b-Cap蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù) 8周齡BALB/c小鼠24只，隨機(jī)分成3組，每組8只。第一組按8 μg/只肌內(nèi)注射0.1 mL重組桿狀病毒，第二組為對(duì)照組攻毒未免疫，第三組為空白對(duì)照組未免疫未攻毒。免疫后第14 d、21 d和28 d采血，檢測(cè)小鼠血清中PCV2抗體水平。免疫后第28 d第一和第二組每只口服加腹腔注射0.1 mL強(qiáng)毒株(103.5TCID50/mL，PCV2a和PCV2b以1∶1比例混合)進(jìn)行攻毒。攻毒后28 d剖殺，采集每只小鼠脾臟，用熒光定量PCR方法檢測(cè)組織樣品中PCV2病毒拷貝數(shù)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 Cap基因的擴(kuò)增 詳見圖1。

M：DNA Marker DL2000；1：PCV2a-Cap；2：PCV2b-Cap 圖1 PCV2 Cap基因的PCR擴(kuò)增

由圖1可見，以本實(shí)驗(yàn)室保存的PCV2a和PCV2b病毒DNA為模板，分別以各自的引物擴(kuò)增Cap基因，大小約720 bp。

2.2 重組Cap-pFast質(zhì)粒的鑒定 挑取單個(gè)菌落若干，分別加于含氨芐青霉素的3 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm培養(yǎng)過夜，菌液用P10和PH載體引物進(jìn)行PCR鑒定正確。用鑒定結(jié)果陽(yáng)性的菌液4#和5#測(cè)序(PCV2a用P10引物測(cè)序，PCV2b用PH引物測(cè)序)，核對(duì)測(cè)序結(jié)果序列完全正確，無堿基突變或缺失。

2.3 重組Cap-Bacmid質(zhì)粒的鑒定 詳見圖2。

1和3：PCV2a和PCV2b陽(yáng)性樣品；2和4：陰性對(duì)照；M：DNA Marker DL2000 圖2 重組Cap-Bacmid質(zhì)粒的PCR鑒定

由圖2可見，提取攜帶PCV2a+PCV2b Cap基因的重組Cap-Bacmid質(zhì)粒為模板，以PCV2a和PCV2b的Cap基因引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得與預(yù)期大小相符的條帶，即表明PCV2a和PCV2b的Cap基因已成功轉(zhuǎn)入到Bacmid載體中。

2.4 重組PCV2a+PCV2b的Cap桿狀病毒的病毒滴度測(cè)定 通過MTT法測(cè)定重組病毒滴度，結(jié)果第1代病毒滴度為7.2×106pfu/mL，第2代病毒滴度為1.5×107pfu/mL，第3代病毒滴度為2.2×108pfu/mL。

2.5 重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定 詳見圖3。

M：蛋白分子Marker；1：空載桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞；2：重組Cap桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞 圖3 重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定

由圖3可見，重組Cap蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后能表達(dá)出與Cap蛋白大小相近的目的產(chǎn)物(約28 kd)，而對(duì)照空載桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后則未見此條帶。

2.6 重組Cap蛋白表達(dá)量的測(cè)定 經(jīng)ELISA法檢測(cè)得到重組桿狀病毒中PCV2的Cap蛋白表達(dá)量約為110 μL/mL，說明構(gòu)建的重組Cap蛋白能在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.7 重組Cap蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性 詳見表2、表3。

表2 免疫重組Cap蛋白后小鼠血清中的抗體水平

由表2可見，經(jīng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，與陰性對(duì)照組小鼠相比，免疫重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了PCV2抗體，且抗體水平隨時(shí)間逐漸增高。

表3 攻毒后小鼠脾組織樣品中PCV2基因組拷貝數(shù)

由表3可見，小鼠脾組織樣品的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，免疫重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白小鼠攻毒后，其組織樣品中PCV2病毒拷貝數(shù)顯著低于攻毒對(duì)照組。

3 小結(jié)與討論

PCV2對(duì)豬具有致病性，且可與其他病原混合感染，可對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。在豬圓環(huán)病毒病(PCVAD)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)中是最常見的臨床表現(xiàn)形式[6]。PCV2 感染可引起淋巴細(xì)胞缺失，造成免疫抑制，且不能通過有效的免疫應(yīng)答清除病毒。在患病最后階段，PMWS病豬表現(xiàn)為嚴(yán)重的淋巴組織損傷，同時(shí)影響外周血單核細(xì)胞和淋巴組織器官細(xì)胞因子的表達(dá)。由于PVC2容易誘發(fā)其他多種病毒和細(xì)菌的混合感染或繼發(fā)感染，可給疾病的診斷和治療帶來很大困難，已成為危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要病毒之一。

Cap蛋白是PCV2 唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，也是PCV2主要的免疫原性蛋白。PCV2a 亞型毒株在2003年前是主要流行毒株，其后PCV2b亞型成為主要流行毒株，2004年加拿大魁北克州的養(yǎng)豬場(chǎng)中鑒定出PCV2b。韓國(guó)2000-2008年期間豬群中鑒定出的PCV2 毒株大部分為PCV2b。PCV2在傳播中的不斷突變演化，可適應(yīng)并感染不同物種。如美國(guó)最近報(bào)道發(fā)現(xiàn)鵝體中檢測(cè)到ORF2序列，目前還在進(jìn)一步診斷病毒是否為新毒株[7]。

目前，針對(duì)PCV2的疫苗研發(fā)多是針對(duì)某一亞型，如PCV2a，PCV2b 和PCV2c 3個(gè)病毒亞型。全球已成功注冊(cè)的PCV2疫苗可分為2 類：全病毒滅活疫苗和單亞型亞單位疫苗。其中進(jìn)口注冊(cè)的商品化疫苗全部來源于PCV2a 基因型毒株。國(guó)內(nèi)近幾年陸續(xù)有PCV2b 亞型的滅活疫苗與亞單位疫苗上市，如浙江諾倍威公司的豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(ZJ/C株)，武漢中博生物股份有限公司的豬圓環(huán)病毒2 型桿狀病毒載體滅活疫苗(CP08株)等。自2006年P(guān)CV2疫苗逐步投入使用以來，雖為PCV2流行的防控取得了良好效果，但仍然是困擾養(yǎng)殖業(yè)的一種重大疫病，防控效果并不理想。如PCV2a疫苗株、PCV2b疫苗株雖然能相互提供一定的交叉保護(hù)，但由于PCV2a與PCV2b毒株之間的抗原性存在差異，無法達(dá)到100%保護(hù)，可能是造成疫病防控效果不佳的主要原因之一，如臨床PMWS發(fā)生率與PCV2a向PCV2b基因型的改變有著密切相關(guān)。此外，病毒不斷突變也是疫苗防控不力的原因之一，如近期烏拉圭研究人員發(fā)現(xiàn)PCV2b的一個(gè)新突變。為了提高PCV2疫苗的防控能力，一方面可以通過佐劑，如干擾素6和Cap蛋白共同表達(dá)可增強(qiáng)PCV2疫苗的免疫效果。另一方面PCV2雙亞型的Cap蛋白作為一種新型疫苗方式，可能提供更好的免疫保護(hù)效果[8-9]。

本研究采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PCV2a和PCV2b兩個(gè)亞型Cap蛋白的表達(dá)，免疫后第14 d小鼠血清中可檢測(cè)到PCV2抗體，且抗體水平在第21 d和28 d持續(xù)上升。免疫組脾臟中PCV2基因組拷貝數(shù)極低于未免疫組，表明重組Cap蛋白免疫能有效清除攻毒小鼠體內(nèi)的病毒。表明PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白有望能開發(fā)為PCV防控的新型疫苗。

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書 訊

三十年畜牧獸醫(yī)筆耕暨歷程

張斌榮著

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社出版

由中國(guó)科學(xué)院院士，原浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)校長(zhǎng)陳子元教授題寫書名，由原中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)常務(wù)理事，原浙江省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)常務(wù)副理事長(zhǎng)，秘書長(zhǎng)楊德祥先生作序，張斌榮著的《三十年畜牧獸醫(yī)筆耕暨歷程》已由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社出版，作者搜集了自1996年以來先后發(fā)表在各類專業(yè)雜志的論文和著作，農(nóng)事活動(dòng)紀(jì)要，著名畜牧專業(yè)戶列傳及作者的其他著作和隨筆題錄，內(nèi)容涉及畜禽育種，飼料資源開發(fā)利用，科學(xué)飼養(yǎng)配套技術(shù)，畜禽防病防控，農(nóng)牧業(yè)發(fā)展新思路及新農(nóng)村、新生活、新思維等創(chuàng)新內(nèi)容，值得同行們閱讀和回憶。全書約258千字，2017年3月第1版，定價(jià)35.00元。

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2017-02-20

S858.28

A

1005-7307(2017)03-0001-005