楊黎黎 王慶甫 王 歡 張 棟 王偉利 丁昊彬 甘 穩(wěn) 徐銘康 杜汪洋 郭玉茹

(北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京，100029)

MTT法檢測通絡止痛方對人膝骨關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的影響

楊黎黎 王慶甫 王 歡 張 棟 王偉利 丁昊彬 甘 穩(wěn) 徐銘康 杜汪洋 郭玉茹

(北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京，100029)

目的:探討通絡止痛方對人膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)滑膜成纖維細胞增殖的影響。方法：取本院行全膝關節(jié)置換術患者術中廢棄滑膜組織，經(jīng)I型膠原酶消化后進行原代培養(yǎng),取3～4代成纖維細胞進行高、中、低濃度通絡止痛方干預。應用四甲基偶氮唑鹽法測定(MTT)法檢測KOA滑膜細胞的增殖水平，并用倒置顯微鏡下觀察各濃度下的細胞形態(tài)。結果：加藥組組間與加藥組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTT法檢測隨通絡止痛方濃度減小KOA滑膜細胞在490 nm波長處吸光OD值數(shù)越大；高中濃度組抑制率為正值，隨濃度增加抑制率增大，低濃度抑制率為負值，隨濃度降低抑制率減少。結論：高、中濃度通絡止痛方對滑膜細胞增殖有抑制作用，低濃度組的通絡止痛方對滑膜細胞有增殖有促進作用。

通絡止痛方；MTT法檢測；人膝骨關節(jié)炎；成纖維細胞

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(Knee Ostoeahritis，KOA)是多發(fā)于老年人中的常見退行性疾病，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，但目前為止該病病因尚不明確，也沒有一種治療方法可以從根本上預防、改變或中止KOA[1]滑膜炎性反應在骨關節(jié)炎病程進展中起到的重要作用[2]。其中滑膜細胞主要分為巨噬樣細胞(A型細胞)，成纖維樣細胞(B型細胞)和樹突狀細胞。成纖維細胞是一種介導關節(jié)破壞的主要細胞，抑制成纖維細胞的增殖，可以有效緩解骨關節(jié)炎性反應的癥狀及進展。通絡止痛方通過超聲促透的方法治療KOA患者的治療取得了滿意的療效[3-4]。為了明確通絡止痛方對KOA滑膜炎性反應細胞的作用，本實驗應用MTT法檢測通絡止痛方對KOA滑膜炎性反應細胞增殖的影響，進一步明確該方對滑膜成纖維細胞的作用，并探討其機制。為其進一步研究和臨床應用提供基礎，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 人KOA炎性滑膜組織源于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院行關節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等,加入PBS洗滌，PBS清洗2次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2 mL 0.4%I型膠原酶的25 cm2培養(yǎng)瓶中消化2.5 h(期間搖勻數(shù)次)。經(jīng)200目金屬篩過濾。取未黏附的細胞移至離心管中，用2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,反復吹打后將細胞接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。1～2 d換液1次，選取3～4代細胞，純度大于98%，經(jīng)鑒定后用于實驗。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清購自四季青公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、I型膠原酶均購自Gibco公司。MTT(噻唑藍)、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國生物技術儀器公司)、BH-2型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；96孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning;CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific;25 cm2培養(yǎng)瓶，丹麥NUCU公司；四環(huán)凍干機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.1.3 藥物制備 通絡止痛處方由桃仁、紅花、桂枝、白芍、制草烏、細辛、川椒、牛膝、乳香、沒藥組成,購于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥房。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內(nèi),加水浸泡,煮沸30 min,棄藥渣取湯劑，經(jīng)過離心機2 000 r/min離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機進行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，配制成高、中、低濃度3組依次為：高濃度組：10/42mg/mL、10/43mg/mL、10/44mg/mL；中濃度組：10/45mg/mL、10/46mg/mL、10/47mg/mL；低濃度組：10/48mg/mL、10/49mg/mL、10/410mg/mL；空白組：0 mg/mL。-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測KOA滑膜細胞增殖活性 取生長狀況良好的成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，無菌條件下與含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液經(jīng)吹打制成滑膜細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，每孔細胞約1 000個。每塊96孔板四周邊孔用PBS填充以避免邊緣效應。將細胞放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細胞貼壁并進入對數(shù)增長期。

棄上清液，加入已配置的不同濃度通絡止痛方100 μL/孔，每種濃度設置4個復孔。置于培養(yǎng)箱中，36 ℃，5%CO2培育24 h。培養(yǎng)箱培育后吸棄各孔藥物，用PBS洗3遍。換入5 mg/mL的MTT-PBS液10 μL/孔，無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，終止培養(yǎng)。棄上清，加DMSO 100 mL/孔震蕩10 min后，在ELX800型酶標儀上測其在490 nm波長處的吸光OD值(A)。用A值按如下公式計算各濃度藥物干預后的細胞抑制率，公式如下：

抑制率(%)=(A空白-A藥液)/A空白×100%,抑制率為正數(shù)時,表明該藥物對細胞的增殖有抑制作用，抑制率為負數(shù)時表明該藥物對細胞的增殖有促進作用。

1.2.2 形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡觀察各組不同濃度細胞的生長特點及形態(tài)。

2 結果

2.1 鏡下觀察滑膜細胞的生長 原代培養(yǎng)細胞4 h可見細胞貼壁(圖1)，細胞成星狀，通過3～4條樹突與培養(yǎng)瓶相貼，細胞器不明顯，細胞密度稀疏。隨培養(yǎng)時間至3～4代細胞(圖2)，形態(tài)成滑膜成纖維細胞呈梭形、樹突樣，胞核狹長,增殖旺盛,細胞器可見。低濃度通絡止痛方對人KOA滑膜細胞生長有促進作用，細胞數(shù)量明顯增多。高濃度通絡止痛方對于細胞生長有抑制作用，可見少量細胞漂浮，緊密排列無規(guī)則，外觀多由梭形皺縮為圓形。

圖1 原代培養(yǎng)4 h貼壁KOA滑膜細胞

2.2 MTT法測定不同濃度組KOA滑膜細胞增殖活性 加藥組組間與加藥組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTT法檢測隨通絡止痛方濃度減小KOA滑膜細胞在490 nm波長處吸光OD值數(shù)越大。見表1。高、中濃度組通絡止痛方對于KOA滑膜細胞的增殖有抑制作用，隨濃度的增加，抑制作用增強，高濃度較中濃度的抑制率明顯增加，但高濃度中，隨著濃度增加，抑制率的增長幅度減小。低濃度組的通絡止痛方對滑膜細胞有增殖有促進作用。隨濃度的減低，促進作用增強，但低濃度中，隨著濃度減低，促進作用的增強幅度減低。見表2、圖3。

圖2 KOA滑膜3～4代細胞細胞

表1 通絡止痛方干預對KOA滑膜細胞增殖影響的OD值

注：與空白組比較，*P<0.05。

表2 不同濃度通絡止痛方對KOA滑膜細胞增殖抑制率(%)

3 討論

KOA是關節(jié)炎里最常見的疾病，根據(jù)人口統(tǒng)計學資料預測，到2020年，受關節(jié)疾病影響的人口比例將占到全世界人口的50%,將有5.7億人受到KOA的困擾。KOA是世界上導致殘疾的第八大疾病[5]。盡管如此，但KOA發(fā)病機制還不清楚。并且到目前為止，還沒有一種治療方法可以從根本上預防、改變或中止KOA的疾病進程[6]。最后多數(shù)KOA晚期患者不得不通過接受膝關節(jié)置換術，來“治愈”KOA。而很多KOA患者由于自身身體條件及家庭經(jīng)濟承受能力所限，無法接受膝關節(jié)置換術。因此，研究KOA的發(fā)病機制，并尋找防治KOA的有效治療藥物及手段是保證國民健康，提高KOA患者生活質(zhì)量和減輕國家醫(yī)療負擔的迫切需求。盡管KOA被普遍認為是一種退行性疾病，但滑膜炎性反應在KOA病理和臨床的重要作用逐漸被認識[7]。骨性關節(jié)炎的病因?qū)W主要表現(xiàn)在2個方面：一是關節(jié)軟骨破壞導致軟骨細胞生物學特性改變，二是滑膜炎性反應致使滑膜細胞釋放炎性反應遞質(zhì)。有研究報道，骨性關節(jié)炎中關節(jié)軟骨在致病因素作用下被破壞后，釋放碎片進入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎?；ぱ揍尫叛仔苑磻f質(zhì)，進一步降解軟骨，周而復始造成惡性循環(huán)，故滑膜炎的存在是骨性關節(jié)炎軟骨損傷及骨性關節(jié)炎慢性持續(xù)化的重要原因[8]。因此，因此探討對于滑膜炎的干預藥物，對研究治療滑膜炎及延緩治療KOA有重要意義。

圖3 不同濃度通絡止痛方對KOA滑膜細胞增殖抑制率(%)

注：1～9代表濃度10/42～10/410mg/mL。

了解細胞的存活與增殖情況，在細胞水平研究中是非常重要的。目前，主要的檢測方法有同位素摻入法和活細胞計數(shù)法。前者利用放射同位素，機器價格昂貴，污染較大。后者結果易受主觀因素影響，操作繁瑣，誤差大。因此2種方法都有一定的使用限制。MTT法應用原理是線粒體MTT法的主要原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的紫色結晶物甲瓚(Formazan),并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。以其簡便、經(jīng)濟、安全等特點,而被廣泛使用。

通絡止痛方是我們導師憑借多年治療KOA的經(jīng)驗總結而成，組成包括：桃仁、紅花、桂枝、白芍、制草烏、細辛、川椒、牛膝、乳香、沒藥。主要功效包括活血化瘀，通絡止痛。其中白芍、桂枝為通絡止痛湯的君藥，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽化氣之功效；白芍苦、酸、微寒，有養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛之功效。兩者合用一斂一散,一補一開，解肌發(fā)表,調(diào)和營衛(wèi),使發(fā)汗而不傷陰，氣血調(diào)而不傷氣。兩藥合用亦可治療氣血不調(diào)導致的四肢酸楚、麻木、疼痛等。以桃仁、紅花、乳香、沒藥為臣藥，可活血祛瘀、行氣止痛、舒筋通絡。紅花、桃仁為活血化瘀常用藥對。紅花辛溫,主入心、肝經(jīng),散瘀止痛?！夺t(yī)學衷中參西錄》云：“乳香、沒藥，二藥并用，為宣通臟腑、流通經(jīng)絡之要藥，……具通氣活血之力，又善治風寒濕痹，周身麻木，四肢不遂及一切瘡瘍腫疼，或其瘡硬不疼?！边@4味藥可加強行氣活血化瘀的藥力，正所謂“治風先治血，血行風自滅”。制草烏、細辛為本方的佐藥，具有祛風除濕、溫經(jīng)散寒、消腫止痛之效。川椒為為本方的使藥，具有活血祛瘀、祛風利濕之效。牛膝“性善下行”，具有良好的引經(jīng)作用，且有補肝腎,強筋骨之功。全方組成嚴謹，配伍精湛。

為了增加該方有效的理論依據(jù)，我們進行了一系列臨床及基礎研究。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，通絡止痛外治法治療KOA可有效減輕患者疼痛、改善膝關節(jié)功能[3]；動物實驗發(fā)現(xiàn)，通絡止痛外治法能夠顯著抑制兔KOA滑膜細胞炎性反應因子生成[9-10]；作用于大鼠不同程度KOA中通過降低血清中軟骨基質(zhì)相關細胞因子CTX-Ⅱ、COMP和MMP-3含量可以有效減緩或阻止膝關節(jié)軟骨的退行性變[11-12]；將該方君藥桂枝的有效成分桂皮醛作用于人KOA滑膜細胞，證明DAMPs/Toll樣受體(TLRs)介導的NF-κB炎性反應通路在骨性關節(jié)炎滑膜炎性反應中起到重要的調(diào)控作用，NF-κB通路上的許多基因均參與骨性關節(jié)炎滑膜炎性反應[13]。將該方君藥桂枝、白芍的有效成分桂皮醛、白芍總苷作用于人KOA滑膜細胞，對骨性關節(jié)炎滑膜炎性反應起到調(diào)控作用，參與骨性關節(jié)炎滑膜炎性反應[14]但是該方作為成方進行的研究還沒有開展，導致作用機制尚不清楚，限制了其在臨床的廣泛應用。本實驗建立人KOA滑膜成纖維細胞體外培養(yǎng)體系,以MTT法[15]觀察不同濃度通絡止痛方對人成纖維細胞增殖的影響,篩選出合適藥物濃度。進一步探討通絡止痛方的作用機制，為該方劑進行新藥開發(fā)研制、走向市場提供一定的實驗參數(shù)。

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(2016-06-16收稿 責任編輯：白樺)

Effect of Tongluo Zhitong Decoction on Proliferation of Synovial Fibroblasts in Patients with Knee Osteoarthritis by MTT

Yang Lili,Wang Qingfu,Wang Huan,Zhang Dong,Wang Weili,Ding Haobin,Gan Wen,Xu Mingkang,Du Wangyang,Guo Yuru

(TheThirdAffiliatedHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To explore the effect of Tongluo Zhitong Decoction on the proliferation of knee osteoarthritis (KOA) synovial fibroblasts. Methods:The abandoned synovial tissues were taken from patients who had knee replacement surgery in the hospital. The tissues were primarily cultured after digestion in I type collagenase. Three to four generation fibroblasts were taken for high-medium-low concentration intervention. The proliferation of KOA synovial cells was detected by 4-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) and the cell morphology was observed under the inverted microscope. Results:Comparisons between the drug groups and comparisons between the drug groups and the control group,the difference was statistically significant (P<0.05). MTT assay showed that s the light OD number of KOA synovial cells became greatest in the wavelength of 490 nm when Tongluo Zhitong Decoction concentration decreased. The inhibition rates of high-medium concentration groups were positive. With the increase of the concentration,the inhibition rate increased and the inhibition rate of the low concentration group was negative. With the concentration decreased,the inhibition rate reduced. Conclusion:The medium-high concentrated Tongluo Zhitong Decoction may inhibit the proliferation of synovial cells,while low concentrated Tongluo Zhitong Decoction may promote the proliferation of synovial cells.

Tongluo Zhitong Decoction; MTT method; Knee osteoarthritis; Fibroblast

國家自然科學基金面上項目(編號：81373662)；北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(編號：2016-JYB-XS192)

楊黎黎(1987.07—)，男，博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治退行性骨關節(jié)炎，E-mail：105381902@qq.com

王慶甫(1956.10—)，男，碩士研究生，教授，主任醫(yī)師，副院長，研究方向：中醫(yī)藥防治退行性骨關節(jié)炎，E-mail：qingpu-wang@sohu.com

R274.9；R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.038