謝陽姣　李耀燕　閆國躍　何志鵬　白燕遠

摘要：【目的】探索苦玄參育種材料的遺傳多樣性及親緣關系，為苦玄參育種資源的選擇及遺傳改良提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷肧SR分子標記，分析12份苦玄參育種材料的基因多樣性指數(shù)（Nei）、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）、多態(tài)性百分率（P）及各材料間的遺傳距離，并基于遺傳距離對其進行聚類分析，以明確該育種材料的遺傳多樣性和親緣關系。【結果】17對SSR引物共擴增出73個等位基因，平均每對引物4.3個。各引物間P變化范圍為8.33%～100.00%，平均60.78%；多態(tài)信息量（PIC）變化范圍為0.0767～0.7598，平均0.5184。供試材料遺傳多樣性的平均Nei=0.3002、I=

0.4162、P=59.81%，其中xyj01、xyj06和ytL09種質Nei、I和P最高，分別為0.3529、0.4893和70.59%；Lxj12種質Nei、I和P最低，分別為0.2059、0.2854及41.18%。ytl09和zgb03 2份種質間遺傳距離最近，僅0.0929?；谶z傳距離的聚類分析結果表明，在遺傳距離0.4084處可將12份種質分成4個群體，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余歸為一群。Lxj12與zgb04、ytl11與wzhjx09、ytl09與zgb03、wzhjx12與xyj06和wzhzp22間分別擁有較近的親緣關系?！窘Y論】供試12份苦玄參種質材料間存在一定的遺傳差異，作為育種親本具有一定的選擇價值。

關鍵詞： 苦玄參；SSR；遺傳多樣性

中圖分類號： S567.53 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0020-06

Abstract：【Objective】The objective of this research was to explore genetic diversity and genetic relationship of Picria felterrae Lour. breeding materials and to provide reference for breeding materials selection and genetic improvement. 【Method】Using SSR molecular marker， gene diversity index（Nei），shannon diversity information index（I），percentage of polymorphic loci（P） and genetic distance of 12 breeding materials P. felterrae Lour.were analyzed. And cluster analysis was conducted based on genetic distance to study the genetic diversity and genetic relationship of the 12 breeding materials. 【Result】A total of 73 alleles were amplified from 17 pairs of SSR primers，4.3 alleles per primer. Among the primers， P varied between 8.33%-100.00%，with an average of 60.78%； polymorphic information content（PIC） varied between 0.0767-0.7598 which was 0.5184 on average. For the 12 germplasm samples tested，the average level of genetic diversity was Nei=0.3002，I=0.4162，and P=59.81%. Number xyj01， xyj06 and ytL09 had the highest Nei which was 0.3529， the highest I 0.4893 and the highest P 70.59%. Whereas Lxj12 had the lowest level in Nei which was 0.2059，the lowest I 0.2854 and the lowest P 41.18%. Number ytl09 and zgb03 had the shortest genetic distance， which was 0.0929. The cluster analysis based on genetic distance revealed that the 12 germplasm samples could be divided into four groups at the location where genetic distance was 0.4084. Number wzhjx07，lxj09，and xyj01 made up three groups by themselves， and the rest was in the last group. There were close genetic relationships between Lxj12 and zgb04，between ytl11 and wzhjx09，between ytl09 and zgb03，between wzhjx12 and xyj06， wzhzp22. 【Conclusion】Certain genetic difference exists in the 12 tested Picria felterrae Lour. breeding materials，which are valuable in terms of selection of parents in breeding.

Key words： Picria felterrae Lour.； SSR； genetic diversity

0 引言

【研究意義】苦玄參（Picria felterrae Lour.）是收錄于中國藥典的一種藥用植物（國家藥典委員會，2015），是廣西道地藥材，在廣西作為藥用已有200多年的歷史（蔣妮等，2013）?？嘈⒆?0世紀50年代由分布于龍州的野生種質被馴化以來，隨后引種至梧州等地，成為梧州及龍州部分地區(qū)重要的經濟作物之一。目前，苦玄參栽培種質未經品種純化，且經過多年人工種植后種質優(yōu)勢發(fā)生退化，導致藥材質量下降。因此，科學選擇優(yōu)良種質，對苦玄參品種進行純化和改良非常必要。作物育種的本質是聚集更多優(yōu)良基因，從基因水平研究苦玄參種質差異可為苦玄參良種選育和遺傳改良提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)育種主要依賴于對植物表型性狀進行選擇，選擇效率較低。分子標記輔助育種利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測相連鎖的分子標記達到選擇目標性狀的目的，相較于表型選擇具有快速、準確等優(yōu)點，因此成為作物育種研究的熱點。常用DNA分子標記中的簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）在原核生物和真核生物基因組中隨機分布，且該標記呈共顯性，符合孟德爾遺傳定律，易于操作，具有高度重復性和可靠性，顯示出較強的多態(tài)性等優(yōu)點，使其在作物遺傳育種方面得到廣泛應用，成為分子標記輔助育種的重要分子標記之一（陳懷瓊等，2009）。王娟等（2013）利用SSR分子標記，輔助選擇了棉花育性恢復基因Rf1；吳斌等（2014）利用SSR連鎖群圖譜，定位了4個控制β-葡聚糖含量的QTL位點。在遺傳多樣性分析方面，陳嬌等（2013）應用SSR分子標記對櫻桃野生居群的多樣性進行分析，明確了不同居群的遺傳分化水平；倪先林等（2015）為了闡明糯高粱種質資源之間的親緣關系，用25對SSR引物評價29份糯高粱種質資源，結果表明，29份糯高粱品種的親緣關系與地理來源關系不明顯，其種質資源具有較豐富的遺傳多樣性；南文卓等（2016）利用SSR分子標記對30份甘薯種質資源進行遺傳多樣性分析，明確了其在DNA分子水平上的遺傳差異；張恩慧等（2016）利用SSR分子標記對97份廣西有代表性的普通油茶種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明，已開發(fā)的油茶SSR分子標記適用于廣西普通油茶，廣西普通油茶種質資源擁有較豐富的遺傳多樣性。【本研究切入點】目前，關于苦玄參的研究主要集中在化學成分、藥理藥效及人工種植技術方面（王力生，2004；王奇志等，2010；陳君等，2013；蔣妮等，2013），而與其分子遺傳基礎相關的研究較少。本課題組前期試驗選擇出的苦玄參育種材料的分子遺傳基礎也有待明確?！緮M解決的關鍵問題】利用SSR分子標記分析本課題組前期選擇的苦玄參育種材料的遺傳差異及親緣關系，為其育種資源的選擇及遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料采于苦玄參主產區(qū)廣西龍州和梧州，根據(jù)苦玄參苷IA、苦玄參苷IB、花色、莖節(jié)、分枝數(shù)、莖色、葉脈、葉緣和葉基等表型性狀差異篩選出12份育種親本。12份種質的形態(tài)學性狀及苦玄參苷含量見表1。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 材料處理 供試材料種子于2015年在廣西南寧統(tǒng)一種植，2月底播種，4月底移植，溫室水培。水培裝置為定制的方形水管，內徑20 cm，長度110 cm，孔徑8 cm，每個培養(yǎng)箱22個孔徑（每孔2株，共44株），每份種質種植5個水培箱，合計220株。用于預試驗的Lxj12和zgb04種植數(shù)量翻倍。水培液為改良的霍格蘭氏營養(yǎng)液，每10 d更換1次；水泵驅動水循環(huán)解決供氧問題。7月統(tǒng)一取樣，取樣時取主莖倒數(shù)第2對真葉，置于20倍數(shù)量的硅膠瓶中迅速干燥后，置于-20 ℃冰箱保存，用于提取總DNA。

1. 2. 2 預試驗 由于取樣數(shù)量過大將增加試驗成本，取樣數(shù)量過小則影響試驗結果，本研究參考孫峰成等（2013）的方法，以編號為Lxj12和zgb04的2份材料為預試驗材料，分別從其中選取60個單株用于取樣數(shù)量和方法的預試驗。其中，樣本分為單株提取DNA、15和30個單株葉片分別混合提取DNA及單株提取DNA后15和30個單株的DNA分別等量混合，即每份材料共72個DNA樣本。提取方法編碼見表2。

1. 2. 3 正式試驗取樣和DNA提取 正式試驗根據(jù)預試驗結果，每份種質取60個單株，分成2組，每30個單株提取DNA后，等量混合用于PCR擴增。DNA采用CTAB法提取，提取產物取2～3 μL用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，其余置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 PCR擴增 PCR反應體系20.0 μL：ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，Buffer 2.0 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，DNA模板2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃35 s，72 ℃ 40 s，進行35個循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min。引物為本課題組采用磁珠富集法開發(fā)，從開發(fā)的100對引物中篩選出具有多態(tài)性的引物17對，具體信息及NCBI登錄號見表3（X-P34由于所在序列太短，不能上傳序列至NCBI）。

1. 2. 5 變性電泳 選擇擴增PCR產物加上樣緩沖液，94 ℃變性10 min后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，銀染后觀察。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

用POPGENE 32.0計算以下參數(shù)：（1）多態(tài)位點百分率（P）；（2）平均多態(tài)信息量（PIC）；（3）基因多樣性指數(shù)（Nei）。并基于遺傳距離，采用UPGMA法對各種群進行聚類分析，構建聚類分析圖。

2 結果與分析

2. 1 預試驗結果

以編號為Lxj12和zgb04的種質為預試驗材料，以單株DNA、葉片混合樣品提取DNA及單株DNA混合為樣本，以等位基因數(shù)為評價指標，分析不同取樣方式的差異，結果見表4和表5。由表4和表5可知，Lxj12種質經5種取樣方式獲得的等位基因數(shù)相同；zgb04種質除30個單株葉片混合后提取DNA的引物X-P18少擴增1個等位基因外，其余引物擴增等位基因數(shù)均相等。由此可知，5種取樣方法中除30個單株葉片混合提取DNA與單株提取DNA的樣本間可能存在差異外，其余幾種方式均與單株提取DNA無差異。可能是本研究所選擇的材料均來自單株，由于苦玄參為自花授粉植物，經多年種植后，材料趨于穩(wěn)定，因此單株后代分離較小，等位基因數(shù)較穩(wěn)定，混合DNA樣本基本能代表單株DNA樣本進行等位基因分析。鑒于多個單株葉片混合樣本可能存在等位基因擴增不完全的現(xiàn)象，而單株樣本試驗過于復雜，因此采用30個單株提取DNA后等量混合進行后續(xù)研究。

2. 2 遺傳多樣性分析結果

由表6可知，在17對SSR引物中，引物X-P30在hjx07種質中未擴增出有效產物，其余均能擴增出穩(wěn)定清晰可辯的產物。其中，17對SSR引物共擴增出73個等位基因，每對引物可擴增出2～8個等位基因，平均每個引物可擴增等位基因4.3個?？偽稽c204個，擴增位點203個，其中多態(tài)位點124個，每對SSR引物的多態(tài)位點1～12個，平均7.3個。各引物間多態(tài)位點百分率（P）變化范圍較大（8.33%～100.00%），平均為60.78%，多態(tài)百分比較高。各SSR引物多態(tài)信息量（PIC）變化范圍為0.0767～0.7598，平均值0.5184。

由表7可知，供試材料不同種質間的Neis基因多樣性指數(shù)（Nei）、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）及P均具有明顯差異，Nei變化范圍在0.2059～0.3529，平均0.3002；I變化范圍為0.2854～0.4893，平均0.4162；P變化范圍為41.18%～70.59%，平均59.81%。以上3個指標最高的是xyj01、xyj06和ytL09種質，最低的是Lxj12種質，說明xyj01、xyj06和ytL09具有較高的遺傳變異，Lxj12變異較小。由此可知，選出的12份種質間存在一定程度的遺傳分化。

2. 3 各種質間親緣關系

由表8中各種質的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離可知，12份育種材料的相似系數(shù)和遺傳距離分布范圍較廣，相似系數(shù)為0.4286～0.9113，遺傳距離為0.0929～ 0.8472。其中，ytl09和zgb03種質相似系數(shù)最高，為0.9113；遺傳距離最小，僅0.0929，表明其親緣關系最近；ytl11和wzhjx07種質相似系數(shù)最小，為0.4286；遺傳距離最大，為0.8472，表明其親緣關系較遠。依據(jù)遺傳距離進行聚類分析（圖1），結果發(fā)現(xiàn)在遺傳距離0.5136處，可將12份種質分為兩大群體，其中類群1包括wzhjx07和lxj09 2個種質，其余種質歸入另一類群（Ⅱ）。在遺傳距離0.4084處，可將12份種質分成4個群體，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余歸為一群，表明這3個種質與其他種質的親緣關系較遠，其他種質來源親緣關系較近。Lxj12與zgb04、ytl11與wzhjx09、ytl09與zgb03、wzhjx12與xyj06和wzhzp22間各自擁有較近的親緣關系。

3 討論

3. 1 苦玄參育種材料的遺傳多樣性

苦玄參為廣西道地藥材，由于野生資源的缺乏，其藥材來源以人工種植為主。但苦玄參人工種植品種不純，質量不一，急需對其栽培種質進行遺傳改良和品種純化。種質資源是育種工作的基礎，而植物遺傳多樣性研究與種質資源評價和鑒定是種質資源研究的重要內容。本研究基于SSR分子標記，對本課題組前期選擇的12份育種材料進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)12份種質的基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息指數(shù)及多態(tài)位點百分率均具有一定差異，12份種質間存在一定程度的遺傳分化，作為育種親本具有選擇意義。苦玄參為自花授粉植物，經多代自交后種質趨于純合，品種經純化后理論上較難分離。但由于苦玄參栽培種質為20世紀50年代由野生種質馴化而來，未經品種純化，且經多年種植后出現(xiàn)變異，可能是其種質發(fā)生分化的根本原因。

苦玄參分布于我國南部、西南部及越南、印度等熱帶亞熱帶地區(qū)（李玲和金李峰，2016），分布區(qū)的氣候和土壤具有一定差異，種質變異明顯，遺傳基礎豐富。本研究僅對本課題組前期選擇育種群體的遺傳多樣性進行分析，選材具有一定局限性。為豐富苦玄參遺傳改良資源，下一步有必要對其自然分布區(qū)的野生資源進行評價及鑒定，以收集更多育種材料，為苦玄參遺傳改良提供更多資源。

3. 2 基于SSR分子標記育種材料間的親緣關系

種質資源親緣關系的分析是建立育種群體的基礎。一般來說，親緣關系越遠，遺傳距離越大，其性狀變異越大，育種資源越豐富（胡標林等，2012）。分析苦玄參育種親本間的親緣關系，對苦玄參育種群體的建立和親本的選擇具有重要意義。本研究基于SSR遺傳距離對所選的12份育種材料進行聚類分析，可知12份種質的遺傳距離分布范圍較廣，其中wzhjx07、lxj09和xyj01與其他種質間遺傳距離較遠，分化較大，可能在種植過程中受各種因素的影響產生了明顯變異；另有2份品質較高的種質Lxj12和zgb04遺傳距離較近。該結果可為育種親本的篩選提供基礎。

本研究中SSR分子標記引物采用磁珠富集法獲得，由于該法較復雜且費用較高，因此開發(fā)的引物數(shù)量有限。本研究僅應用17對具有多態(tài)性的引物進行SSR多態(tài)性分析，分析結果可能受到一定影響?，F(xiàn)今高通量測序已成為常規(guī)分子分析手段，采用轉錄組測序開發(fā)SSR分子多態(tài)性標記更有前景，可成為今后苦玄參遺傳基礎研究的方向。

4 結論

本研究結果表明，12份苦玄參育種材料的基因多樣性指數(shù)、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)及多態(tài)性百分率均具有明顯差異；各種質間遺傳距離分布范圍較廣，在遺傳距離0.4084處可將12份種質分成4個群體，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余歸為一群。12份材料間遺傳分化明顯，作為育種親本具有一定的選擇價值。

參考文獻：

陳懷瓊，隋春，魏建和. 2009. 植物SSR引物開發(fā)策略簡述[J]. 分子植物育種，7（4）：845-851.

Chen H Q，Sui C，Wei J H. 2009. Summary of strategies for developing SSR primer[J]. Molecular Plant Breeding，7（4）：845-851.

陳嬌，王小蓉，湯浩茹，陳濤，黃曉姣，梁勤彪. 2013. 基于SSR標記的四川野生中國櫻桃遺傳多樣性和居群遺傳結構分析[J]. 園藝學報，40（2）：333-340.

Chen J，Wang X R，Tang H R，Chen T，Huang X J，Liang Q B. 2013. Assessment of genetic diversity and populations genetic structure in wild Chinese cherry from Sichuan province using SSR markers[J]. Acta Horticulturae Sinica，40（2）：333-340.

陳君，甄漢深，韋建華. 2013. 苦玄參葉抗炎藥理作用研究[J].海峽藥學，25（2）：23-25.

Chen J，Zhen H S，Wei J H. 2013. Study on anti-inflammation of Picria feltarrae leaves[J]. Strait Pharmaceutical Journal，25（2）：23-25.

國家藥典委員會. 2015. 中華人民共和國藥典[K]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社：328.

Chinese Pharmacopoeia Commission. 2015. Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China[K]. Beijing：China Medical Science Press：328.

胡標林，萬勇，李霞，雷建國，羅向東，嚴文貴，謝建坤. 2012. 水稻核心種質表型性狀遺傳多樣性分析及綜合評價[J]. 作物學報，38（5）：829-839.

Hu B L，Wan Y，Li X，Lei J G，Luo X D，Yan W G，Xie J K. 2012. Analysis on genetic diversity of phenotypic traits in rice（Oryza sativa） core collection and its comprehensive assessment[J]. Acta Agronomica Sinica，38（5）：829-839.

蔣妮，白隆華，董青松，林偉國，黃宇聲，余生. 2013. 苦玄參褐斑病病原鑒定及致病因素分析[J]. 湖北農業(yè)科學，52（16）：3836-3838.

Jiang N，Bai L H，Dong Q S，Lin W G，Huang Y S，Yu S. 2013. Pathogen identification of Picria felterrae brown spot and analysis on the pathogenic factor[J]. Hubei Agricultural Sciences，52（16）：3836-3838.

李玲，金李峰. 2016. HPLC法測定不同產地苦玄參中3種成分的含量[J]. 中藥材，39（2）：355-357.

Li L，Jin L F. 2016. Measuring three component in Picria felterrae Lour. from different producing area based on HPLC[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials，39（2）：355-357.

南文卓，張小貝，蘇一鈞，祝志欣，曹清河，朱國鵬. 2016. 30份海南地區(qū)引種甘薯種質資源的SSR分析[J]. 貴州農業(yè)科學，44（12）：1-5.

Nan W Z，Zhang X B，Su Y J，Zhu Z X，Cao Q H，Zhu G P. 2016. SSR analysis on 30 sweet potato germplasm resources introduced to Hainan area[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（12）：1-5.

倪先林，趙甘霖，劉天朋，胡炯凌，李元，陳國民，汪小楷，丁國祥. 2015. SSR分子標記在糯高粱種質資源遺傳多樣性分析中的應用[J]. 江蘇農業(yè)學報，31（1）：16-22.

Ni X L，Zhao G L，Liu T P，Hu J L，Li Y，Chen G M，Wang X K，Ding G X. 2015. Genetic diversity analysis of glutinous sorghum germplasm by simple sequence repeat[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（1）：16-22.

孫峰成，馮勇，于卓，白晨，付增娟，于傳宗，邵志壯. 2013. SSR技術分析玉米群體遺傳變異的最優(yōu)取樣方法[J]. 玉米科學，21（1）：44-45.

Sun F C，F(xiàn)eng Y，Yu Z，Bai C，F(xiàn)u Z J，Yu C Z，Shao Z Z. 2013. Optimized sampling method for genetic variation survey in maize populations using SSR markers[J]. Journal of Maize Sciences，21（1）：44-45.

王娟，董承光，孔憲輝，劉麗，王旭文，余渝. 2013. SSR分子標記輔助選擇棉花育性恢復基因Rf1[J]. 新疆農業(yè)科學，50（4）：599-602.

Wang J，Dong C G，Kong X H，Liu L，Wang X W，Yu Y. 2013. Molecular marker assisted selecting CMS fertility restoring gene Rf1 by SSRs[J]. Xinjiang Agricultural Sciences，50（4）：599-602.

王力生. 2004. 苦玄參的化學成分研究及應用[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學：79-85.

Wang L S. 2004. Studies on the chemical constituents of Picria fel-terrae Lour. and its application[D]. Beijing：Beijing University of Chinese Medicine：79-85.

王奇志，陳雨，王鳴，馮煦. 2010. 苦草提取物Pft-d對小鼠S180肉瘤、肝癌Heps的抗癌作用及體外細胞毒活性實驗研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，25（2）：134-137.

Wang Q Z，Chen Y，Wang M，F(xiàn)eng X. 2010. Study on antitumor activities of extracts Pft-d from Picria fel-terrae[J]. Drugs & Clinic，25（2）：134-137.

吳斌，張茜，宋高原，陳新，張宗文. 2014. 裸燕麥SSR標記連鎖群圖譜的構建及β-葡聚糖含量QTL的定位[J]. 中國農業(yè)科學，47（6）：1208-1215.

Wu B，Zhang Q，Song G Y，Chen X，Zhang Z W. 2014. Construction of SSR genetic linkage map and analysis of QTLs related to β-glucan content of naked oat（Avena nuda L.）[J]. Scientia Agricultura Sinica，47（6）：1208-1215.

張恩慧，王曉云，覃子海，趙文東，韋長江，王鵬良. 2016. 廣西普通油茶種質資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 廣西植物，36（7）：806-811.

Zhang E H，Wang X Y，Qin Z H，Zhao W D，Wei C J，Wang P L. 2016. Genetic diversity analysis of Camellia oleifera in Guangxi using SSR markers[J]. Guihaia，36（7）：806-811.

（責任編輯 王 暉）