柴弋霞　蔡夢(mèng)穎　金曉玲　張冬林

摘要： 紫花含笑（Michelia crassipes）花色艷麗、花香濃郁，為解釋其在自然條件下結(jié)實(shí)率低的原因和判斷最佳雜交時(shí)期，該研究從傳粉生物學(xué)入手，通過(guò)觀(guān)察紫花含笑開(kāi)花動(dòng)態(tài)，運(yùn)用異交指數(shù)（OCI）、花粉胚珠比（P/O）、花粉和柱頭活性、人工授粉試驗(yàn)等方法對(duì)其繁育系統(tǒng)進(jìn)行了檢測(cè)，并記錄訪(fǎng)花昆蟲(chóng)的種類(lèi)和行為。結(jié)果表明：（1）紫花含笑花期在4—5月，持續(xù)50 d左右，單花花期4～5 d。（2）雌雄同花，雌蕊先成熟，雄蕊空間位置高于雌蕊。（3）OCI等于4，P/O為2671±123。（4）套袋實(shí)驗(yàn)表明紫花含笑能進(jìn)行少量的自花傳粉，人工異花授粉結(jié)實(shí)率和種子質(zhì)量顯著高于人工自花授粉和自然條件下，且不存在無(wú)融合生殖。（5）開(kāi)花后36 h雌蕊群彎曲分泌粘液時(shí)，與含笑（M. figo）雜交結(jié)實(shí)率最高達(dá)85.7%，為最佳授粉時(shí)期。（6）有效訪(fǎng)花者主要有東方蜜蜂、黑紋食蚜蠅和獨(dú)角仙，訪(fǎng)花頻率易受天氣影響。綜上說(shuō)明，紫花含笑繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和需要傳粉者，存在一定近交衰退，自然條件下結(jié)實(shí)率低，主要受傳粉昆蟲(chóng)和雌雄異熟限制，最佳授粉期的確定能夠提高其雜交成功率。該研究結(jié)果為紫花含笑資源保護(hù)和雜交育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 紫花含笑， 繁育系統(tǒng)， 傳粉生物學(xué)， 雜交育種， 木蘭科

中圖分類(lèi)號(hào)： Q949.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）10132208

傳粉是植物進(jìn)行有性生殖的必經(jīng)階段，一般是指花粉借助一定的載體，經(jīng)過(guò)一定的空間，從雄性結(jié)構(gòu)傳送到柱頭，繼而萌發(fā)的過(guò)程，與植物結(jié)實(shí)密切相關(guān)。傳粉生物學(xué)是研究與傳粉有關(guān)的各項(xiàng)生物學(xué)規(guī)律的一門(mén)學(xué)科，主要包括對(duì)植物開(kāi)花物候、繁育系統(tǒng)、花各部位特征、訪(fǎng)問(wèn)者種類(lèi)及頻率的研究。因此，植物傳粉生物學(xué)的研究是開(kāi)展植物育種的前提，關(guān)系到植物本身的遺傳育種特點(diǎn)、種子生產(chǎn)方法和栽培管理技術(shù)等重要內(nèi)容，更是植物資源保護(hù)和雜交育種的理論基礎(chǔ)（羅曉瑩等，2011）。但迄今為止，僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)木蘭科瀕危植物傳粉生物學(xué)進(jìn)行了研究，如王潔（2012）揭示了凹葉厚樸雌雄異熟和異位、花粉受精前障礙是導(dǎo)致其結(jié)實(shí)率低的主要原因；孫燕（2015）和賴(lài)家業(yè)等（2007）研究表明光葉木蘭和單性木蘭瀕危原因是受傳粉昆蟲(chóng)限制，花粉生活力低且柱頭可授性時(shí)間短。

紫花含笑（Michelia crassipes）為木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Michelia）常綠灌木或小喬木。零星分布于廣東北部、湖南南部、廣西東北部以及江西，自然資源稀缺（劉玉壺，2004）。因其花色艷麗、花香濃郁，具有較高的觀(guān)賞價(jià)值，所以多次被用來(lái)作為木蘭科雜交育種的優(yōu)良親本（龔洵等，2003；李穎婕等，2013；邵文豪等2015，2015，2016）。然而，紫花含笑在自然條件下結(jié)實(shí)率低，種子質(zhì)量差，嚴(yán)重制約了種群繁衍。目前，關(guān)于紫花含笑的研究主要集中在形態(tài)特征、生理特性（方小平等，2010）、遺傳背景（溫強(qiáng)，2014）和雜交育種（龔洵等，2001；王亞玲等，2003）等方面，但未有從傳粉生物學(xué)角度結(jié)合其對(duì)結(jié)實(shí)率和雜交育種的影響進(jìn)行探討。因此，紫花含笑傳粉生物學(xué)特征是否與自然結(jié)實(shí)率低有密切關(guān)系，最佳授粉期確定是否能提高雜交成功率均值得深入研究。本研究以紫花含笑為對(duì)象開(kāi)展傳粉生物學(xué)研究，揭示紫花含笑自然條件下結(jié)實(shí)率低的原因和判斷最佳雜交時(shí)期，為其資源保護(hù)和雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

在湖南省林業(yè)廳林場(chǎng)（113°2′45.89″ E，28°6′56.32″ N， 112 m），選擇8年生半自然狀態(tài)的、長(zhǎng)勢(shì)良好的紫花含笑，大量片植于山頂和零星散植山坡的東南面。該地位于長(zhǎng)沙市南郊，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫16.8 ℃，年平均降雨量1 422.4 mm，酸性土壤。林場(chǎng)面積達(dá)13.3 hm2，四周保留原有的香樟自然林帶，植被290余種，主要伴生樹(shù)種有樟科、木蘭科、山茶科、薔薇科、杜鵑科、殼斗科、金縷梅科、竹類(lèi)等。

1.2 方法

1.2.1開(kāi)花動(dòng)態(tài)的觀(guān)察在2015—2016年每年的4—5月，開(kāi)花前隨機(jī)標(biāo)記大小相似的植株20株，依據(jù)Dafni（1992）的方法記錄開(kāi)花過(guò)程；盛花期隨機(jī)標(biāo)記20朵花蕾，觀(guān)察并記錄開(kāi)花動(dòng)態(tài)，計(jì)算單花花期。

1.2.2 柱頭可授性和花粉活力檢測(cè)參考吉利等（2011）對(duì)紫花含笑的花粉萌發(fā)研究方法，采用蔗糖150 g·L1+300 mg·L1 HBO3+300 mg·L1 CaCl2培養(yǎng)基，將不同開(kāi)花狀態(tài)的花粉置于25 ℃培養(yǎng)8 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，各取5個(gè)視野在Nikon YS100光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

采用聯(lián)苯胺—過(guò)氧化氫法對(duì)五種狀態(tài)下花朵的柱頭可授性進(jìn)行測(cè)定，以產(chǎn)生氣泡的數(shù)量、速度和被染色的深淺來(lái)判斷柱頭的活性。

1.2.3 繁育系統(tǒng)測(cè)定

1.2.3.1 異交指數(shù)（Outcrossing index， OCI）的估算盛花期隨機(jī)選擇21朵花，按照Dafni的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量花部特征（包括花朵直徑，雌雄蕊成熟時(shí)間間隔，柱頭與花藥的空間間隔）。

1.2.3.2 花粉胚珠比（Pollenovule ration， P/O）的估算隨機(jī)選取9朵未散粉花朵，將雄蕊取下分別裝于潔凈的小瓶中，待花粉管全部裂開(kāi)加入10 mL蒸餾水，磁力攪拌器下振蕩5 min制成花粉懸浮液，取1 μL滴于載玻片上，在Nikon YS100光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)全部花粉數(shù)，每一處理重復(fù)5次求得平均值。同時(shí)將子房壁用解剖刀切開(kāi)，在光學(xué)顯微鏡下先統(tǒng)計(jì)每個(gè)子房胚珠數(shù)，再計(jì)算單朵花胚珠數(shù)平均值，最后計(jì)算P/O。

1.2.3.3 人工授粉實(shí)驗(yàn)（1）在2015—2016年盛花期，選取花蕾狀態(tài)的紫花含笑進(jìn)行套袋，人工授粉。處理方式：①不去雄，不套袋，檢測(cè)自然條件下是否結(jié)實(shí)；②去雄，套袋，檢測(cè)是否存在無(wú)融合生殖；③不去雄，套袋，檢測(cè)是否能自動(dòng)自花授粉；④去雄，套袋，人工自花授粉；⑤去雄，套袋，人工異花授粉。（2）以紫花含笑為母本，含笑為父本，選取五個(gè)開(kāi)花狀態(tài)下紫花含笑為母本，分別與含笑進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。以上每處理21朵花，3個(gè)重復(fù)。每隔10 d觀(guān)察1次，果實(shí)成熟后統(tǒng)計(jì)座果率、結(jié)籽率和千粒重三項(xiàng)指標(biāo)。座果率=果實(shí)總數(shù)/各處理個(gè)數(shù)；結(jié)籽率=果實(shí)中種子數(shù)/胚珠總數(shù)。

1.2.4 訪(fǎng)花昆蟲(chóng)行為和訪(fǎng)花頻率的觀(guān)測(cè)在紫花含笑盛花期隨機(jī)選取21株植株，每天從8：00—18：00，每小時(shí)觀(guān)測(cè)訪(fǎng)花者種類(lèi)、停留時(shí)間和訪(fǎng)花行為。收集訪(fǎng)花昆蟲(chóng)帶回實(shí)驗(yàn)室制成標(biāo)本鑒定，并同時(shí)記錄天氣情況。統(tǒng)計(jì)各訪(fǎng)花者單位時(shí)間內(nèi)訪(fǎng)花次數(shù)，分析一天中不同昆蟲(chóng)的訪(fǎng)花規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖表繪制，用SPSS 19.0軟件對(duì)花粉活力、坐果率、結(jié)籽率及千粒重進(jìn)行單因素方差（Oneway ANOVA）分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1 開(kāi)花動(dòng)態(tài)

紫花含笑種群花期在4—5月，持續(xù)時(shí)間為50 d左右。始花期在4月初，在4月下旬達(dá)到盛花期，5月下旬為謝花期（表1）。從花期降雨頻率觀(guān)測(cè)結(jié)果來(lái)看，紫花含笑花期內(nèi)降雨頻率較高，達(dá)46.2%。

紫花含笑單花花期4～5 d，開(kāi)花前花蕾被苞片包裹（A）；苞片開(kāi)裂，露出紫色的花被片，雄蕊緊靠柱頭（B）；36 h后，花被片逐漸打開(kāi)，雄蕊離開(kāi)柱頭，雌蕊群彎曲成一定角度，并分泌粘液（C）；48～60 h后花被片張開(kāi)，雄蕊群開(kāi)始散粉，雌蕊群逐漸收攏（D）；4～5 d后花被片水平張開(kāi)甚至脫落，雄蕊枯萎脫落，雌蕊群靠近柱頭，柱頭授粉成功后呈褐色（E）。

2.2 花粉活力與柱頭可授性

紫花含笑為雌蕊先熟，各階段的花粉生活力與柱頭可授性具有顯著差異（表2）。開(kāi)花初期雌雄蕊的活性極低，開(kāi)花后36 h左右柱頭活性達(dá)到最高，處于最佳授粉期（狀態(tài)三）。開(kāi)花后第48～60 h（狀態(tài)四），雄蕊開(kāi)始散粉，花粉活力達(dá)到最高，柱頭活性逐漸下降。開(kāi)花第4～5天后（狀態(tài)五），花粉和柱頭活力均較低。

2.3 繁育系統(tǒng)

2.3.1異交指數(shù)（OCI）紫花含笑的花朵直徑為（28.5 ± 2.0） mm，N=21，花為兩性花，雌蕊先成熟，雄蕊高于雌蕊，花朵螺旋狀著生在枝上。異交指數(shù)OCI=4，根據(jù)Dafin的標(biāo)準(zhǔn)，其繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，異交需要傳粉者。

2.3.2 花粉胚珠比（P/O）紫花含笑單花花粉量較大，為（160 260 ± 246）（N=21），每心皮具有2枚胚珠（圖1：F），胚珠總數(shù)為（60 ± 2）（N=21）枚，平均胚珠比P/O為（2 671±123）（在2 108～195 525之間）。根據(jù)Cruden（1997）的標(biāo)準(zhǔn)，判定其繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性異交。

2.3.3 人工授粉實(shí)驗(yàn)授粉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各處理紫花含笑坐果率存在顯著差異（P=0.000<0.001）。其中人工異交授粉處理的坐果率最高，達(dá)（80.95±1.67）%，人工自花授粉次之。直接套袋自交坐果率低，表明紫花含笑能進(jìn)行少量的自發(fā)傳粉。去雄套袋后無(wú)結(jié)籽，表明不存在無(wú)融合生殖。人工異交種子的千粒重和結(jié)籽率表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果表明紫花含笑繁育系統(tǒng)為部分自交親和，有時(shí)需要傳粉者，人工異花授粉能夠提高結(jié)實(shí)率。

選取不同狀態(tài)下紫花含笑與含笑進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，在狀態(tài)三柱頭活力最高時(shí)進(jìn)行雜交（表5），其坐果率（85.7%）和結(jié)籽率（88.23%）顯著高于其他時(shí)期（P<0.05），為最佳授粉期。

2.4 訪(fǎng)花昆蟲(chóng)及行為觀(guān)測(cè)

根據(jù)引種栽培地觀(guān)測(cè)可知，紫花含笑的傳粉昆蟲(chóng)主要有4種，其中大型的東方蜜蜂（Apis cerana）和黑紋食蚜蠅（Episyrphus balteatus）通過(guò)花朵頂部或花瓣間隙進(jìn)入花朵內(nèi)取食花粉，停留2～3 min后，在群落中飛行，將花粉帶到另一朵花內(nèi)進(jìn)行授粉（圖2：A，B）；甲蟲(chóng)類(lèi)的獨(dú)角仙（Allomyrina dichotoma）進(jìn)入花朵內(nèi)，通過(guò)觸角、口器等攜帶花粉在柱頭上自上而下的授粉，停留時(shí)間長(zhǎng)且多宿住在花朵內(nèi)（圖2：C）；德國(guó)小蠊類(lèi)（Blattlla germanica）主要在花朵內(nèi)活動(dòng)或鄰近的花朵間，通過(guò)身體移動(dòng)帶走花粉，停留時(shí)間在30 min以上，但其最大的危害是啃食花瓣和葉片，傳粉作用差（圖2：D）。

一天中訪(fǎng)花頻率較高主要集中在上午11：00—12：00和下午14：00—15：00，受溫度和光照的影響，訪(fǎng)花頻率出現(xiàn)雙峰值（圖3）。東方蜜蜂和獨(dú)角仙訪(fǎng)問(wèn)頻率較高，黑紋食蚜蠅的訪(fǎng)問(wèn)頻率次之，德國(guó)小蠊類(lèi)傳粉效率最差。

3討論與結(jié)論

3.1 紫花含笑開(kāi)花物候?qū)鞣鄣挠绊?/p>

開(kāi)花物候期是植物生命活動(dòng)中一個(gè)重要的時(shí)期，能夠影響植物的傳粉效率和結(jié)實(shí)率。張愛(ài)勤等（2011）的研究中發(fā)現(xiàn)，因苜?；ㄆ谂c昆蟲(chóng)活動(dòng)不遇，而導(dǎo)致苜蓿種子產(chǎn)量極低。本研究中紫花含笑的花期為4月中旬至5月底，此時(shí)有大量昆蟲(chóng)開(kāi)始活動(dòng)。但紫花含笑的花瓣在雌蕊成熟前未完全打開(kāi)，不利于昆蟲(chóng)進(jìn)入，且有效傳粉昆蟲(chóng)種類(lèi)少，傳粉效率低。此外，劉芬等（2013）認(rèn)為，天氣影響植物傳粉，陰雨天氣降低了昆蟲(chóng)訪(fǎng)花的頻率，從而降低了異交的可能性。紫花含笑花期在春夏季，易出現(xiàn)連續(xù)的雷雨天氣，不利于昆蟲(chóng)傳粉，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低。昆蟲(chóng)的訪(fǎng)問(wèn)頻率和行為決定了其傳粉效率。紫花含笑4種傳粉昆蟲(chóng)中，東方蜜蜂、黑紋食蚜蠅和獨(dú)角仙是有效傳粉者，而德國(guó)小蠊類(lèi)傳粉作用差。 但東

方蜜蜂的訪(fǎng)問(wèn)頻率受溫度和光照影響，且在花間停留時(shí)間短。黑紋食蚜蠅的訪(fǎng)問(wèn)頻率低，獨(dú)角仙雖訪(fǎng)問(wèn)頻率高，但其活動(dòng)范圍小。這與孫燕（2015）對(duì)光葉木蘭的傳粉昆蟲(chóng)研究結(jié)果相同。因此，紫花含笑坐果率低主要外因是受天氣影響和有效傳粉者少，訪(fǎng)問(wèn)頻率低。

3.2 紫花含笑繁育系統(tǒng)特征

植物繁育系統(tǒng)是受內(nèi)部遺傳機(jī)制和外部環(huán)境條

件共同相互作用，在決定植物有性繁殖和遺傳進(jìn)化方向上，起著重要作用。植物繁育系統(tǒng)的檢測(cè)常通過(guò)OCI、P/O值和控制授粉的方法。本研究中紫花含笑OCI為4， 結(jié)合人工授粉實(shí)驗(yàn)表明繁育系統(tǒng)類(lèi)型為部分自交親和，異交需要傳粉者。而根據(jù)P/O值得到紫花含笑為專(zhuān)性異交，結(jié)果與前兩者不完全一致。原因是P/O值的測(cè)定具有簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，但缺乏準(zhǔn)確性，有些自花授粉的植物P/O值顯著高于Cruden的標(biāo)準(zhǔn)或與異花授粉植物P/O值重疊，其較高的P/O值是為了補(bǔ)償雄蕊開(kāi)裂后掉落所影響的雄性功能（吳佩紋等，2016）。同時(shí)較大的花粉量，可以彌補(bǔ)在自然條件下傳粉效率低的弊端，是使其適應(yīng)環(huán)境從而保證生殖成功的有效對(duì)策，李志成等（2015）研究發(fā)現(xiàn)在艾比湖沙拐棗也有這一現(xiàn)象。由此推斷紫花含笑的繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。殷東生等（2016）認(rèn)為判斷有性生殖能力的重要標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)實(shí)率的高低。授粉實(shí)驗(yàn)表明，紫花含笑不存在無(wú)融合生殖。不去雄套袋處理有少量結(jié)實(shí)，說(shuō)明紫花含笑具備自花授粉的能力?；ǘ涞穆菪隣钪绞?，以及雄蕊略高于柱頭，使自花授粉存在可能。雄蕊成熟時(shí)，在重力作用下花粉會(huì)落在柱頭上，加上風(fēng)力影響使得自花授粉更加容易，但由于雌雄蕊成熟時(shí)間存在差異，導(dǎo)致自花授粉結(jié)實(shí)率較低。自然條件下的結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)高于套袋處理，說(shuō)明紫花含笑需要依靠傳粉者完成授粉。自然條件下結(jié)實(shí)率顯著低于人工授粉，說(shuō)明自然條件下紫花含笑結(jié)實(shí)率存在花粉限制，這與對(duì)傳粉昆蟲(chóng)的研究結(jié)果一致。人工異交授粉結(jié)實(shí)率和種子質(zhì)量顯著高于人工自花授粉，表明紫花含笑具有一定的近交衰退。綜上，紫花含笑繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

3.3 紫花含笑傳粉生物學(xué)對(duì)雜交育種的意義

傳粉生物學(xué)的研究，關(guān)系到植物遺傳和進(jìn)化，對(duì)有性繁殖和育種具有重要意義（彭東輝等，2012）。植物繁育系統(tǒng)有多種適應(yīng)方式來(lái)保證異株異花受精，如：雌雄異位、雌雄異熟以及自交不親和等。根據(jù)阮成江和姜國(guó)斌（2006）對(duì)雌雄異位的劃分，紫花含笑屬于柱頭縮入式雌雄異位，即雌雄蕊的成熟存在一定的空間和時(shí)間距離。研究證明這是植物促進(jìn)異交、避免自交的策略，是其長(zhǎng)期進(jìn)化的一種繁殖機(jī)制。因此這是紫花含笑結(jié)實(shí)率低的主要內(nèi)因，但能為紫花含笑的人工雜交育種提供有利的條件。植物的授粉時(shí)間與種子的形成和其質(zhì)量有關(guān)，如Hanson（1961）、Strickler（1996）指出苜蓿授粉時(shí)間與種子形成有關(guān)，單花在開(kāi)放的第2天被授粉，每莢果內(nèi)種子千粒重最大，這可能與柱頭活力有關(guān)。本研究中不同開(kāi)花狀態(tài)下紫花含笑與含笑雜交，在開(kāi)花后2～3 d（狀態(tài)三），坐果率最高在85%以上，且高于王亞玲等的雜交研究結(jié)果（60%），確定為最佳授粉期。這表明最佳授粉期的確定有利于提高雜交育種的成功率，為今后紫花含笑雜交育種提供參考。

綜上所述，有效傳粉者的缺乏和雌雄蕊的空間及時(shí)間異位且存在一定近交衰退共同影響紫花含笑自然結(jié)實(shí)率。其中，雌雄性器官空間分離和成熟時(shí)間的不遇及一定近交衰退是主要內(nèi)因，缺乏有效傳粉者是重要外因。其繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者；在最佳可授期雜交能夠有效提高雜交成功率。在今后的研究中，可以根據(jù)紫花含笑傳粉生物學(xué)的特點(diǎn)開(kāi)展更近一步的雜交育種工作，豐富含笑屬植物種類(lèi)。

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