王騫春

摘要[目的]研究小干松種源遺傳多樣性，為小干松引種、育種工作提供基礎資料。[方法]利用SRAP熒光標記技術對引種的15個小干松種源進行SRAP分析。[結(jié)果]9對熒光標記的SRAP引物共產(chǎn)生1 075個條帶，多態(tài)性位點953個，平均多態(tài)性為88.7%，每對引物擴增條帶75～146條，平均每對引物擴增條帶119條；通過UPGMA軟件對15個種源進行遺傳聚類分析，15個種源的相似系數(shù)在0.761 3～0.876 0，以遺傳相似系數(shù)0.850 0為閾值可將15個種源分為4個群體，同一地理來源的種源有一定的遺傳差異，但大體呈現(xiàn)按地理來源聚類的趨勢。[結(jié)論]15個小干松種源具有較高的基因多態(tài)性，遺傳多樣性豐富，小干松變異類型與地理分布有關。

關鍵詞小干松；種源；SRAP

中圖分類號S188+.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）12-0139-02

Abstract[Objective] To study the gentic diversity of Pinus contorta provenance for laying the foundation for introduction of P. contorta breeding. [Method] Using SRAP fluorescence technique to analyze 15 provenances of P. contorta. [Result]9 SRAP primers for fluorescent labeling produced a total of 1 075 bands， 953 polymorphic loci， the average polymorphism was 88.7%. Each primer amplified bands were from 75 to 146， an average of 119 bands. The similarity coefficients of 15 provenances were 0.761 3-0.876 0 by UPGMA software.Taking the genetic similarity coefficient of 0.850 0 as threshold， 15 provenances were divided into 4 clusters， the provenances with the same geographic origin had some genetic differences， but generally showed a trend of clustering according to geographic origin. [Conclusion]15 provenances of P. contorta had high genetic diversity， abundant genetic diversity， the variation types were related to geographic distribution.

Key wordsPinus contorta；Provenances；SRAP

小干松（Pinus contorta）為松科松屬植物，原產(chǎn)地為北美，具有良好的抗性和適應性 [1]。SRAP標記（SequenceRelated Amplified Polymorphism）是由Li 等[2]在2001年提出的一種基于PCR的分子標記技術。該方法具有高共顯、中產(chǎn)率、多態(tài)性高和重復性好的特點，已被廣泛應用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位、基因分離、品種鑒定等研究中。該研究采用SRAP技術對引進的不同種源小干松進行遺傳多樣性分析，旨在為小干松的引種、育種工作提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為從加拿大引進的15個種源小干松種子（表1）。將其播種于遼寧省清原滿族自治縣國營大孤家林場，繁育家系，每個種源采10 株不同健康單株上當年生新發(fā)針葉，液氮凍存后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1DNA的提取。采用CTAB法（稍加改進）提取小干松基因組DNA [3]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA 的質(zhì)量及完整性，UV1102 紫外分光光度計測定 DNA 濃度，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2

PCR反應。將每個種源的10個家系基因組DNA按相同濃度混合作為模板。熒光標記引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。從64對引物組合（表2）中，選擇多態(tài)性好的9對進行擴增，反應總體積為20 μL，包括：Taq酶0.5 U，Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度0.15 mmol/L，模板DNA含量60 ng，引物0.2 μmol/L。Mg2+、10×PCR Buffer 和 Taq 酶均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。擴增反應在 PTC-200 型 PCR（BIO-RAD）上進行，擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，ABI377測序儀檢測片段大小，生成膠圖。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過GeneScan軟件對膠圖進行分析，有帶的地方替換為1，無帶的地方替換為0，這樣構(gòu)成了0/1數(shù)據(jù)，利用 NTsys 2.10軟件進行 UPGMA聚類分析并繪制樹狀聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1小干松種源遺傳多樣性的SRAP分析

從64對SRAP引物中選取9對擴增產(chǎn)物多態(tài)性好、譜帶清晰的引物進行 PCR 擴增，對15個小干松種源進行SRAP分析，電泳圖譜見〖CM（25〗圖1。這9對引物共擴增出 1〖KG*2〗075個條帶，平均每對引物可以擴增出 119條帶，檢測出多態(tài)性條帶為953 條，平均多態(tài)性為88.7%（表3）。

2.2小干松種源相似性和聚類分析

采用軟件NTSYS 2.10，根據(jù)9對引物產(chǎn)生的全部位點進行遺傳相似系數(shù)的計算，15個種源相似系數(shù)在0.761 3～0.876 0（表4）。利用UPGMA法進行聚類分析得到15個小干松種源的聚類樹形（圖2），以相似系數(shù)0.850 0為閾值，將15個種源分為4個群體：種源C1、C2、C3、C5、C13和C15為第一群體；種源C14為第二群體；種源C4、C6、C7和C10為第三群體；種源C8、C9、C11和C12為第四群體。

3討論與結(jié)論

小干松具有適應性強、生長快的特點，并且抗旱、抗蟲性較強，我國的黑龍江、吉林、湖北等地均進行了引種，并進行了一系列的種源試驗，發(fā)現(xiàn)小干松樹高、胸徑等指標在種源間差異顯著[4-6]，說明不同種源的小干松遺傳變異較高。

該研究用熒光標記SRAP方法分析了從加拿大引進的15個小干松種源的遺傳差異，共得到1 075個條帶，檢測出多態(tài)性條帶為953 條，平均多態(tài)性為88.7%，多態(tài)性較高，說明熒光標記的SRAP適合分析小干松種源的遺傳多樣性。15個種源遺傳距離在0.238 7～0.124 0，相似系數(shù)比較高，可能是由于引種地理位置較近所致。

參考文獻

[1] 宋曉東.抗旱耐寒國外松的選擇[J].遼寧林業(yè)科技，1994（2）：9-13.

[2] LI G，QURIOS C F.Sequencerelated amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet，2001，103（8）：455 - 461.

[3] WANG X D，WANG Z P，ZOU Y P.An improved procedure for the isolation of nuclear DNA from leaves of wild grapevine dried with silicagel[J].Plant Mol Biol Rep，1996，14（4）：369-373.

[4] 黃登民，王生，周顯昌.小干松引種實驗初報[J].延邊大學農(nóng)學學報，2003，25（1）：13-15.

[5] 陸志民，時櫻，吳為群，等.小干松種源實驗與研究[J].吉林林業(yè)科技，1994（5）：41-49.

[6] 謝祖年，章定清，范亦，等.小干松引種與種源試驗[J].林業(yè)科技開發(fā)，2000，14（4）：40-42.