王宇婷 馬莉莉 李曉月 王士霞 畢瑩 倪宏波

摘要[目的]原核表達(dá)牛病毒性腹瀉黏膜病毒（BVDV）E2基因編碼蛋白。[方法]采用PCR方法從BVDV中擴增E2基因片段，與原核表達(dá)載體pET-32a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E2，轉(zhuǎn)化E.coli（Rosetta）感受態(tài)細(xì)胞，重組菌用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)E2蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，經(jīng)Western blot分析鑒定免疫原性。[結(jié)果]重組質(zhì)粒pET-32a-E2經(jīng)PCR及酶切鑒定證明構(gòu)建正確，重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量大小約為58 kDa，純化后E2重組蛋白濃度0.521 mg/mL，Western blot分析表明，其能被BVDV陽性血清識別，具有很好的免疫原性。[結(jié)論]E2蛋白成功表達(dá)，為后續(xù)建立BVDV檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞牛病毒性腹瀉黏膜病毒；E2基因；原核表達(dá)

中圖分類號S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）12-0122-02

Abstract[Objective]To prokaryotic express the bovine viral diarrheamuscosal disease viruses E2 gene encoding protein.[Method]Bovine viral diarrheamuscosal disease viruses E2 gene were amplified by PCR and linked into the pET32a prokaryotic expression vector，prokaryotic expression recombinant plasmid pET32aE2 was constructed，which was then trandformed into E.coli（Rosetta）cells for protein expression.E2 protein of recombinant strains was induced to express by 1 mmol/L IPTG and SDSPAGE electrophoresis，target protein was purified by NiNTA affinity chromatography column and the immunogenicity was identified by Western blot analysis.[Result]The recombinant plasmid pET32aE2 was confirmed by PCR，restriction enzyme.It had highlevel expression in E.coli.SDSPAGE showed that recombinant protein with molecular weight of 58 kDa，with concerntration of 0.521 mg/mL.Western blot showed that recombinant protien can reacts with positive serum，indicating good immunogenicity.[Conclusion]E2 protein is expressed in successfully，which lays foundation for establishing BVDV detection method in future.

Key wordsBovine viral diarrheamucosal disease viruses；E2 gene；Prokaryotic expression

牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙ovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉黏膜病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease viruses，BVDV）引起的急性、接觸性傳染病。BVDV除感染牛外，還可感染豬[1]，也會感染鹿、羊、駱駝、兔及其他動物，其宿主相當(dāng)廣泛。近年來也有人感染BVDV[2]以及從生物制品中分離出BVDV的報道[3]。

BVDV依據(jù)5′端非編碼序列，可分成BVDV基因1型和BVDV基因2型；依據(jù)BVDV在細(xì)胞培養(yǎng)物中能否產(chǎn)生細(xì)胞病變，可分為致細(xì)胞病變型（Cytopathogenic，CP）和非細(xì)胞病變型（Noncytopathogenic，NCP），CP型是1.25 kDa，NCP型是1.23 kDa，包括一個開放閱讀框、5′非翻譯區(qū)和3′非編碼區(qū)。其中C、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白，p7、NS2/3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等為非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。E2蛋白是BVDV的主要保護(hù)性抗原蛋白。該試驗對BVDV E2基因進(jìn)行了克隆，并用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot分析重組E2蛋白的反應(yīng)原性，為BVDV檢測方法的建立提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料和試劑

BVDV-1 NADL株，pET-32a質(zhì)粒、大腸桿菌Rosetta、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BVDV陽性血清由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。RNA提取試劑盒購自北京博凌科為生物有限公司。蛋白純化用的Ni螯合柱購自美國英杰生物技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗和PVDF膜購于北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計及合成。

參照GenBank上BVDV E2基因設(shè)計引物，引物序列為上游F1：5′—ACT GGATCC CACTTGGATTGCAAACCTGAATTCTCG—3′；下游F2： 5′—ATCG AAGCTT CCCTAAGGCCTTCTGTTCTGATAGAC—3′。

上游引物含有BamH Ⅰ位點，下游引物含有HindⅢ位點。引物及測序服務(wù)由北京華大基因公司完成。

1.2.2BVDV E2的原核表達(dá)載體構(gòu)建。

以BVDV-1 NADL株的基因組為模板進(jìn)行E2基因的擴增和測序分析，并將其連接到pET-32a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化E.coli（Rosetta）中并涂布在氯霉素和氨芐青霉素抗性的LB平板上，過夜培養(yǎng)，取單克隆擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒和酶切鑒定，得到pET-32a-E2陽性重組菌。

1.2.3BVDV E2基因在E.coli（Rosetta）中表達(dá)、純化和檢測。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E.coli（Rosetta）中，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，收集菌液沉淀，用PBS反復(fù)懸浮2次，超聲破碎，收集上清液和沉淀。分別對上清液和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測，確定蛋白是在包涵體中表達(dá)。離心后用Ni-NTA親和層析柱按說明書來純化蛋白。

1.2.4Western blot檢測重組菌表達(dá)。

將純化前的蛋白定量，12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%的脫脂乳4 ℃過夜封閉，1∶100倍稀釋一抗37 ℃孵育2 h，1∶5 000倍稀釋二抗37 ℃孵育1 h，用DAB顯色。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因的PCR擴增

用F1/F2 引物擴增E2基因，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約1 122 bp條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-E2用F1/F2引物擴增到1 122 bp條帶（圖2），用雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒pET-32a-E2，用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切片段，同樣經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到5 900 bp和1 122 bp質(zhì)粒片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。

2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，12%SDS-PAGE分析表明，目的蛋白成功表達(dá)并經(jīng)純化后的重組蛋白與目的蛋白條帶一致。重組蛋白pET-32a-E2相對分子質(zhì)量約為58 kDa，與理論分析值相符合（圖4～5）。

2.4Western blot鑒定

重組菌表達(dá)產(chǎn)物通過Western blot進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在58 kDa處有明顯的條帶，與理論分析值相符（圖6）。

3討論與結(jié)論

試驗選擇BVDV E2基因為研究對象，是由于在BVDV的結(jié)構(gòu)基因中E2位于BVDV病毒粒子囊膜表面，能誘導(dǎo)感染動物產(chǎn)生病毒中和抗體并刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答[5]，因此E2作為診斷抗原很有意義。劉昱成等[6]對BVDV-2 E2基因進(jìn)行原核表達(dá)，利用原核表達(dá)的E2蛋白建立的間接ELISA方法。鑒于國內(nèi)BVDV-1型流行較為廣泛，該試驗根據(jù)BVDV-1型的E2基因原核表達(dá)并建立檢測方法。同樣，BVDV會引發(fā)持續(xù)感染。持續(xù)性感染的動物就會充當(dāng)攜帶BVDV的宿主和感染源。持續(xù)性感染BVDV的母畜會抑制胎兒的先天免疫系統(tǒng)，使胎兒在早期妊娠期間產(chǎn)生免疫耐受，給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展帶來很大危害。Saliki等[7]建立的夾心ELISA來檢測持續(xù)感染的牛；鄧宇等[8]用純化的BVDV免疫蛋雞制備出的卵黃抗體作為包被抗體，建立牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法，都在BVD的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了重要的作用。該試驗根據(jù)GenBank的BVDV E2基因序列，設(shè)計特異性引物，擴增出BVDV E2基因，將其克隆到原核表達(dá)載體上，并成功表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA柱純化后得純度較高的E2蛋白（純化后E2蛋白濃度0.521 mg/mL），Western blot分析表明，重組E2蛋白能與BVDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明純化的重組E2蛋白有很好的免疫原性。以純化的E2蛋白為抗原為建立BVDV檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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