范作卿 王娜 朱琳 郭光 鄒德慶

摘要[目的]通過對(duì)桑椹酒發(fā)酵專用酵母的篩選和多酚氧化酶鈍化2項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究，為桑椹酒穩(wěn)定發(fā)酵工藝的建立提供技術(shù)支持。[方法]分別對(duì)桑椹及桑園土壤中的酵母進(jìn)行富集、培養(yǎng)與篩選，考察了pH、溫度對(duì)桑椹多酚氧化酶活性的影響。[結(jié)果] 獲得2株桑椹酒發(fā)酵專用菌株，一株來自桑椹發(fā)酵汁，一株來自桑園土壤；在pH 3.0～7.0時(shí)，多酚氧化酶活性隨pH的增大而升高，在pH為7.0時(shí)相對(duì)活性達(dá)到最大，之后隨pH的增大其活性又逐漸減小。在pH低于5.0的環(huán)境中，酶活性會(huì)低于40%；在溫度為40 ℃時(shí)活性達(dá)到最大， 80 ℃時(shí)活力喪失。[結(jié)論]在pH低于5.0的條件下，將桑椹汁在70 ℃加熱20 min或在80 ℃加熱5 min，即可達(dá)到使桑椹多酚氧化酶的活性鈍化失活的目的。

關(guān)鍵詞桑椹酒；關(guān)鍵技術(shù)；酵母；多酚氧化酶

中圖分類號(hào)S789.5；TS262.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）12-0087-02

Abstract[Objective] Two key techniques of mulberry wine fermentation that bacterial strain selected and polyphenol oxidase inactivated were studied， in order to provide technical support for the establishment of stable fermentation technology of mulberry wine. [Method] The yeast were enriched， cultured and selected from mulberry and mulberry field. The effects of pH and temperature on the activity of polyphenol oxidase were studied. [Result] 2 kinds of mulberry wine fermentation special yeast were obtained. The two yeast were isolated from mulberry juice and mulberry field. The polyphenol oxidase activity increased with the increase of pH from 3.0 to 7.0. And the relative activity reached the maximum at pH 7.0. The activity decreased gradually with the increase of the pH.When pH was less than 5.0， the enzyme activity was less than 40%. The activity reached the maximum at 40 ℃， and will be lost at 80 ℃. [Conclusion] Polyphenol oxidase could be inactivated under the condition of the mulberry juice heated at 70 ℃ for 20 min or 80 ℃ for 5 min in less than pH 5.0. So as to protect the stability of the anthocyanins and polyphenols in the brewing process.

Key wordsMulberry wine；Key technology；Yeast；Polyphenol oxidase

桑椹為桑的成熟果穗，又名桑果、桑棗等，果肉多汁、滋味甘美，是水果中的珍品，甘甜可口、風(fēng)格獨(dú)特[1]，有“中華果王”之美譽(yù)[2]，是國家衛(wèi)生部首批公布的藥食同源的植物品種之一。桑椹含有豐富的有機(jī)酸、多種維生素、微量元素、總黃酮及花青素等，不僅具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有良好的保健功能[3]。桑椹果酒是以新鮮桑椹為主要原料，經(jīng)生物發(fā)酵釀制而成的純天然健康飲品，營養(yǎng)豐富、品味優(yōu)良，較好地保留原桑椹中的有機(jī)酸、各種維生素、含氮物、微量元素、礦質(zhì)元素等天然成分[4]，酒度低、色澤艷美的同時(shí)又具有佳釀特有的風(fēng)味，芳香誘人；還具有調(diào)整人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、控制體內(nèi)膽固醇水平、利尿、激發(fā)肝功能和抗衰老的功效，常飲有益健康，是一種可以和葡萄酒相媲美的保健果酒[5]。目前關(guān)于桑椹酒的發(fā)酵技術(shù)已有相關(guān)報(bào)道[3，6-7]，但有關(guān)桑椹酒發(fā)酵專用酵母的篩選及多酚氧化酶對(duì)發(fā)酵工藝的影響等報(bào)道較少。

筆者對(duì)桑椹酒發(fā)酵專用酵母菌的培養(yǎng)與篩選、桑椹多酚氧化酶的鈍化兩大影響桑椹酒發(fā)酵的關(guān)鍵工藝技術(shù)進(jìn)行了研究，為蠶桑業(yè)的綜合利用以及桑椹的深度開發(fā)提供了一條新的途徑。

1材料與方法

1.1材料

原輔料：桑椹于2016年6月采于山東省蠶業(yè)研究所果桑資源圃；蔗糖為市售1級(jí)。主要試劑：麥芽汁（食品級(jí)）、焦性沒食子酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等，均為分析純。主要儀器：KQ3200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1酵母菌的培養(yǎng)與篩選。

1.2.1.1從桑椹中分離培養(yǎng)。將成熟桑椹破碎，擠壓出汁，分裝于250 mL三角瓶中，塞好棉塞于25 ℃自然發(fā)酵6～8 d，選取風(fēng)味柔和、有果香及淡醇香的自然發(fā)酵汁，經(jīng)適當(dāng)稀釋后在麥芽汁平板上作涂布或劃線，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，選擇具有典型酵母菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分純。

1.2.1.2從土壤中富集培養(yǎng)。在無菌條件下挑取少量土壤樣品接入已滅菌的含4%～7%（V/V）乙醇的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)72 h增菌，然后進(jìn)行梯度稀釋，并涂布于麥芽汁固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，選擇具有典型酵母菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分純。

1.2.1.3酵母菌的篩選。將富集培養(yǎng)得到的酵母菌株進(jìn)行杜氏小管產(chǎn)氣試驗(yàn)，將斜面活化二代的酵母菌接入8 °Brix的麥芽汁中，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 h后，接種于13 °Brix的帶有杜氏小管的麥芽汁培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)48 h，初篩出產(chǎn)氣好的菌株，再接入糖度為20%的桑椹汁中發(fā)酵7 d，選擇產(chǎn)酒精度高、風(fēng)味好的菌株進(jìn)行耐酒精性試驗(yàn)。

1.2.2桑椹多酚氧化酶的鈍化。

1.2.2.1桑椹多酚氧化酶的提取純化。稱取50 g桑椹，加入預(yù)冷的含1%吐溫 80的0.1 mol/L磷酸緩沖液100 mL，打漿，在4 ℃條件下鹽析，收集沉淀物，用超聲波將其溶解于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，平衡過SephadexG-75凝膠柱，再用含有1.0 mol/L NaCl的平衡磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫收集。

1.2.2.2pH對(duì)多酚氧化酶活性的影響。在3.9 mL pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的緩沖溶液中，分別加入1.0 mL 0.02 mol/L焦性沒食子酸溶液和0.1 mL酶液，測定不同pH對(duì)酶活性的影響。

1.2.2.3溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響。在3.9 mL pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，加入1.0 mL 0.02 mol/L焦性沒食子酸溶液和0.1 mL酶液，分別在20、30、40、50、60、70 ℃下反應(yīng)5 min，測定其酶活性。

1.2.2.4多酚氧化酚對(duì)溫度的穩(wěn)定性。在3.9 mL pH 7.0磷酸鹽緩沖液中加入1.0 mL 0.02 mol/L焦性沒食子酸溶液和0.1 mL酶液，分別放在40～70 ℃的水浴中，放置10～60 min后，測定其酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離培養(yǎng)

經(jīng)鏡檢選擇從桑椹中分離培養(yǎng)的28株為純種，從土壤中富集培養(yǎng)的39株為純種后轉(zhuǎn)入麥芽汁固體斜面。

2.1.1杜氏小管產(chǎn)氣篩選。

初篩出產(chǎn)氣好的菌株，結(jié)果見表1?？梢钥闯?，在25 ℃條件下發(fā)酵48 h，產(chǎn)氣能達(dá)到杜氏小管體積一半以上的酵母菌有12株，說明這些菌株可能有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率。

2.1.2產(chǎn)酒精能篩選。篩選出的產(chǎn)酒精度高、風(fēng)味好的菌株，結(jié)果如下：酒精度>9%的菌株3株；7%～9%的菌株3株；5%～7%的菌株4株；<5%的菌株2株。由發(fā)酵桑椹汁產(chǎn)酒情況可見， 12株酵母菌發(fā)酵桑椹汁后，酒精產(chǎn)率大于5%的有10株，將產(chǎn)率小于5%的2株淘汰。

2.1.3耐酒精性能篩選。

將上述得到的10株酵母菌進(jìn)行耐酒精性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，有7株酵母能耐受12%以上的酒精濃度，有4株能夠耐受14%以上的酒精濃度，由于良好的酒精耐受性與較高的產(chǎn)酒精能力有密切關(guān)系，預(yù)示著這4株菌株可能有較高的發(fā)酵度。

2.1.4酵母菌發(fā)酵性能測試。

組織10名具有相關(guān)知識(shí)的人員組成評(píng)價(jià)組，對(duì)菌株編號(hào)8、12、28、32、35、51、70的發(fā)酵酒進(jìn)行感觀評(píng)價(jià)分析，記錄結(jié)果見表3。由表3可以看出，28號(hào)菌株無論是產(chǎn)酒量還是感觀評(píng)價(jià)總分都是最高的，其次是35號(hào)菌株。這2株菌株一株來自桑椹發(fā)酵汁，一株來自桑園土壤。

2.2桑椹多酚氧化酶的鈍化

2.2.1pH對(duì)多酚氧化酶活性的影響。

由圖1可見，在pH3.0～7.0時(shí)，活性隨pH的增大而升高，在pH為7.0時(shí)相對(duì)活性達(dá)到最大，之后又隨pH的增大其活性又逐漸減小。在pH低于5.0的環(huán)境中，酶活性便會(huì)低于40%，由于桑椹汁的pH大多在5.0以下，所以可以采取降低pH的方法來抑制多酚氧化酶活性。

2.2.2溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響。

由圖2可見，桑椹多酚氧化酶活性在低于40 ℃時(shí)下隨溫度的上升酶活性逐漸增大，在溫度為40 ℃時(shí)活性達(dá)到最大，當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，隨溫度的上升酶活性又逐漸減弱，80 ℃時(shí)活力喪失。

2.2.3多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性。

由圖3可以看出，在70 ℃條件下加熱20 min，桑椹多酚氧化酶活力已經(jīng)完全喪失，在60 ℃條件下加熱70 min，其酶活力才完全喪失，而在40 ℃加熱70 min，其酶活力還殘存40%?？梢娚ｉ┒喾友趸冈谳^高的溫度下容易失活。

3結(jié)論

該試驗(yàn)對(duì)桑椹酒發(fā)酵專用酵母進(jìn)行了富集、培養(yǎng)與篩選，結(jié)果表明，第28號(hào)菌株無論是產(chǎn)酒量還是感觀評(píng)價(jià)總分都是最高的，其次是第35號(hào)菌株。這2株菌株一株來自桑椹發(fā)酵汁，一株來自桑園土壤。

該試驗(yàn)通過高溫鈍化多酚氧化酶的方式對(duì)桑椹汁中的多酚氧化酶進(jìn)行鈍化失活，從而達(dá)到控制酒液中黑色素渾濁沉淀的目的，以解決桑椹酒發(fā)酵過程的關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明，在pH低于5.0的條件下，將桑椹汁在70 ℃加熱20 min或在80 ℃加熱5 min，從而使桑葉多酚氧化酶的活性鈍化，以達(dá)到保護(hù)桑椹中總花色苷、多酚類物質(zhì)在釀制過程中的穩(wěn)定性的目的。

參考文獻(xiàn)

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