吳建飛 張金龍 田迪 朱金梅 張溢峰 白先放

摘要[目的]分離篩選得到抗水稻細(xì)菌性條斑病芽孢桿菌菌株，并進(jìn)行鑒定，最后優(yōu)化其產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件。[方法]采用牛津杯法測(cè)定菌株拮抗能力，通過單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出3個(gè)顯著影響因子，最后利用響應(yīng)面法確定顯著因子的最佳組合濃度。[結(jié)果]菌株JF48對(duì)細(xì)菌性條斑病菌的抑菌圈直徑達(dá)（37±3） mm，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件為玉米粉14.69 g/L，豆粕粉 9.54 g/L，CaCl2 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，MgSO4 1.00 g/L，裝液量50/250 mL，轉(zhuǎn)速為 200 r/min，初始 pH 7.5，溫度 38 ℃，接種量1.0%，最高芽孢產(chǎn)量為3.6×109 cfu/mL，與優(yōu)化前相比提高了105倍。[結(jié)論]菌株JF48對(duì)細(xì)菌性條斑病具有很強(qiáng)抗性，響應(yīng)面法有效提高了其芽孢產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞解淀粉芽孢桿菌；細(xì)菌性條斑??；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)S435.111.4+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）16-0003-06

Study on Biocontrol of Bacterial Leaf Streak with Antagonistic Bacillus

WU Jianfei， ZHANG Jinlong， TIAN Di， BAI Xianfang* et al

（College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004）

Abstract[Objective] The aim was to screen a Bacillus strain with antagonistic ability to bacterial leaf streak and identify， and optimize the fermentation condition to enhance the spore production.[Method] We used Oxford cup method to determine the antagonistic ability； 16S rDNA sequence analysis was used to identify the strain； single factor and response surface tests to optimize sporulation conditions. [Result] The JF48 strain belonged to Bacillus amyloliquefaciens， and the diameter of the inhibition zone reached （37±3）mm； the optimal spore culture conditions of Bacillus amyloliquefaciens JF48 were as followsed： corn flour 14.69 g/L， soybean meal 9.54 g/L， CaCl2 2.00 g/L， NaCl 5.00 g/L， MgSO4 1.00 g/L， liquid volume 50 mL/250 mL， rotation 200 r/min， initial pH 7.5， temperature 38 ℃， inoculation 1.0%. Under this fermentation condition， the spore production of JF48 strain reached 3.6×109 cfu/mL， which was 105 times that of optimizing before.[Conclusion] The strain JF48 has a strong antagonistic ability to bacterial leaf streak and response surface method effectively improves its spore production.

Key wordsBacillus amyloliquefaciens；Bacterial leaf streak；Response surface methodology

基金項(xiàng)目2017年度廣西高等教育創(chuàng)優(yōu)計(jì)劃教學(xué)相關(guān)項(xiàng)目——優(yōu)勢(shì)特色專業(yè)項(xiàng)目（優(yōu)質(zhì)本科專業(yè)）。

作者簡(jiǎn)介吳建飛（1990—），男，湖南株洲人，碩士，從事微生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物技術(shù)研究。

收稿日期2017-04-19

水稻細(xì)菌性條斑?。˙acterial Leaf Streak，BLS），簡(jiǎn)稱細(xì)條病，是由稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc）引起的一種水稻病害。細(xì)條病的發(fā)生具有流行性、暴發(fā)性和毀滅性等特點(diǎn)[1-2]，已經(jīng)成為世界水稻種植區(qū)的主要病害之一，嚴(yán)重威脅到水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[3]。目前，防治水稻細(xì)菌性條斑病的主要藥物是噻唑類殺菌劑[4]?；瘜W(xué)藥劑在防治植物病蟲害的同時(shí)也殺死了許多無害甚至有益的生物，同時(shí)也提高了植物病原菌的抗藥性，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞。而以發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)為宗旨的生物防治，將會(huì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮越來越重要的作用，甚至可能替代化學(xué)藥劑成為一個(gè)綠色安全的選擇[5]。

解淀粉芽孢桿菌物種豐富，廣泛分布在土壤和植物表面。近年隨著解淀粉芽孢桿菌具有抑制多種植物病原菌能力的發(fā)現(xiàn)，成為了具有微生物農(nóng)藥發(fā)展?jié)摿Φ奈⑸锓N類。筆者篩選分離得到的解淀粉芽孢桿菌JF48對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌具有明顯的抗性，提高了其芽孢產(chǎn)量，為解淀粉芽孢桿菌JF48應(yīng)用于生物防治方面提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

拮抗菌株自土壤樣品中分離純化得到；水稻細(xì)菌性條斑病菌由廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院何勇強(qiáng)教授提供。

1.1.2培養(yǎng)基。

NA培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，牛肉膏1 g/L，細(xì)菌學(xué)蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，蔗糖10 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：最適碳源5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0。

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：氯化鈉5 g/L，最適碳源5 g/L，最適氮源10 g/L，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的分離與純化。

稱取10 g樣品土壤加入到裝有少許玻璃珠和90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，在200 r/min、30 ℃條件下振蕩搖勻30 min，制成1×10-1土壤懸浮液。吸取1 mL 1×10-1懸浮液至EP管中，80 ℃水浴15 min，按梯度依次稀釋至1×10-7～1×10-2，吸取合適稀釋梯度的稀釋液1 mL于平板上均勻涂布，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后進(jìn)行觀察，選取形態(tài)各異的單菌落。

1.2.2拮抗菌株的篩選和抑菌能力的測(cè)定。

初篩完成后，采用抑菌圈法對(duì)初篩得到菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。測(cè)定時(shí)先在培養(yǎng)皿底部鋪1層5 mL左右的水瓊脂，以保證培養(yǎng)皿底部平整，冷卻后在培養(yǎng)皿中間放置牛津杯，將完全融化的NA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，每100 mL培養(yǎng)基中加入0.2 mL指示菌液（1×109 cfu/mL），搖勻，倒入平皿中，每皿15 mL左右，冷卻后取出牛津杯，每孔加入0.1 mL待篩選菌液（1×109 cfu/mL），以加NA液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，靜置30 min，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察抑菌效果，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.3拮抗菌株的鑒定。

提取拮抗菌株的基因組DNA，采用通用引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，純化后送至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)定的序列提交到 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST 程序與已有的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，下載同源性較高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4芽孢檢測(cè)及芽孢轉(zhuǎn)化率檢測(cè)方法。

采用稀釋涂布法對(duì)芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)[6]，通過顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)，計(jì)算芽孢轉(zhuǎn)化率。

1.2.5拮抗菌株產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化。

1.2.5.1單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)內(nèi)容包括碳源種類（葡萄糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉、麥芽糖、糊精）及其濃度（6.00、10.00、14.00、18.00、22.00 g/L）、氮源種類（胰蛋白胨、豆粕粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）及其濃度（6.00、8.00、10.00、12.00、14.00 g/L）、無機(jī)鹽（NaCl 5.00 g/L、 CaCl2 2.00 g/L、MgSO4 1.00 g/L、MnSO4 1.00 g/L、K2HPO4 0.10 g/L、 KH2PO4 0.10 g/L）、裝液量[50/250（mL）、75/250（mL）、100/250（mL）、125/250（mL）、150/250（mL）]、轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培養(yǎng)溫度（29、31、33、35、37、39 ℃）、接種量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）。

1.2.5.2Plackett-Burman 試驗(yàn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以芽孢產(chǎn)量（cfu/mL）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)6個(gè)因子的Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)篩選顯著因子，每個(gè)因子取高（+1）、低（-1）2個(gè)水平，確定各個(gè)因子對(duì)芽孢產(chǎn)量影響的大小。試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.5.3最陡爬坡試驗(yàn)。

根據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果篩選出3個(gè)顯著影響因子及爬坡方向，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)確定爬坡步長(zhǎng)。其他因素取單因素最佳水平，通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近芽孢產(chǎn)量最大值區(qū)域。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

1.2.5.4Box-Behnken 試驗(yàn)。

以最陡爬坡試驗(yàn)中最優(yōu)組合為中心點(diǎn)，使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken 試驗(yàn)，各因素水平設(shè)置見表3。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株的分離與篩選

從土壤中分離得到的菌株JF48對(duì)細(xì)菌性條斑病的抑制能力最強(qiáng)，其抑菌圈直徑達(dá)（37±3）mm（圖1）。測(cè)定JF48菌株最初在LB培養(yǎng)基中芽孢產(chǎn)量為3.4×107 cfu/mL。

2.2拮抗菌株的鑒定

拮抗菌株16S rDNA擴(kuò)增片段檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，構(gòu)建JF48菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

測(cè)序所得序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株JF48與解淀粉芽孢桿菌同源性高達(dá)99%，系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株JF48與解淀粉芽孢桿菌處于同一分支。因此，鑒定JF48菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1碳源種類及濃度的優(yōu)化。

由圖4可知，碳源種類對(duì)菌株JF48芽孢產(chǎn)量的影響非常顯著，當(dāng)以玉米粉為碳源時(shí)芽孢產(chǎn)量達(dá)0.95×108 cfu/mL，其芽孢轉(zhuǎn)化率也最高。

由圖5可知，玉米粉濃度為1.4%時(shí)芽孢數(shù)量和轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，芽孢產(chǎn)量達(dá)1.88×108 cfu/mL。此后，隨著玉米粉濃度的繼續(xù)增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過剩，不利于芽孢的形成，芽孢產(chǎn)量減少。

2.3.2氮源種類及濃度的優(yōu)化。

由圖6可知，不同氮源對(duì)菌體總量及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響有較大差異，以豆粕粉為氮源時(shí)芽孢量達(dá)5.87×108 cfu/mL，芽孢轉(zhuǎn)化率達(dá)80%。

由圖7可知，氮源濃度對(duì)菌體總量影響較大。在豆粕粉濃度為1.0%時(shí)芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大值。

2.3.3無機(jī)鹽種類的優(yōu)化。

由圖8可知，與對(duì)照組相比CaCl2、MgSO4能有效提高JF48菌株的芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。故選擇向JF48培養(yǎng)基中加入CaCl2、MgSO4。

2.3.4裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖9可知，裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率都有較大影響。裝液量在50 mL時(shí)芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率均最高，芽孢產(chǎn)量為1.46×109 cfu/mL。

2.3.5搖床轉(zhuǎn)速對(duì)芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖10可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，芽孢轉(zhuǎn)化率一直在提高，然而芽孢總數(shù)卻先增后減，并在200 r/min時(shí)達(dá)到最大值。

2.3.6初始pH對(duì)芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖11可知，芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都在初始pH 7.5時(shí)達(dá)到最大值，芽孢量達(dá)1.48×109 cfu/mL。

2.3.7溫度對(duì)芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖12可知，隨著溫度的升高，芽孢轉(zhuǎn)化率變化不大，芽孢產(chǎn)量先增后減，并在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值（3.03×109 cfu/mL）。

2.3.8接種量對(duì)芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖13可知，接種量在0.5%～2.0%時(shí)對(duì)芽孢產(chǎn)量影響很小，并在1.0%時(shí)達(dá)到最大值（3.06×109 cfu/mL）。

2.4Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表 4。方差分析表明，模型P=0.003 5，模型顯著。A（玉米粉）、B（豆粕粉）、F（溫度）3個(gè)因素影響顯著。由P值可知，因素影響重要性大小為F（溫度）>B（豆粕粉）>A（玉米粉），選取這3個(gè)顯著影響因素進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.5最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果可以得出，A（玉米粉）、B（豆粕粉）、F（溫度）3個(gè)因素都為正效應(yīng)，以芽孢產(chǎn)量的梯度方向作為爬坡方向，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

2.6響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果由最陡爬坡試驗(yàn)可知，在第3組試驗(yàn)芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大值，此時(shí)因素水平設(shè)置為A（玉米粉）15 g/L、B（豆粕粉）10 g/L、F（溫度）38 ℃。以該試驗(yàn)組合為試驗(yàn)中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)與分析（表6）。將試驗(yàn)結(jié)果輸入設(shè)計(jì)表格，運(yùn)行Design-Expert 8.0.6，對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析。

試驗(yàn)所得模型回歸擬合度P<0.000 1，說明該模型回歸顯著性好，芽孢產(chǎn)量與試驗(yàn)因素之間存在顯著的回歸關(guān)系。失擬值P（0.368）>0.05，模型的失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)誤差小。該模型的決定系數(shù)R2=0.991 9，校正決定系數(shù)R2=0.981 4，表明該回歸方程求得的芽孢產(chǎn)量預(yù)測(cè)值的可信度為98.14%。

運(yùn)用 Design-Expert 8.0.6得到3個(gè)顯著影響因子兩兩相互作用的響應(yīng)面三維圖及等高線圖。響應(yīng)面曲線圖凸起，則表明有與最大響應(yīng)值相對(duì)應(yīng)的最適變量組合。等高線的形狀則可以形象地反映出因素間交互作用的強(qiáng)弱。如果等高線為橢圓形，表明2個(gè)因素的交互作用顯著；若等高線近似圓形，則說明2個(gè)因素的交互作用不顯著。

由圖14可知，當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著玉米粉和豆粕粉濃度的增加，芽孢產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯先增加后減少的趨勢(shì)，后期由于碳氮比例過高，碳源過剩反而不利于芽孢的形成；等高線圖呈橢圓形，說明玉米粉和豆粕粉交互作用明顯。

由圖15可知，當(dāng)豆粕粉濃度一定時(shí)，隨著玉米粉、豆粕粉的增加，芽孢產(chǎn)量先增后減，后期碳源過剩會(huì)降低芽孢轉(zhuǎn)

化率，溫度過高會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)；等高線圖呈圓形，說明玉米粉和溫度交互作用不顯著。

由圖16可知，當(dāng)玉米粉濃度一定時(shí)，芽孢產(chǎn)量受溫度變化影響較大，受豆粕粉濃度影響較小；芽孢產(chǎn)量隨著兩者的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)；等高線圖呈橢圓形，說明豆粕粉和溫度兩者交互作用明顯。

通過對(duì)響應(yīng)面回歸方程的求導(dǎo)，可以得出該模型的最大值。當(dāng)A=14.69（g/L）、B=9.54（g/L）、C=38.26 ℃時(shí)，預(yù)測(cè)芽孢產(chǎn)量可達(dá)3.687 4×109 cfu/mL。

為了驗(yàn)證該模型的可行性，采用最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證。3次驗(yàn)證試驗(yàn)平均芽孢產(chǎn)量為3.6×109 cfu/mL，與模型預(yù)測(cè)值（3.687 4×109 cfu/mL）接近，說明該模型可以用來預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3結(jié)論

從土壤中篩選得到的抗細(xì)菌性條斑病芽孢桿菌菌株JF48抑菌圈直徑達(dá)（37±3）mm，表明其對(duì)細(xì)條病菌有很強(qiáng)的抗性，經(jīng)16S rDNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得到其最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件：玉米粉14.69 g/L，豆粕粉 9.54 g/L，CaCl2 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，MgSO4 1.00 g/L，裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速為 200 r/min，初始 pH 7.5，溫度 38 ℃，接種量1.0%。最終芽孢產(chǎn)量達(dá)3.6×109 cfu/mL，與優(yōu)化前的3.4×107 cfu/mL相比提高了105倍，與預(yù)測(cè)值（3.687 4×109 cfu/mL）接近，說明該模型可以用來預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

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