汪超 譚韻雅 楊勝偉

摘要[目的]提高油樟內生菌次生代謝產物的積累。[方法] 將不同誘導子（油樟油水濁液、油樟葉水提液和油樟愈傷組織）添加到油樟內生菌（YY26、YG42）的培養(yǎng)體系中，研究其對內生菌生長及其次生代謝產物（1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇）的影響。[結果]從內生菌生長情況來看，油樟愈傷組織對內生菌YY26的生長有明顯抑制作用，而對YG42的生長有促進作用；油樟油水濁液對2種內生菌的生長都有一定的抑制作用；油樟葉水提液對2種內生菌的生長均無顯著影響。從次生代謝產物積累來看，油樟葉水提液對2種內生菌產1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇及α-松油醇具有較強的促進作用，且對1，8-桉葉油素的促進作用最強。當油樟葉水提液濃度為1.00%時，內生菌YY26的1，8-桉葉油素產量最高，比對照組提高了11.80倍；當油樟葉水提液濃度為2.50%時，內生菌YG42中的1，8-桉葉油素產量達到最大值，與對照組相比增加了7.73倍。油樟愈傷組織對總揮發(fā)性物質的促進作用最強，當其濃度為10.00%時，對內生菌YY26總揮發(fā)性物質的促進作用最強，比對照組提高了13.26倍。[結論]該研究在一定程度上提高了油樟內生菌（YY26、YG42）次生代謝產物的積累量，為其今后的工業(yè)化生產奠定了基礎。

關鍵詞油樟；內生菌；1，8-桉葉油素；松油烯-4-醇；α-松油醇

中圖分類號Q942文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）20-0014-04

Abstract[Objective] To improve the accumulation of secondary metabolites of endophytic fungi of Cinnamomum longepaniculatum. [Method] Different inducers（oil， water extract and callus from C. longepaniculatum，were added in the culture system of endophytic fungi（YY26，YG42）of C. longepaniculatum to study their effects on the growth of endophytic fungi and their secondary metabolites（1，8eucalyptol， terpinen4ol， αterpineol）. [Result] As for the growth of endophytic fungi， callus from C. longepaniculatum had obvious inhibitory effects on the growth of YY26，but it had promoting effects on the growth of YG42. Oil from C. longepaniculatum had some inhibiting effects on the growth of YY26 and YG42. Water extracts from C.longepaniculatum had no significant effect on the growth of YY26 and YG42. As for the accumulation of secondary metabolites，water extract from C.longepaniculatum had stronger promoting effects on the yield of 1，8 cineole， terpinen4ol and αterpineol of YY26 and YG42， and it had the strongest promoting effects on the yield of 1，8 cineole.When the concentration of water extract was 1.00%，the yield of 1，8cineole of YY26 was the highest， which was increased than that of control group by 11.80 times. When the concentration of water extract was 2.50%， the yield of 1，8cineole of YG42 was the highest， which was increased than that of control group by 7.73 times.Callus from C.longepaniculatum had the strongest promoting effects on total volatile of secondary metabolites. When the concentration of callus from C.longepaniculatum was 10.00%，it had the strongest promoting effects on total volatile substances of YY26， which was increased than that of control group by 13.26 times. [Conclusion]The accumulation amount of secondary metabolites of YY26 and YG42 in C.longepaniculatum were improved， which can lay a foundation for its industrialized production in the future .

Key wordsCinnamomum longepaniculatum；Endophytic fungi；1，8cineole；Terpinen4ol；αterpineol

植物內生菌在長期的進化過程中，與宿主細胞形成了互利共生的友好關系。目前，有關內生菌生物學作用的研究報道逐年增多，尤其是關于內生菌次級代謝產物積累的研究已成為熱點[1-2]。從植物中直接分離的內生菌，其次級代謝產物的含量目前普遍偏低，工業(yè)化批量生產困難[3-4]。因此，提高植物體內內生菌中的次級代謝產物顯得尤為重要。目前，提高植物體內內生菌中的次級代謝產物的方法很多，其中將生物因子（前體物質）作為誘導子來影響代謝產物的積累，是一種有效且易操作的方法[5-6]。

宿主細胞與內生菌之間存在物質交換，因此宿主植物細胞中可能存在促進內生菌產生次生代謝產物的前體物質。從宿主植物細胞中提取相關的代謝物，并將其作為誘導子添加到內生菌的培養(yǎng)體系中，可能會促進內生菌次級代謝產物的積累。筆者在油樟內生菌（YY26、YG42）培養(yǎng)體系中添加不同誘導子（油樟油、油樟水提液及油樟愈傷組織），研究其對內生菌次生代謝產物的影響，旨在提高內生菌次生代謝產物的產量。

1材料與方法

1.1試驗材料

①3種誘導子：油樟油水濁液、油樟葉水提液及油樟愈傷組織。②2種油樟內生菌：YY26[從油樟葉中分離的真菌，編號為26，鑒定為子囊菌綱酵母目內孢霉科擬內孢霉屬（Endomycopsis Dekker）]和YG42[從油樟根中分離的真菌，編號為42，鑒定為半知菌類從孢梗目從孢?？葡〗z頭孢霉屬（Haplotrichum LK.ex Fr.）][7]，由宜賓學院發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室提供。1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇及α-松油醇均購自北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.2培養(yǎng)基

①平板培養(yǎng)基（1 L）：麥芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，瓊脂20 g，pH 5.0。②發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：麥芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，pH 5.0。

1.33種誘導子的制備

1.3.1油樟油水濁液誘導子的制備。采摘新鮮的油樟葉，洗凈后剪碎，放入燒瓶中，水蒸氣蒸餾4 h。先用乙醚萃取，再用旋蒸儀濃縮。用無水硫酸鈉干燥，得到油樟葉揮發(fā)油。然后配制乳化劑，將吐溫-80和斯盤-80按體積比 7∶3混合均勻，置于60 ℃水浴鍋中充分攪拌。此混合乳化劑的HLB（親水親油平衡值）值為12.0（水包油乳化劑）。最后，將油樟葉揮發(fā)油與乳化劑按體積比1∶5混合，倒入研缽中，沿同一個方向充分研磨（約1 min），再加入水，研磨并過濾，滅菌備用。

1.3.2油樟葉水提液誘導子的制備。將新鮮的油樟葉片洗凈并晾干，取40 g置于打漿機中，添加一定的蒸餾水打磨2 min，過濾后得到水提液，滅菌備用。

1.3.3

油樟愈傷組織誘導子的制備。取培養(yǎng)20 d后新鮮的油樟愈傷組織（培養(yǎng)條件為 B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂，pH 5.8，25 ℃），置于研缽中充分研磨，得到油樟愈傷組織誘導子。

1.4孢子懸液的制備

將YG42、YY26內生菌分別接種于平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)4 d，然后用無菌水洗滌平板，得到孢子菌懸液，并稀釋其濃度至107個/mL。

1.51，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇3種物質混合標樣的制備與檢測

分別稱取1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇各0.5 g，置于容量瓶中，用乙醇將其配制成濃度10 g/L的3種標準溶液?；旌蠘藰拥呐渲?，則用超純水將其稀釋為0.01 mg/L。將細胞發(fā)酵液和混合標樣分別頂空進樣，采用氣相色譜（GC）檢測。

氣相色譜檢測條件如下：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm）毛細管柱，平衡溫度95 ℃，平衡時間20 min；載氣為氮氣，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣尾吹氣25 mL/min，頂空進樣，分流比3.0。柱箱程序如下：90 ℃保持4 min，然后以20 ℃/min增至130 ℃保持5 min，再以 20 ℃/min 增至190 ℃保持1 min，最后20 ℃/min增至240 ℃保持1 min。

1.6生物量的測定將細胞培養(yǎng)物抽濾得到細胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，稱其質量為細胞干重。

1.7誘導子的添加

在2種孢子懸液中分別添加不同濃度的誘導子（油樟油水濁液、油樟葉水提液和油樟愈傷組織），在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵后，取樣并檢測其生物量及次級代謝產物（1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質）的積累量，分析3種誘導子對次生代謝產物積累的影響。由于總揮發(fā)性物質無法用標品定量，因此所有產物均用峰面積表示積累量。

1.8精密度和穩(wěn)定性試驗

取配制的0.01 mg/L混合標樣10 mL置于頂空進樣瓶中，按照“1.5”中方法重復進樣5次，計算1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質的峰面積RSD分別為1.62%、1.83%、1.71%、1.59%；取同一供試品在同一天內重復進樣5次，并連續(xù)進樣3 d，計算1，8-桉葉油素、γ-松油烯、α-松油醇及總揮發(fā)性物質的峰面積RSD分別為1.96%、1.69%、1.38%、1.82%。

1.9回收率試驗

取“1.5”中配制的10 g/L標準溶液，以超純水為溶劑，配制成濃度分別為1.0、0.5、0.1 mg/L的混合標樣，分別取5 mL置于頂空進樣瓶中，再分別加入5 mL已測樣品，按照“1.5”中方法進行測定，計算出1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質的峰面積的回收率分別為101.12%、99.89%、99.47%、100.43%，RSD分別為1.78%、1.92%、1.66%、1.44%。

2結果與分析

2.1樣品中揮發(fā)性成分鑒定結果

發(fā)酵液中揮發(fā)性成分鑒定結果見圖1。從圖1可以看出，1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇的出峰時間分別為2.840、5.157和5.325 min。樣品（圖1B）與標品（圖1A）的出峰時間相同，被認為是與標品相同的物質。

2.2誘導子對內生真菌生物量的影響

由表1可知，油樟愈傷組織對YG42的生物量具有促進作用，且隨著其濃度的增加，促進作用逐漸增強，當其濃度為10.00%時YG42的生物量比對照組增加了23.61%。油樟葉水提液對2種內生菌均無顯著影響；油樟油水濁液誘導子對2種內生菌均有一定的抑制作用，且隨著其濃度的增加，對內生菌的抑制作用逐漸增強。當油樟油水濁液濃度為10.00%時，YY26和YG42的生物量分別為對照組的71.12%和70.53%。油樟愈傷組織對YY26的生物量具有抑制作用，隨著其濃度的增加，抑制作用逐漸增強。當其濃度為10.00%時，YY26的生物量僅為對照組的31.10%。

2.3誘導子對內生真菌1，8-桉葉油素的影響

由表2可知，油樟水提液對2種內生菌的1，8-桉葉油素積累均具有促進作用，其促進作用呈先增加后降低的趨勢，當油樟水提液濃度為1.00%時，YY26的1，8-桉葉油素積累量最高，與對照組相比增加了11.80倍，當油樟水提液濃度為2.50%時，YG42的1，8-桉葉油素積累量最高，與對照組相比增加了7.73倍。油樟油水濁液對2種內生菌的1，8-桉葉油素積累均具有先促進后抑制的作用，當其濃度為0.25%時YY26和YG42的1，8-桉葉油素積累量最高，與對照組相比分別提高1.11和1.29倍。油樟愈傷組織對受試菌體的1，8-桉葉油素積累均呈抑制作用，且隨著濃度的增加其抑制作用逐漸增強，當愈傷組織濃度為10.00%時，2種內生菌的1，8-桉葉油素積累量最低，分別為對照組的45.12%和52.77%。

安徽農業(yè)科學2017年

2.4誘導子對內生真菌松油烯-4-醇的影響

由表3可知，油樟水提液均能促進2種內生菌松油烯-4-醇的產生，當其濃度為1.00%時，2種內生菌的松油烯-4-醇產量均達到最大值，分別為8.32和5.86。油樟愈傷組織能誘導內生菌YY26松油烯-4-醇的產生，而對YG42內生菌的積累松油烯-4-醇幾乎無影響，當其濃度為1.00%時內生菌YY26松油烯-4-醇的積累量達到最大值，為0.38。而油樟油水濁液對2種內生菌的松油烯-4-醇積累均呈抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強。

2.5誘導子對內生真菌α-松油醇的影響

由表4可知，油樟愈傷組織誘導子對內生菌YY26產α-松油醇具有一定的促進作用，隨著其濃度的增加，促進作用呈先強后弱的趨勢，當其濃度為2.50%時內生菌YY26中α-松油醇積累量達到最大值（0.5），而對內生菌YG42中α-松油醇的積累量幾乎無影響。油樟水提液對2種內生菌中α-松油醇的積累量均呈先促進后抑制的作用，當油樟水提液濃度為1.00%時對內生菌YY26中α-松油醇積累量的促進作用最強，此時α-松油醇積累量為3.96；當油樟水提液濃度為0.50%時，對內生菌YG42中α-松油醇積累的促進作用最強，此時α-松油醇積累量為1.30。油樟水濁液對2種內生菌中α-松油醇積累均具有抑制作用，且其濃度越大，抑制作用越強。

2.6誘導子對內生真菌總揮發(fā)性物質的影響

從表5可以看出，3種誘導子對內生菌的總揮發(fā)性物質的影響程度各不相同。油樟愈傷組織對內生菌YY26的總揮發(fā)性物質積累表現(xiàn)出誘導作用，而對內生菌YG42的總揮發(fā)性物質積累無顯著影響，且隨著濃度的增加，其促進作用越強，當濃度為10.00%時其促進作用最強，與對照組相比提高了13.26倍。油樟水提液對內生菌YY26中總揮發(fā)性物質的積累具有先促進后抑制的作用，當其濃度為1.00%時其促進作用最強，與對照組相比提高了0.87倍；對內生菌YG42中總揮發(fā)性物質的積累具有抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用越強。油樟油對2種內生菌的總揮發(fā)性物質積累均具有抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強，與之前研究結果基本一致。

3結論與討論

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導子是促進次生代謝產物產量常用的方法。該試驗結果表明，油樟油誘導子在低濃度時對2種內生菌的1，8-桉葉油素產量均具有誘導作用，而在高濃度下卻對其具有抑制作用，考慮到油樟油中本身就含有大量的1，8-桉葉油素，據此推測可能是外源1.8-桉葉油素對2種內生菌產1，8-桉葉油素的相關基因的表達存在調節(jié)作用。Expósito等[8]研究表明外源紫杉醇誘導子對紫杉醇相關基因的表達存在調控作用。在高濃度時油樟油對2種內生菌的生長具有一定的抑制作用，可能是因為油樟油中本身有輕微的毒性[9-10]；在高濃度下油樟油對2種內生菌中揮發(fā)性物質的積累均有抑制作用，可能是由于油樟油本身具有揮發(fā)性，在充滿菌絲體的培養(yǎng)基中產生渦旋作用，使其揮發(fā)速度比對照組快，也可能是被內生菌轉化為其他物質，具體還有待進一步研究。

油樟水提液對2種內生菌的1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油烯的積累均具有明顯的促進作用，表明油樟水提液中可能含有某些能促進1，8-桉葉油素等生產的物質，這些物質能夠誘導1，8-桉葉油素等物質生物合成相關基因的表達。吳欣[6]在滑桃樹種子提取物對其內生菌Streptomyces sp.WXC 菌株中富倫菌素B產量的影響研究中，證實滑桃樹種子提取物作為誘導物誘導了活性化合物富倫菌素B生物合成基因的表達，進而提高了富倫菌素B的產量，但具體作用機制還需進一步研究。

油樟愈傷組織對油樟內生真菌YY26的生長具有抑制作用，但卻促進了其次生代謝產物的生成，表明在逆境的情況下有利于內生菌產次生代謝產物。對YG42的生長卻具有促進作用，表明油樟愈傷組織中會產生一些物質對YY26的生長有抑制作用，而其中的一些物質又能夠為YG42提供生長的必要因子，促進YG42的生長，但對其次生代謝產物的積累卻無顯著影響，可能是由于營養(yǎng)物質都用于細胞生長，而1，8-桉葉油素等物質的基因缺乏表達。

綜上所述，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分對油樟內生真菌中次生代謝產物積累的影響較大。從油樟水提液與油樟愈傷組織的不同誘導效果來看，1，8-桉葉油素等物質的生物合成受許多因素的影響，油樟水提液中含有細胞組織液及其他油樟內生菌所產物質比油樟愈傷組織中所含物質豐富。因此，在今后的研究中應加強對營養(yǎng)成分的優(yōu)化，還可嘗試多種內生菌共培養(yǎng)的發(fā)酵方式。該研究提高了油樟內生真菌YY26和YG42的次生代謝產物的積累量，為其今后的工業(yè)化生產奠定了基礎。

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