用慧敏 唐君鈺 丁靖葦 鄒於岑 曹暉

摘要[目的]以花生粕作為納豆菌發(fā)酵主要原料，研究花生蛋白納豆菌發(fā)酵工藝的最佳條件。[方法]選擇合適的工藝流程，將納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)作為觀察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]花生蛋白納豆菌發(fā)酵最佳工藝條件為接種量4%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃，種齡18 h，初始pH 7.0。在上述發(fā)酵條件下，可得到較高的納豆激酶活力（271.57 U/mL）和納豆菌活菌數(shù)（36×105 cfu/mL）。[結(jié)論]該試驗(yàn)結(jié)果為花生粕的研究與開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞花生粕；納豆菌；發(fā)酵；納豆激酶

中圖分類號(hào)S-3；TQ920.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）35-0070-05

Abstract[Objective] The optimum fermentation conditions of peanut protein of Bacillus natto were studied with peanut meal as the main raw material for the fermentation of Bacillus natto.[Method] We chose the proper process flow and selected the nattokinase activity and the viable count of Bacillus natto as the fermentation parameters to obtain the optimum conditions of fermentation of peanut protein of Bacillus natto，through the analysis of the single factor experiments and orthogonal experiment.[Result] The optimum fermentation conditions of peanut protein of Bacillus natto were as followed：the inoculum amount was 4%； the fermentation time was 48 h； the fermentation temperature was 37 ℃； the seed age was 18 h； and the initial pH was 7.0.Under the above fermentation conditions，higher activity of nattokinase （271.57 U/mL） and more live bacteria number of Bacillus natto （36×105 cfu/mL） could be obtained.[Conclusion] The results provide reference for research and development of peanut meal.

Key wordsPeanut meal；Bacillus natto；Fermentation；Nattokinase

花生粕是花生經(jīng)高溫榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的花生蛋白，含量高達(dá)40%～55%，且氨基酸種類齊全，具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但因?yàn)楦邷貕赫ブ朴秃?，花生蛋白?yán)重變性，從而使其主要被用作于飼料或肥料，但這2種方式對(duì)花生蛋白的利用率較低，易造成蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)。若能對(duì)這些花生蛋白資源進(jìn)行相關(guān)的研究利用，將極大地提高花生粕的附加值，從而帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

20世紀(jì)初期，日本學(xué)者澤村發(fā)現(xiàn)并分離出了納豆菌[1]。納豆菌可以用來(lái)分解大分子物質(zhì)，如分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等，使發(fā)酵產(chǎn)物容易被機(jī)體所吸收[2] 。此外，在代謝過(guò)程中納豆菌可以產(chǎn)生納豆激酶[3-4]。納豆激酶是一種由納豆芽孢桿菌所產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶。該酶具有很強(qiáng)的纖溶活性，能直接作用于纖維蛋白，也能激活體內(nèi)纖溶酶原，且其具有安全性好、成本低、纖溶活性強(qiáng)、可口服、作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，正作為一個(gè)開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療血栓藥物的研究熱點(diǎn)[5-6]。 而且，納豆激酶具有調(diào)節(jié)血脂和防止動(dòng)脈硬化的作用，對(duì)預(yù)防和治療高血壓也有重要意義。目前，已有較多的研究是關(guān)于利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕來(lái)制備易消化的蛋白質(zhì)飼料[7-9]，但利用其開(kāi)展發(fā)酵花生粕的研究則很少，而納豆芽孢桿菌作為枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，可將其用于進(jìn)行花生粕發(fā)酵的研究。筆者以花生粕作為納豆菌發(fā)酵主要原料，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)作為觀察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料

花生粕，納豆菌（揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院分離保存），尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（西安依科生物技術(shù)有限公司），纖維蛋白原（北京達(dá)博諾科技有限公司），凝血酶（北京達(dá)博諾科技有限公司），瓊脂糖（北京雷利華康商貿(mào)有限公司），蛋白胨、牛肉膏、NaCl、瓊脂、胰蛋白胨、酵母膏、DDPH、無(wú)水乙醇、H2O2（揚(yáng)州市廣陵區(qū)榮達(dá)儀器試劑經(jīng)營(yíng)部）。

1.2方法

1.2.1納豆激酶活力測(cè)定。采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[10-11]。

1.2.1.1瓊脂糖-纖維蛋白平板的制作。

稱取200 mg瓊脂糖溶解于10 mL生理鹽水中，沸水浴中加熱30 min，取出室溫冷卻至50～55 ℃。稱取10 mg纖維蛋白原溶解于10 mL生理鹽水中（37 ℃水浴加熱）。將事先準(zhǔn)備好的200 μL凝血酶（50 U/mL），加入瓊脂糖溶液中混勻，并快速倒入保溫好的纖維蛋白原溶液，混勻后立刻注入滅菌平板，注入時(shí)要避免出現(xiàn)氣泡，室溫靜置冷卻30 min，凝固后即為半透明的平板。用2 mm套管打孔，每個(gè)平板打孔4～6個(gè)。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

用配好的生理鹽水稀釋尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（1 500 U/支），配制成濃度為500.00、400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 U/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。在平板上選定6個(gè)孔，將上述系列濃度尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以10 μL的量點(diǎn)在孔內(nèi)，置于37 ℃恒溫箱中，保溫18 h。測(cè)量每個(gè)溶圈的直徑，計(jì)算溶圈面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品1 mL活性單位為橫坐標(biāo)，以溶圈面積為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.1.3樣品的測(cè)定。

在平板上選定5個(gè)孔，每個(gè)孔依次加入10 μL樣品。置于37 ℃恒溫箱中保溫18 h。測(cè)量溶圈的直徑，計(jì)算溶圈的面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其活力。3點(diǎn)取平均值，樣品活力以“尿激酶活力單位”（UK）表示。

1.2.2納豆菌活菌數(shù)的測(cè)定[12]。

參考GB 4789.2—2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)—菌落總數(shù)測(cè)定方法。將培養(yǎng)基換為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3納豆菌的活化。

在無(wú)菌環(huán)境下，從納豆菌保藏斜面中取1環(huán)菌體劃線于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.2.4納豆菌種子液的制備。

在無(wú)菌環(huán)境下挑取1環(huán)已經(jīng)活化的納豆菌接入經(jīng)高壓滅菌的置于250 mL三角瓶的200 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖勻后在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.5花生蛋白納豆菌發(fā)酵工藝流程。工藝流程見(jiàn)圖1。

1.2.6花生蛋白納豆菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)。

1.2.6.1種齡對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響。

分別取培養(yǎng)12、15、18、21、24 h的納豆菌種子液，在發(fā)酵時(shí)間48 h、起始pH 7.0、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量4%的發(fā)酵條件下進(jìn)行5組發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定適宜的種齡范圍。

1.2.6.2接種量對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響。

按2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種種子液，在發(fā)酵時(shí)間48 h、起始pH 7.0、發(fā)酵溫度37 ℃、種齡18 h的發(fā)酵條件下進(jìn)行5組發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定適宜的接種量范圍。

1.2.6.3初始pH對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響。

將初始pH分別設(shè)定為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發(fā)酵條件下進(jìn)行5組發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定適宜的初始pH。

1.2.6.4發(fā)酵吋間對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響。

在起始pH 7.0、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發(fā)酵條件下，調(diào)整發(fā)酵時(shí)間分別為24、48、72、96、120 h，進(jìn)行5組發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定適宜的發(fā)酵時(shí)間范圍。

1.2.6.5發(fā)酵溫度對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響。

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為30、33、37、41、45 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵時(shí)間48 h、起始pH 7.0、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量4%、種齡18 h的發(fā)酵條件下進(jìn)行5組發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，以納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定適宜的培養(yǎng)溫度范圍。

1.2.7花生蛋白納豆菌發(fā)酵正交試驗(yàn)。

從影響納豆激酶活性和納豆菌活菌數(shù)的一系列因素中篩選接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度3個(gè)關(guān)鍵因素。結(jié)合單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳發(fā)酵條件。

2結(jié)果與分析

2.1瓊脂糖-纖維蛋白原平板法尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

當(dāng)尿激酶活力在50～500 U/mL時(shí)，尿激酶活力與透明圈面積存在一定的線性關(guān)系。 直線回歸方程：y=0.006x+0.421 9，r2=0.960 2，線性相關(guān)性良好（圖2）。因此，可以通過(guò)測(cè)量發(fā)酵產(chǎn)物所形成的透明圈面積間接計(jì)算出納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力值。

2.2種齡對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響

由圖3可知，當(dāng)種齡在12～24 h時(shí)，納豆激酶活力的變化不明顯。當(dāng)種齡在12～18 h時(shí)，隨著種齡的增大，納豆激酶活力呈緩慢上升趨勢(shì)；當(dāng)種齡在18～24 h時(shí)，納豆激酶活力呈緩慢下降趨勢(shì)。種齡為18 h時(shí)納豆激酶活力達(dá)到最高。由圖4可知，當(dāng)種齡在12～24 h時(shí)，納豆菌活菌數(shù)變化較大，當(dāng)種齡為18 h時(shí)，納豆菌活菌數(shù)最大。一般情況下，接種的納豆菌種齡偏小，會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，產(chǎn)物開(kāi)始形成較慢的現(xiàn)象；接種的納豆菌種齡偏大，會(huì)造成生產(chǎn)能力下降，菌體過(guò)早自溶。選擇合適種齡的納豆菌種子液有利于納豆菌的生長(zhǎng)和納豆激酶的形成。因此，選擇種齡為18 h。

2.3接種量對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響

在發(fā)酵工業(yè)中通常采用增加接種量來(lái)縮短微生物的發(fā)酵周期，接種量越大，停滯期越短，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)物提前形成，但若接種量過(guò)多也不利于合成產(chǎn)物。由圖5可知，接種量對(duì)納豆激酶活力的影響較大，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，當(dāng)接種量為4%時(shí)納豆激酶的活力最大，接種量低于4%時(shí)酶活較低，這是因?yàn)榫w生長(zhǎng)緩慢從而影響了正常代謝；接種量為4%～6%時(shí)，隨著接種量的增多納豆激酶的活力呈下降趨勢(shì)。接種量過(guò)低時(shí)菌體的生長(zhǎng)變慢，會(huì)影響正常的代謝；接種量過(guò)高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)納豆菌活菌迅速死亡的現(xiàn)象。由圖6可知，不同的接種量對(duì)納豆菌活菌數(shù)存在差異，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，納豆菌活菌數(shù)較少。

2.4初始pH對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響

由于在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵產(chǎn)物的pH會(huì)發(fā)生變化，所以要選擇適宜的初始pH，最大程度地有利于納豆激酶的形成。由圖7可知，當(dāng)pH為7.0時(shí)最有利于納豆激酶的形成，因此適宜的初始pH是7.0。

由圖8可知，納豆菌生長(zhǎng)的最適初始 pH 在7.0左右。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)初始pH為5.0～7.0時(shí)，納豆菌活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)初始pH大于7.0時(shí)，活菌數(shù)開(kāi)始下降。

2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響

納豆菌的發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。由圖9可知，發(fā)酵時(shí)間在24～72 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)納豆激酶的活力逐漸增強(qiáng)，發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h后納豆激酶的活力開(kāi)始下降。納豆激酶活力在72 h時(shí)達(dá)到最高。由圖10可知，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，納豆菌活菌數(shù)會(huì)有所減少。

2.6發(fā)酵溫度對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵的影響由圖11可知，不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶活力存在一定的影響。在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)納豆激酶的活力較高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)納豆激酶的活力非常低，這可能是由于過(guò)高的溫度抑制了納豆菌的生長(zhǎng)。一般情況下，溫度越高，反應(yīng)速度越快，微生物的生長(zhǎng)和代謝速度會(huì)加快，但同時(shí)由于酶對(duì)溫度的熱敏性較強(qiáng)，溫度越高越容易使其失活，影響其發(fā)酵產(chǎn)量，所以在微生物的生長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)注意控制反應(yīng)溫度，在保證其活性的同時(shí)提高其生長(zhǎng)和代謝速度、增加酶產(chǎn)量。適當(dāng)降低溫度將有利于納豆菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。

由圖12可知，不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆菌的生長(zhǎng)存在一定的影響。在發(fā)酵溫度較低時(shí)，菌體代謝緩慢，不利于其生長(zhǎng)；發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)，菌體在開(kāi)始的短時(shí)間內(nèi)就大量生長(zhǎng)，快速消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，穩(wěn)定期維持時(shí)間較短，很快就會(huì)進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)會(huì)開(kāi)始減少。

2.7花生蛋白納豆菌發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1正交試驗(yàn)因素與水平，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

由表2可知，RC>RB>RA，可見(jiàn)各因素對(duì)納豆激酶活性影響從大到小的順序?yàn)镃、B、A，比較各因素k 值，得到3個(gè)因素的最優(yōu)組合為A2B1C2，即接種量為 4%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為37 ℃。由于所得到最優(yōu)組合已出現(xiàn)在上述正交試驗(yàn)中的9組試驗(yàn)中，并通過(guò)與其他8組試驗(yàn)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)納豆激酶活性最高，實(shí)現(xiàn)正交目的，無(wú)需再進(jìn)行追加試驗(yàn)。

由表2可知，R′C>R′B>R′A，可見(jiàn)各因素對(duì)納豆菌活菌數(shù)影響從大到小的順序?yàn)镃、B、A，比較各因素k′值，得到3個(gè)因素的最優(yōu)組合為A2B1C2，即接種量為 4%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為37 ℃。由于所得最優(yōu)組合已出現(xiàn)在上述正交試驗(yàn)中的9組試驗(yàn)中，并通過(guò)與其他8組試驗(yàn)進(jìn)行比較，可觀察到納豆菌活菌數(shù)達(dá)到最大，實(shí)現(xiàn)正交目的，無(wú)需再進(jìn)行追加試驗(yàn)。

綜合2個(gè)指標(biāo)得出，納豆菌發(fā)酵花生粕最佳工藝條件為接種量4%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃。

對(duì)納豆菌發(fā)酵花生粕正交試驗(yàn)表進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活力影響較大，而發(fā)酵溫度和接種量對(duì)其影響較小。3個(gè)因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量。

對(duì)納豆菌活菌數(shù)的方差分析表明，發(fā)酵溫度對(duì)納豆菌活菌數(shù)具有顯著影響，而接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)其影響較小。3個(gè)因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量。

綜合2個(gè)指標(biāo)得出，納豆菌發(fā)酵花生粕工藝的最佳條件是接種量為 4%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為37 ℃。

3結(jié)論

主要以納豆激酶活性、納豆菌活菌數(shù)為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)花生蛋白納豆菌發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇合適種齡的納豆菌種子液有利于納豆菌的生長(zhǎng)和納豆激酶的形成。試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)選擇種齡為18 h。接種量對(duì)納豆激酶活力和納豆菌活菌數(shù)存在一定的影響，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，接種量過(guò)低時(shí)菌體的生長(zhǎng)變慢，會(huì)影響正常的代謝；接種量過(guò)高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)納豆菌活菌迅速死亡的現(xiàn)象。為保證納豆激酶活力、活菌數(shù)為最佳，應(yīng)選擇初始pH為7.0。納豆菌的發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)納豆激酶活力達(dá)到最高，納豆菌活菌數(shù)達(dá)到最大。適當(dāng)降低溫度將有利于納豆菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。

通過(guò)正交試驗(yàn)得出納豆菌發(fā)酵花生粕對(duì)納豆激酶活性的影響從大到小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量，最優(yōu)組合為接種量4%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃。納豆菌發(fā)酵花生粕對(duì)納豆菌活菌數(shù)的影響從大到小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量，最優(yōu)組合為接種量4%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃。綜合2個(gè)指標(biāo)得出，納豆菌發(fā)酵花生粕工藝的最佳條件為接種量4%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃。

在接種量為 4%、發(fā)酵時(shí)間為48 h、發(fā)酵溫度為37 ℃、種齡為18 h、初始pH為7.0的最佳發(fā)酵條件下，納豆激酶的活力為271.57 U/mL，納豆菌活菌數(shù)為36×105 cfu/mL。

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