秦緒偉 王蕾 刁有祥

摘要：2015年～2016年臨床上從雞場分離到15株綠膿桿菌，進行細菌的鑒定，調(diào)查雞群中綠膿桿菌的血清型，了解雞群發(fā)病情況，雞群中綠膿桿菌主要存在三種血清型，其中G型最多，有11株，占總數(shù)的73.3%，B型次之，有3株，占總數(shù)的20%，C型最少，1株，占總數(shù)的6.7%。分離菌株進行小白鼠的毒力試驗，觀察綠膿桿菌的毒力，不同菌株對小白鼠的毒力不一樣，其中G型最小致死劑量2X107CFU/0.3ml，B型最小致死劑量5X107CFU/0.3ml，C型最小致死劑量10X107CFU/0.3ml。

關(guān)鍵詞：雞；綠膿桿菌；鑒定；毒力

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）04-0006-03

綠膿桿菌病是由綠膿桿菌引起的一種人畜共患病。綠膿桿菌又叫綠膿假單胞菌，屬于假單胞菌科假單胞菌屬。綠膿桿菌是一種條件致病菌，常見的眼觀癥狀是在感染后可見到綠色的濃汁，所以稱為綠膿桿菌。機體抵抗力低的時候容易發(fā)病，特別是集約化養(yǎng)殖的雞場以及鴨場綠膿桿菌的發(fā)病率較高，常常引起急性敗血癥死亡[1]。綠膿桿菌革蘭氏陰性小桿菌，不產(chǎn)生芽孢，只有一根鞭毛，顯微鏡運動活潑。廣泛分布于土壤、水和空氣中，潮濕的污水中常年存在，該菌營養(yǎng)要求比較低，一般的環(huán)境都可以生長，可感染眾多哺乳動物、禽類、爬行類和魚類[2]，一般情況下健康的人和動物不患病，但是在機體抵抗力低下時容易引發(fā)綠膿桿菌病，有時是天氣變化、轉(zhuǎn)群、疫苗免疫等等應(yīng)激因素促進該病的發(fā)生。雛雞容易感染綠膿桿菌[3]，造成嚴重的經(jīng)濟損失，感染后的癥狀主要是發(fā)病急促、病程短、精神沉郁、衰竭、脫水、皮下水腫[4]。綠膿桿菌容易檢測和治療，但是使用抗菌藥物治療后，原來的敏感抗菌藥物容易變成耐藥[5]，疫苗的使用將是以后的研究方向。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

2015年～2016年從發(fā)病養(yǎng)殖場分離到的綠膿桿菌15株

1.2 試驗動物

18～22g小白鼠，購自山東大學實驗動物中心； 7日齡雞，購自濟南章丘某養(yǎng)殖場。

1.3 器材

生物安全柜，蘇凈安泰，型號BSC-1600IIA2；基因擴增儀，杭州博日科技有限公司，型號TC-96/G/H（b）c；顯微鏡，奧林巴斯，型號CX-31；恒溫培養(yǎng)箱，三洋，型號MCO-15AC；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信科技，型號Tiss-24。

微量藥敏片，購自杭州天和生物試劑有限公司；綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、馬丁肉湯粉，購自青島海博試劑公司；細菌微量生化反應(yīng)小管，購自北京路橋試劑公司； B型、C型、G型綠膿菌素陽性定型鑒定血清，購自日本力生株式會社；牛血清，購自濟南勁牛試劑公司；高壓鍋、超聲波清洗機、解剖臺、解剖刀、剪刀、酒精燈、接種環(huán)、試管，實驗室常備物品。

1.3.1細菌分離與鑒定

發(fā)現(xiàn)精神沉郁、衰竭、脫水，眼睛腫、皮下水腫病雞進行檢測，著重檢測綠膿桿菌，無菌條件下取肝臟，接種10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板， 37℃溫箱培養(yǎng)16h，觀察細菌細菌生長情況。疑似綠膿桿菌的菌落再進行細菌革蘭氏染色，觀察細菌形態(tài)，轉(zhuǎn)接綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、綿羊鮮血培養(yǎng)基，記錄細菌狀況和生長特性。

1.4 生化試驗

將分離的疑似綠膿桿菌的細菌全部進行生化試驗。

1.4.1氧化酶試驗

加2滴1%四甲基對苯二胺試劑于濾紙上，用牙簽挑去1個菌落到紙上涂布，若5s內(nèi)由粉色變?yōu)楹谏?，則判為陽性。

1.4.2觸酶試驗

取干凈的載玻片，在上面滴加1%過氧化氫溶液，挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的分離菌，在過氧化氫溶液中混合，若有氣泡則觸酶試驗陽性。

1.4.3硝酸鹽還原試驗

先制備溶液，甲液：甲基萘胺0.6g，5mol/L冰醋酸100ml，稍加熱，脫脂棉過濾，放棕色瓶。乙液：對氨基苯磺酸0.8g，用5mol/L冰醋酸30ml溶解對氨基苯磺酸，定溶至100ml，放帶玻璃瓶塞的玻璃瓶中。

把菌接種在硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，加甲液和乙液各3滴，30s出現(xiàn)紅色則為陽性，若無顏色加少量的鋅，隨后出現(xiàn)紅色則為陰性。

1.4.4脂酶試驗

將菌接種在含維多利亞藍的脂酶中，35℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樗{色，則脂酶試驗陽性，無顏色或者粉色則為陰性。

1.4.5甲基紅試驗

將菌接種在葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h，于5ml培養(yǎng)基中滴加5滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果，培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色為陽性，黃色為陰性。

1.4.6VP試驗

將菌接種葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24h，加入50gL-萘酚0.6ml，輕輕振搖試管，然后加入0.2ml400g/L KOH，輕輕振搖30min，然后靜止觀察結(jié)果，15min后呈現(xiàn)紅色的為陽性，不變顏色的為陰性。

1.4.7硫化氫試驗

將待檢菌接種含硫化物及亞鐵離子的培養(yǎng)基中，35℃孵育18h，若有黑色沉淀出現(xiàn)，判為陽性。

1.4.8明膠液化試驗

將菌接種明膠培養(yǎng)基，35℃孵育24h至7日，每24h取樣放入4℃冰箱2h，觀察有無凝固，若呈現(xiàn)液態(tài)不凝固，判為陽性。

1.4.9吲哚試驗

將菌液接種富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24～48h，加入試劑中，若形成玫瑰吲哚而成紅色，結(jié)果判定為吲哚試驗陽性。

1.4.10糖發(fā)酵試驗

從瓊脂斜面上挑取少量待檢物，接種糖發(fā)酵管培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)2～3日，每日記錄觀察結(jié)果。

1.5 血清型鑒定

分別取血清B型、C型、G型陽性定型血清一滴滴于載玻片，用接種環(huán)挑取少量營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落在血清中混合均勻，3min后觀察血清有無凝集，與何種血清凝集的細菌評定為哪一種型，與B型陽性血清凝集的細菌則判定B型綠膿桿菌，與C型陽性血清凝集的細菌則判定C型綠膿桿菌，與G型陽性血清凝集的細菌則判定G型綠膿桿菌。

1.6 毒力試驗

1.6.1小白鼠毒力試驗

將分離的15株綠膿桿菌接種血清營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16h，將菌液稀釋成1X108CFU/0.3ml，2X108CFU/0.3ml，5X108CFU/0.3ml，分別腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后觀察7d，記錄小鼠死亡情況。

1.6.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力試驗

選取G型和B型中毒力最強的兩株細菌，降低攻毒劑量，摸索小白鼠的最小致死量。將分離的綠膿桿菌G型16004和B型15005、C型15006接種血清營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16h，將菌液稀釋成1X107CFU/0.3ml，2X107CFU/0.3ml，5X107CFU/0.3ml，分別腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后觀察7d，記錄小鼠死亡情況。

1.6.3 綠膿桿菌G型16004、B型15005和C型15006對7日齡雞毒力試驗

選取G型和B型中毒力最強的兩株細菌，降低攻毒劑量，摸索7日齡雞最小致死量。將分離的綠膿桿菌G型16004和B型15005、C型15006接種血清營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16h，將菌液稀釋成1X108CFU/ml，2X108CFU/ml，5X108CFU/ml，分別腹腔注射雞5只，1ml/只，攻毒后觀察7d，記錄雞發(fā)病死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果

2015年～2016年從全國不同地區(qū)的雞養(yǎng)殖場疑似綠膿桿菌的肝臟分離出15株疑似綠膿桿菌的菌株，其中2015年7株，2016年8株。

15株分菌檢測均符合綠膿桿菌的形態(tài)學特征，在營養(yǎng)瓊脂平板上生長，為圓形、光滑、濕潤、扁平的菌落，有單鞭毛，無莢膜、無芽孢，鏡檢革蘭氏染色細菌呈現(xiàn)陰性小桿菌，兩端鈍圓，單個存在，有的成雙排列；麥康凱上生長，呈現(xiàn)灰白色菌落；綿羊鮮血瓊脂平板上，能產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)；在綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基上生長，產(chǎn)生綠色素，菌落為淺綠色。

2.2 生化試驗結(jié)果

分離的細菌氧化酶、觸酶、硝酸鹽、脂酶試驗陽性，吲哚、M.R、VP和硫化氫試驗陰性，水解明膠，發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖，符合綠膿桿菌的生化特性。（具體結(jié)果見表1）

2.3 血清型鑒定結(jié)果

每一個分離的菌株在血清平板純化后，使用玻片凝集法分別與B型、C型、G型陽性定型血清進行凝集試驗，與B型陽性血清凝集的細菌則判定B型綠膿桿菌，與C型陽性血清凝集的細菌則判定C型綠膿桿菌，與G型陽性血清凝集的細菌則判定G型綠膿桿菌，2015年與2016年分離15株的細菌分別屬于3個血清型，其中G型11株，占總數(shù)的73.3%，B型3株，占總數(shù)的20%，C型1株，占總數(shù)的6.7%。（具體結(jié)果見表2）

2.4 毒力實驗結(jié)果

2.4.1小白鼠毒力試驗結(jié)果

15株分離菌，分別進行1X108CFU/0.3ml，2X108CFU/0.3ml，5X108CFU/0.3ml劑量腹腔注射5只，攻毒后觀察7只，其中G型細菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最強的是16004，最低1X108CFU/0.3ml 劑量3天可以致死全部小白鼠，其他編號菌株相對較弱，B型細菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最強的是15005，最低1X108CFU/0.3ml 劑量3天可以致死全部小白鼠，其他編號菌株相對較弱，C型細菌15006， 1X108CFU/0.3ml攻毒組死亡4只，毒力較弱。（具體結(jié)果見表3）

2.4.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力試驗結(jié)果

取綠膿桿菌G型16004和B型15005、C型15006培養(yǎng)液，將菌液稀釋成1X107CFU/0.3ml，2X107CFU/0.3ml，5X107CFU/0.3ml，10X107CFU/0.3ml，分別腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后觀察7d，G型 16004最小致死劑量2X107CFU/0.3ml，B型15005最小致死劑量5X107CFU/0.3ml，C型15006最小致死劑量10X107CFU/0.3ml。（具體結(jié)果見表4）

2.4.3綠膿桿菌G型16004、B型15005和C型15006對7日齡雞毒力試驗結(jié)果

取綠膿桿菌G型16004和B型15005、C型15006培養(yǎng)液，將菌液稀釋成1X108CFU/ml，2X108CFU/ml，5X108CFU/ml，分別腹腔注射5只1ml/只，攻毒后觀察7d，每天觀察記錄雞發(fā)病死亡情況，G型 16004最小致死劑量2X108CFU/ml，B型15005最小致死劑量5X108CFU/ml，C型15006最小致死劑量5X108CFU/ml。（具體結(jié)果見表5）

3 小結(jié)與討論

3.1 綠膿桿菌廣泛存在 江河、湖泊、土壤、空氣中常年可以分離到，多種動物容易感染，不同的動物感染后的癥狀不同，集約化養(yǎng)殖的畜禽群容易感染，可以引發(fā)敗血癥、肺炎、關(guān)節(jié)炎，甚至死亡，給畜牧業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。在人有創(chuàng)傷、燒傷時綠膿桿菌容易感染，造成傷口化膿感染，不容易愈合，是臨床上人常見的條件致病菌。雞養(yǎng)殖場容易感染，主要是雛雞感染，有的雞蛋本身感染，有的是孵化室感染，1日齡注射馬立克疫苗或者7日齡注射油苗時容易一起感染綠膿桿菌，引起死亡，表現(xiàn)為注射疫苗后雞群有的發(fā)病。

3.2 臨床上雞的綠膿桿菌發(fā)病 主要是引起肺炎、包心包肝、關(guān)節(jié)炎和眼炎，各種年齡都容易得，但是綠膿桿菌發(fā)病率不高、死亡不大，養(yǎng)殖場關(guān)注點和懷疑的方向一般不是綠膿桿菌，再就是綠膿桿菌與其他疾病癥狀相似，不進行細菌分離很難確診，容易誤診。打疫苗后有發(fā)病死亡的，懷疑應(yīng)激；有包心包肝的，懷疑大腸桿菌；有眼睛腫的，懷疑雞鼻炎；有關(guān)節(jié)炎癱瘓的，懷疑鏈球菌和滑液囊支原體；有皮下水腫的，懷疑葡萄球菌，確診需要細菌的分離鑒定。

3.3 綠膿桿菌血清型眾多 不同的分類方式也不同，各個血清型毒力也不同，有的有較強的致死性，有的發(fā)病癥狀比較輕。2015年與2016年2年從雞場病死雞中分離到15株綠膿桿菌，其中11株G型，3株B型，1株C型，G型占比例最大，占總數(shù)的73.3%。綠膿桿菌雖然是環(huán)境致病菌，但是致病性較強，毒力強的菌株對小白鼠的最小致死劑量2X107CFU/0.3ml。養(yǎng)殖場發(fā)病后可以使用抗生素治療，但是青霉素、鏈霉素、紅霉素等對綠膿桿菌有天然的耐藥性，一般喹諾酮類藥物對綠膿桿菌敏感，可以使用。

3.4 綠膿桿菌成分比較復雜 有外毒素、胞外酶、菌毛、彈性蛋白酶，都是重要的毒力因子，因此在不同動物感染后出現(xiàn)不同的致病癥狀，與其相關(guān)的毒力因子有關(guān)，綠膿桿菌感染后不同的毒力因子調(diào)節(jié)，造成綠膿桿菌的復雜性。本實驗初步分離了15株綠膿桿菌，進行了血清型的鑒定，對養(yǎng)雞場的綠膿桿菌發(fā)病情況有了初步的了解，有助于后期對雞的綠膿桿菌疫苗的研發(fā)。

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