楊衛(wèi)麗　高新征　鄒園生　姚瑰瑋　黃靜　王勇

摘 要 為了建立適合黎藥膽木的PsbA-trnH-PCR體系來研究不同地理居群膽木遺傳多樣性，本研究以植物基因組試劑盒法提取膽木基因組DNA為模板，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)PsbA-trnH-PCR過程中的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)PsbA-trnH-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。結(jié)果表明，最佳PsbA-trnH-PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Taq酶1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+ 0.75 mmol/L，引物0.15 μmol/L，模板20 ng，10×PCR Buffer（不含Mg2+）2.5 μL；采用該最佳體系對(duì)膽木基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)單向測序獲得了膽木PsbA-trnH部分序列；并建立了穩(wěn)定的PsbA-trnH-PCR體系，為膽木的藥材鑒別及其遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 膽木；PsbA-trnH-PCR；優(yōu)化系統(tǒng)；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The study intended to establish a PsbA-trnH-PCR system and provide technical support to study the genetic diversity of Li Nationality medicine Nauclea officinalis Pierre ex Pitard in different geographical populations. High quality genomic DNA of N. officinalis Pierre ex Pitard was extracted by the plant genome kit method. The main factors in the process of PsbA-trnH-PCR were optimized by single factor and orthogonal design experiments， and PsbA-trnH-PCR products were sequenced. The results showed that the optimal PsbA-trnH-PCR reaction system（25 μL）was Taq DNA polymerase 1.0 U， dNTPs 0.4 mmol/L， Mg2+ 0.75 mmol/L， primers 0.15 μmol/L， template DNA 10 ng， 10×PCR Buffer（free Mg2+）2.5 μL. The genomic DNA of N. officinalis was amplified using the optimal PsbA-trnH-PCR system to obtain the amplification products， which were sequenced to obtain PsbA-trnH partial sequences. The stable PsbA-trnH-PCR system was established， and can be used in the identification and genetic diversity of for the study of N. officinalis.

Key words Nauclea officinalis Pierre ex Pitard； PsbA-trnH-PCR； optimization of system； orthogonal design

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.020

膽木（Nauclea officinalis Pierre ex Pitard）為茜草科烏檀屬植物，入藥部位是其干燥莖枝及皮，味苦、寒，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，我國廣西、廣東和海南民間常用于治療感冒發(fā)熱、肺炎、腸炎、痢疾、濕疹、皮疹和膿瘍等疾病，外用治療癰癤膿腫[1]。膽木也是一味黎族同胞常用植物藥，收載于《黎藥學(xué)概論》[2]。

2009年，生命條形碼聯(lián)盟植物工作組已經(jīng)決定將葉綠體psbA-trnH基因片段作為植物DNA條形碼鑒別的補(bǔ)充條碼[3]，其在種間及種下居群間具有進(jìn)化速率快、變異程度高和區(qū)分物種能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于藥用植物與其近緣種類等較低分類階元的分子鑒定[4-7]，在眾多科屬中具有較高的鑒定效率[8-11]，本課題組于前期研究中也驗(yàn)證了該序列較其他推薦序列在藥用植物膽木中有較好的鑒別效果。查閱文獻(xiàn)可知，目前有關(guān)膽木的研究主要集中在成分[12]以及藥理方面[13]，在種質(zhì)研究方面僅見膽木種苗栽培、組織培養(yǎng)[14]和生藥學(xué)的相關(guān)研究[15]。本研究主要是優(yōu)化和建立了膽木PsbA-trnH-PCR體系，為進(jìn)一步研究膽木種質(zhì)資源遺傳多樣性及膽木藥材鑒別研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集海南不同產(chǎn)地的膽木新鮮葉片，立即用硅膠干燥，用于提取基因組DNA。

1.1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒、dNTPs、Taq酶、Mg2+、DL 2000均為天根產(chǎn)品；西班牙瓊脂糖；β-巰基乙醇為成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GelRed為Biotium公司產(chǎn)品；引物為華大基因合成。

1.1.3 儀器 手提式高壓滅菌器（YX-380D-Ⅰ；華泰）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（SIGMA；1-14）、核酸蛋白測定儀（Eppendorf；Biophotometer-puls）、PCR儀[博日；TC-96/T/H（a）]、電泳儀（北京六一；DYY-6D）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon；4100）。

1.2 方法

1.2.1 膽木基因組DNA 依據(jù)天根植物基因組DNA試劑盒說明書進(jìn)行，具體方法如下：（1）取植物新鮮組織200 mg，使用70%乙醇擦洗表面后，加入液氮充分碾磨。（2）取研磨好的粉末100 mg迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μL 65 ℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中（試驗(yàn)前在預(yù)熱的GP1中加入β-琉基乙醇，使其終濃度為0.1%），迅速顛倒混勻后，將離心管放在65 ℃水浴60 min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣本數(shù)次。（3）加入700 μL氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），充分混勻，12 000 r/min離心5 min。（4）小心地將上一步所得的上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP2，充分混勻。（5）將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱中，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。（6）向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液，將吸附柱放入收集管中。（7）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。（8）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。（9）將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液（漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)試驗(yàn)）。（10）將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μL洗脫緩沖液，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

最終取所得膽木基因組DNA樣品5 μL于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相保存，同時(shí)用核酸蛋白分析儀分別于260 nm和280 nm波長下測定膽木DNA樣品（稀釋50倍）的吸收值，根據(jù)核酸蛋白分析儀測得A260/A280的值來判斷DNA純度，同時(shí)計(jì)算DNA產(chǎn)量。DNA量=A260×稀釋倍數(shù)（即×50）×DNA總體積，μg。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 以提取得到的膽木基因DNA為模板，PsbA-trnH為引物，分別為正向引物5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′及反向引物5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件的正交設(shè)計(jì) 對(duì)影響膽木PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增體系的引物、DNA模板、Taq 酶、dNTPs、Mg2+共5個(gè)因素4個(gè)水平進(jìn)行了考察（表1），按照L16（45）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。10×PCR Buffer統(tǒng)一添加2.5 μL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合按表2用量添加，最后補(bǔ)足ddH2O至25 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.2.4 PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增退火溫度考察 采用單因素方法考察退火溫度，設(shè)置4個(gè)退火溫度分別為45、50、55、60 ℃，其他因素加入量以正交試驗(yàn)確定最佳PsbA-trnH-PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為準(zhǔn)，取5 μL不同溫度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.2.5 膽木基因組DNA的PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增

采用正交試驗(yàn)確定的最佳PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增體系，然后以膽木樣品提取所得基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽木樣品基因組DNA提取結(jié)果

由圖1和表3可知，提取所得的膽木基因組DNA條帶明亮整齊，未見明顯降解。由此可以確定提取的膽木基因組DNA可用于進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增條件的確定

根據(jù)電泳條帶有無、是否清晰明亮、是否存在非特異性擴(kuò)增條帶等作為依據(jù)，確定PsbA-trnH-PCR正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)最佳反應(yīng)體系。由圖2可知，PsbA-trnH-PCR 擴(kuò)增獲得16個(gè)產(chǎn)物，其電泳結(jié)果為：編號(hào)為7、12、14的體系擴(kuò)增結(jié)果不理想，其條帶不明顯或無條帶；編號(hào)為3、4、8、9、10、11、15、16 的體系可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，但其非特異性擴(kuò)增條帶較多；編號(hào)為1、2、5、6、13 的體系擴(kuò)增效果較好，目標(biāo)產(chǎn)物條帶清晰，條帶之間區(qū)分度較好。根據(jù)以上分析，初步確定PsbA-trnH-PCR正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)最佳反應(yīng)體系為編號(hào)5，即：模板DNA 20 ng，引物0.15 μmol/L，Taq酶1.0 U，Mg2+ 0.75 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L，不含Mg2+ 的10×PCR Buffer 2.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至總體積25 μL。

2.3 膽木PsbA-trnH-PCR退火溫度優(yōu)化

考察了45、50、55、60 ℃ 4個(gè)退火溫度對(duì)PsbA-trnH-PCR體系影響，由圖3可知，4個(gè)退火溫度均可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，60 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物較少，效果不理想，因55 ℃擴(kuò)增效果最佳，最終確定PsbA-trnH-PCR退火溫度為55 ℃。

2.4 膽木的PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

根據(jù)最優(yōu)PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增而得的產(chǎn)物經(jīng)測序獲得了PsbA-trnH部分序列，其序列長為287 bp，將該序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行同源檢測，與該數(shù)據(jù)庫中已有膽木PsbA-trnH序列（KP095461.1）進(jìn)行了相似度考察，其相似度達(dá)100%。由此可見，以上確定的PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增體系可準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出膽木PsbA-trnH序列。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后利用膽木PsbA-trnH序列來研究膽木種質(zhì)資源的遺傳多樣性及藥材鑒別奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PsbA-trnH序列在植物中進(jìn)化速率較快，長度適宜，兩端存在保守序列，容易設(shè)計(jì)通用引物，且該片段的引物具有高通用性、高擴(kuò)增成功率等特點(diǎn)，適用于藥用植物及其近緣種類等較低分類階元的分子鑒定[16]。該片段已廣泛地被應(yīng)用于中藥鑒定[17-18]。

目前，關(guān)于黎藥膽木遺傳多樣性研究及PsbA-trnH-PCR體系的相關(guān)影響因素優(yōu)化研究尚未見報(bào)道；因此，適當(dāng)調(diào)整PCR擴(kuò)增的主要參數(shù)，從而保證膽木PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性和可靠性是非常有必要的。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化膽木PsbA-trnH-PCR體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，引物、Mg2+和模板DNA用量Taq酶、dNTPs等均能影響PsbA-trnH-PCR的擴(kuò)增結(jié)果，退火溫度對(duì)PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響較小。其中，Taq酶量、引物和Mg2+濃度三者對(duì)PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響較大，濃度過低會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量減少，濃度過高會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，從而影響后續(xù)測序的準(zhǔn)確性。由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化獲得PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：DNA模板20 ng，引物0.15 μmol/L，Taq酶1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+ 0.75 mmol/L，不含Mg2+的10×PCR Buffer 2.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至總體積為25 μL。

研究結(jié)果表明，可采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化膽木PsbA-trnH-PCR反應(yīng)體系，建立可用于膽木PsbA-trnH-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。利用該最佳反應(yīng)體系已成功擴(kuò)增出膽木的葉綠體部分序列，為今后研究膽木遺傳多樣性及其藥材的鑒定研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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