王燦　李志剛　楊建峰　祖超　鄭維全　鄔華松　魚(yú)歡

摘 要 連作障礙嚴(yán)重威脅中國(guó)胡椒優(yōu)勢(shì)種植區(qū)可持續(xù)發(fā)展，而土壤微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡是連作障礙形成的重要原因之一。為了探明胡椒連作障礙與微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，揭示胡椒連作障礙形成的微生物機(jī)理，本文采用BIOLOG微平板法研究了海南萬(wàn)寧8、18和28 a 3種不同種植年限胡椒園土壤微生物群落功能多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：隨種植年限增加，不同園塊之間穩(wěn)定并達(dá)到最大的平均吸光度值（AWCD）呈明顯下降趨勢(shì)；香農(nóng)指數(shù)、香農(nóng)均勻度等多樣性指數(shù)亦隨種植年限增加呈顯著下降趨勢(shì)，而辛普森優(yōu)勢(shì)度指數(shù)無(wú)顯著性差異；微生物群落結(jié)構(gòu)隨著年限增加出現(xiàn)了2次明顯變化，第1次群落結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在8～18 a階段，主要與酚酸類和多聚物類碳源利用微生物大幅減少有關(guān)，第2次則發(fā)生在18～28 a階段，與碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類相關(guān)利用微生物減少有關(guān)。因此，胡椒連作顯著降低了土壤中微生物多樣性，改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，是胡椒連作障礙形成的重要原因之一。

關(guān)鍵詞 胡椒；連作障礙；BIOLOG；微生物功能多樣性；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Consecutive monoculture induces black pepper（Piper nigrum L.）poor growth， low yield， and serious soil-borne disease， thus becomes one of the most serious threats to the sustainable development of black pepper industry in China. To investigate its microbiological formation mechanisms， the soil samples from black pepper orchards with consecutive monoculture for 8， 18 and 28 years were analyzed by using the BIOLOG EcoPlates method and the responses of soil microbial functional diversity and community structure to different planting ages were demonstrated as follow. It revealed that average well color development（AWCD）obviously decreased with increasing planting duration. The same tendency was also demonstrated in soil microbial diversity indices， such as Shannon index， Shannon evenness index and Simpson index. In addition， the utilization of carbon sources by soil microbes from different planting duration showed significantly different. For example， the utilization rates of phenolic compounds and polymers obviously decreased during the period from the 8 th year to the 18th year and those of carbohydrates， amino acids， carboxylic acids and amines obviously decreased from the 18th year to the 28th year， which indicating the soil microbial community structure experienced two obvious changes with planting duration increasing. Furthermore， the principal component analysis（PCA）also showed the soil samples from the three planting duration were clearly separated from each other. These results suggested that consecutive monoculture of P. nigrum L. could decrease soil microbial activity and diversity， change the soil microbial community.

Key words Black pepper（Piper nigrum L.）； obstacle of consecutive monoculture； BIOLOG analysis； soil microbial functional diversity； community structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.010

胡椒（Piper nigrum L.）是世界古老而著名的香料，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年中國(guó)胡椒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值已超30億元，其種植、生產(chǎn)和加工已成為熱區(qū)100多萬(wàn)農(nóng)民脫貧致富的特色作物產(chǎn)業(yè)[1]。受氣候條件限制，中國(guó)胡椒主要集中在海南東部，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)的90%以上，種植歷史已達(dá)數(shù)十年。由于胡椒為多年生藤本植物，種植需以水泥柱或石柱作為支撐物，因而新墾胡椒園需要大量投入，這也造成種植時(shí)多以單一園塊連續(xù)種植為主。近年來(lái)，隨著種植年限增加，以單一連作為主要模式的海南優(yōu)勢(shì)種植區(qū)逐步出現(xiàn)連作障礙現(xiàn)象，表現(xiàn)為連作園補(bǔ)種幼苗生長(zhǎng)緩慢，成齡植株長(zhǎng)勢(shì)弱，感病率增加，經(jīng)濟(jì)壽命縮短[2]。據(jù)調(diào)查，目前種植區(qū)內(nèi)連續(xù)種植15 a以上的胡椒園約占50%，其中部分胡椒園甚至達(dá)到30～40 a，連作障礙已成為影響中國(guó)胡椒產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要威脅之一[1-2]。

土壤微生物作為驅(qū)動(dòng)土壤物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)的重要因子，參與了土壤酶和植物促生類物質(zhì)生成、有機(jī)（自毒）物質(zhì)分解、土壤固定態(tài)養(yǎng)分溶解等諸多土壤生物化學(xué)過(guò)程[3]。健康土壤中種類豐富且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微生物群落能夠保證各自微生物群落充分發(fā)揮自身功能，同時(shí)抵抗病原菌侵入，從而表現(xiàn)為較高生產(chǎn)力[4-5]；而長(zhǎng)期連作土壤微生物多樣性下降，微生物區(qū)系失衡，參與土壤過(guò)程的微生物類群和數(shù)量減少，抵御病原微生物侵入能力下降，從而造成土壤生產(chǎn)力衰退、植株長(zhǎng)勢(shì)差、病害多發(fā)等連作障礙現(xiàn)象[5-6]。因此，研究連作障礙形成過(guò)程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)構(gòu)建健康穩(wěn)定的土壤微生態(tài)環(huán)境具有重要意義，是連作障礙形成機(jī)制研究中的熱點(diǎn)之一[7]。

前期對(duì)胡椒連作障礙的研究表明[2]，隨著連作時(shí)間增加，土壤微生物總量出現(xiàn)下降，且主要為細(xì)菌和放線菌數(shù)量減少而真菌數(shù)量增加，因而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)由高肥的“細(xì)菌型”向低肥的“真菌型”轉(zhuǎn)化，這與大豆、黃瓜、棉花等其它作物連作研究基本一致[4，6-9]。但群落結(jié)構(gòu)變化過(guò)程中哪些微生物具體類群發(fā)生了變化尚不清楚，這些微生物類群變化與其它土壤物理、化學(xué)等連作障礙因子之間是否存在聯(lián)系還有待進(jìn)一步揭示。BIOLOG微平板法作為一種基于碳源代謝的微生物群落特性分析方法，不僅可以根據(jù)碳源代謝差異對(duì)土壤微生物進(jìn)行分類，而且與磷脂脂肪酸PLFA法、分子生物學(xué)PCR-DGGE法、高通量454測(cè)序法等研究方法相比具有簡(jiǎn)單、快速、成本低等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落功能多樣性評(píng)價(jià)[10-11]。因此，本研究以海南胡椒種植區(qū)不同種植年限胡椒園土壤為研究對(duì)象，采用BIOLOG微平板法研究不同種植年限土壤微生物群落變化，以此明確隨種植年限增加土壤中發(fā)生變化的具體微生物類群及其增減趨勢(shì)，為明確胡椒連作障礙形成微生態(tài)學(xué)機(jī)制和探索防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所胡椒基地，地處海南省萬(wàn)寧市（18°1′N，110°13′E）。該地區(qū)屬典型熱帶季風(fēng)氣候，年均溫25 ℃，日照時(shí)數(shù)1 800～2 300 h，年均降水量2 100 mm，每年5～10月為雨季，當(dāng)年11月到次年4月為旱季，土壤類型為磚紅壤。該基地為研究所《胡椒栽培技術(shù)規(guī)程》（NY/ T 969-2006）標(biāo)準(zhǔn)示范基地，田間管理與施肥方式基本一致。土壤樣品采集時(shí)間為2014年4月，樣品分別來(lái)自該基地內(nèi)種植年限為8、18和28 a胡椒園，品種為栽培種熱引1號(hào)（印尼大葉種），面積各約0.2～0.27 hm2。取樣時(shí)以對(duì)角線在園塊內(nèi)選取5～7個(gè)點(diǎn)做成1個(gè)混合樣，每個(gè)樣點(diǎn)重復(fù)采樣3次。用小鏟挖開(kāi)每個(gè)點(diǎn)所在胡椒冠幅下土壤，取10～20 cm土層中根系，采用抖土法收集土樣，完畢后放入冰盒后帶回實(shí)驗(yàn)室。用于BIOLOG分析的土樣放入4 ℃冰箱保存；用于土壤基礎(chǔ)理化測(cè)定的土樣置于室內(nèi)通風(fēng)陰涼處風(fēng)干，過(guò)篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 測(cè)定均采用常規(guī)方法[12]，具體如下：土壤pH值用電位法（土水比為1 ∶ 2.5）測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)用KCr2O7容量法-外加熱法測(cè)定；速效氮用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；有效磷用0.03 mol/L NH4F-0.025 mol/L HCl浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定；有效鉀用中性NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定 采用BIOLOG生態(tài)微平板（BIOLOG EcoPlateTM）測(cè)定。稱取相當(dāng)于10.00 g烘干質(zhì)量的濕潤(rùn)土壤于250 mL三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌去離子水，4 ℃下充分振蕩1 h，靜置3 min后用無(wú)菌去離子水配制成10-3土壤懸浮液。用8通道加樣槍吸取此土壤懸浮液150 μL至ECO板的微孔中，每24 h測(cè)定590 nm處吸光度值，直至讀數(shù)穩(wěn)定為止，一般培養(yǎng)240 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用每孔吸光度值計(jì)算平均吸光度值（average well colour development， AWCD），利用培養(yǎng)96 h的每孔吸光度值計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、香農(nóng)指數(shù)均勻度（Shannon evenness）和辛普森優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Simpson index）等多樣性指數(shù)，具體計(jì)算方法參見(jiàn)楊永華等[13]和張志明等[14]，數(shù)值計(jì)算出后，采用單因素方差分析不同種植年限間的顯著性差異；以96 h的每孔吸光度值進(jìn)行主成分分析（PCA）。單因素方差分析和主成分分析均利用SPSS 19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒連作對(duì)土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)的影響

由表1可知，隨著種植年限增加，土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量均呈顯著下降趨勢(shì)，其中8～18 a和18～28 a階段土壤pH分別下降0.22和0.36個(gè)單位，有機(jī)質(zhì)含量分別減少0.37 g/kg和2.35 g/kg，表明土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量隨連作時(shí)間增加，受影響程度越大；土壤速效磷呈上升，速效鉀則下降趨勢(shì)，而速效氮含量無(wú)顯著差異，這可能與胡椒施肥過(guò)程中施入的氮磷多而鉀肥少，引起連作胡椒園土壤養(yǎng)分失衡有關(guān)。

2.2 連作對(duì)胡椒園土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.2.1 土壤微生物群落碳源利用能力分析 平均吸光度值（AWCD）是表征土壤微生物群落利用碳源能力強(qiáng)弱，反映碳代謝總體活性的重要指標(biāo)[15]。不同種植年限處理的AWCD值隨著培養(yǎng)時(shí)間增加均呈“S”型增加（圖1所示），其中24～96 h AWCD增加速率最快，96 h后不同處理間碳代謝活性逐步達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定；不同處理間AWCD最大值存在差異，表現(xiàn)為8 a>18 a>28 a，表明隨著連作時(shí)間增加，土壤微生物群落碳源利用能力下降，總體碳代謝活性降低。

2.2.2 多樣性指數(shù)分析 采用培養(yǎng)96 h的平板微孔吸光度值，計(jì)算不同種植年限下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)及均勻度。結(jié)果表明，隨著種植年限增加，香農(nóng)指數(shù)、香農(nóng)均勻度和辛普森指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。其中，18 a和28 a處理的香農(nóng)指數(shù)較8 a處理分別下降19.1%和74.9%，香農(nóng)均勻度指數(shù)分別下降26.3%和63.1%；而辛普森指數(shù)僅分別下降3.1%和9.3%（見(jiàn)表2）。顯著性分析表明，香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度指數(shù)在不同種植年限處理之間達(dá)到顯著水平（p<0.05），而辛普森指數(shù)在不同處理間無(wú)顯著性差異（見(jiàn)表2）。

2.2.3 土壤微生物對(duì)不同類型碳源利用的差異

按化學(xué)官能團(tuán)的性質(zhì)對(duì)ECO板上的31種碳源分成6類[16]，即糖類及其衍生物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸類和胺類，將每類碳源的吸光值平均后進(jìn)行分析。從圖2可知，不同種植年限土壤微生物對(duì)不同碳源的利用程度差異較大，說(shuō)明隨著連作時(shí)間增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。其中，利用多聚物類和酚酸類碳源的微生物最先受到影響，從8 a到18 a這一階段2類微生物有較大程度降低，而此后下降程度不大；而碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類等碳源利用微生物則在18 a后受連作影響較大，因而表現(xiàn)為28 a明顯下降。

2.3 土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

采用培養(yǎng)96 h的平板微孔吸光度值進(jìn)行主成分分析，提取2個(gè)主成分因子并做荷載圖（如圖3）。2個(gè)主成分因子累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.71%，說(shuō)明2個(gè)主成分因子可以很好地解釋不同種植年限土壤之間的絕大多數(shù)差異。其中第1主成分（PC 1）的方差貢獻(xiàn)率為78.99%，第2主成分（PC 2）的方差貢獻(xiàn)率為6.72%。在PC 1軸上，8 a、18 a和28 a分別分布于軸的正值區(qū)、零點(diǎn)區(qū)和負(fù)值區(qū)；在PC 2軸上，18 a主要分布于正值區(qū)，而8 a和28 a分布在負(fù)值區(qū)。因此，利用主成分分析可以很好地將8、18和28 a土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分別劃分在荷載圖第4、第1和第3象限，進(jìn)一步表明胡椒土壤微生物群落結(jié)構(gòu)隨著種植年限增加出現(xiàn)了明顯變化。

分析31種碳源在2個(gè)主成分上的荷載值如表3所示。從表中可知，對(duì)第1主成分（PC 1）貢獻(xiàn)較大的碳源主要包括D-半乳糖酸內(nèi)酯等9種碳水化合物類碳源、L-精氨酸等4種氨基酸類碳源和r-羥基丁酸等4種羧酸類碳源；對(duì)第2主成分（PC 2）貢獻(xiàn)較大的碳源則主要包括N-乙?；?D-葡萄胺等2種胺類碳源。由于PC 1方差貢獻(xiàn)率為78.99%，表明引起連作胡椒土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要種群即碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類這3類碳源利用微生物。

3 討論

隨著土地資源日益緊張，中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土地利用強(qiáng)度不斷加大，土壤連作障礙現(xiàn)象已十分普遍[17]。連作通常導(dǎo)致作物生長(zhǎng)發(fā)育不良，品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低。盡管其形成原因較多，但土壤中微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力下降、作物減產(chǎn)的重要原因之一[8-9，18]。

3.1 胡椒連作對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響

連作土壤一般伴隨著土壤微生物群落功能多樣性降低。時(shí)鵬等[19]利用BIOLOG法研究玉米連作土壤表明，連作土壤微生物群落功能多樣性顯著低于非連作土壤。岳冰冰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，煙草連作7年土壤微生物功能多樣性顯著低于連作2年處理。張重義等[17]對(duì)地黃連作研究表明，隨著種植年限增加，土壤微生物群落多樣性呈下降趨勢(shì)。前期對(duì)胡椒連作的研究表明[2]，隨著胡椒種植年限增加，土壤微生物總量逐年下降。本研究利用BIOLOG法也發(fā)現(xiàn)，表征31種碳源利用程度的平均吸光度值（AWCD），在不同種植年限土壤之間隨連作時(shí)間增加明顯下降（圖1），表明連作土壤微生物群落碳代謝整體能力下降，土壤微生物群落功能多樣性降低，與上述研究結(jié)果一致。

多樣性指數(shù)也反映了微生物群落功能多樣性變化。而且，不同指數(shù)反映多樣性不同側(cè)面，香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度主要反映群落物種個(gè)體數(shù)和分布均勻度，而辛普森指數(shù)反映群落中最常見(jiàn)類群的優(yōu)勢(shì)度[10-11，21]。本研究中香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度結(jié)果與AWCD一致，均隨連作時(shí)間增加顯著下降，表明微生物功能多樣性隨年限增加而下降；但辛普森指數(shù)在種植年限間差異不顯著，表明該過(guò)程中微生物優(yōu)勢(shì)種群可能未發(fā)生明顯變化，又根據(jù)不同類型碳源利用微生物隨種植年限的變化差異可知（圖2），碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類等碳源利用微生物受種植年限影響程度較小，是胡椒根際中的優(yōu)勢(shì)微生物種群。

3.2 胡椒連作對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落功能多樣性反映了群落總體情況，而土壤微生物對(duì)不同類型碳源利用的差異，則反映了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成變化[22]。本研究中，6類不同碳源利用微生物AWCD值均隨連作時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，但出現(xiàn)較大下降的階段存在不同：酚酸類和多聚物類碳源利用微生物出現(xiàn)大幅下降時(shí)間相對(duì)較早，在連作8～18 a時(shí)即明顯下降；而碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類等則相對(duì)較晚，到連作18～28 a才有明顯下降。因而分析不同微生物類群對(duì)胡椒連作障礙形成的影響程度，可以更好地理解胡椒連作障礙形成原因。

Badri等[23]利用擬南芥根系分泌物不同組分培養(yǎng)土壤微生物發(fā)現(xiàn)，與其它碳源類組分相比，酚酸類利用微生物物種豐富度更高，對(duì)于土壤微生物多樣性和群落組成具有重要意義。本研究中8～18 a階段酚酸類和多聚物類利用微生物活性大幅降低，表明這一時(shí)期連作胡椒土壤微生物多樣性出現(xiàn)了第1次明顯下降；而且，與其他碳源利用微生物相比，這2類微生物活性大幅下降的時(shí)間相對(duì)較早，說(shuō)明其適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力相對(duì)較弱，在今后研究中，可將相關(guān)微生物活性開(kāi)始大幅下降階段作為胡椒連作障礙初始發(fā)生的重要信號(hào)。

本研究中，18～28 a階段碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類等碳源利用微生物大幅下降，說(shuō)明這3類微生物適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力相對(duì)較強(qiáng)。盡管如此，隨著連作年限增加，土壤pH等微生態(tài)環(huán)境不斷惡化，最終造成這些優(yōu)勢(shì)微生物活性減弱，此時(shí)土壤連作障礙問(wèn)題也更加明顯。

3.3 土壤微生物群落功能多樣性與胡椒連作障礙的關(guān)系

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，物種越均勻，多樣性越豐富，其抑制病原菌能力越強(qiáng)[5，24]。如Irikiin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，番茄青枯病發(fā)病率與BIOLOG ECO板中碳源利用數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。董艷等[26]研究也表明，提高土壤微生物多樣性可以顯著降低蠶豆枯萎病的發(fā)生。目前認(rèn)為，微生物群落多樣性的抑病機(jī)理可能與根際生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)[27-28]或者微生物間碳源營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)[28-29]有關(guān)。在本研究中，連作胡椒土壤微生物群落功能多樣性下降，也與實(shí)際生產(chǎn)中老齡園病害易發(fā)、產(chǎn)量下降等問(wèn)題具有一致性。而且研究表明，通過(guò)合理施用化肥[30]，增施有機(jī)肥[31]或有機(jī)生物肥[32-33]，采取輪作[34]或間作[35]等大田管理措施來(lái)提高根際微生物多樣性，可以有效緩解連作障礙，為今后解決胡椒連作障礙問(wèn)題提供了參考。

3.4 不同碳源利用微生物與胡椒連作障礙

由前述分析已知，酚酸類利用微生物活性下降是胡椒連作障礙開(kāi)始的重要信號(hào)。但引起連作障礙的原因除了酚酸類利用微生物大幅減少會(huì)造成土壤微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡外，還可能與其大幅減少引起胡椒根際中酚酸類物質(zhì)積累有關(guān)。大豆、煙草等研究已表明，酚酸類物質(zhì)是重要的化感物質(zhì)，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致其在土壤中累積是造成連作障礙發(fā)生的重要原因[36-37]。本研究中，酚酸類碳源利用微生物在8～18 a時(shí)大幅減少，表明此時(shí)胡椒根際中酚酸類物質(zhì)分解速率將大大降低，未被分解利用的酚酸類物質(zhì)在土壤中大量累積，從而表現(xiàn)為較強(qiáng)的化感作用。國(guó)外也有報(bào)道[38]，巴西、泰國(guó)、馬來(lái)西亞等胡椒主產(chǎn)國(guó)在胡椒種植15 a左右時(shí)就會(huì)輪作，否則胡椒產(chǎn)量就會(huì)大幅降低，進(jìn)一步證實(shí)了15～18 a這一階段是胡椒連作障礙開(kāi)始發(fā)生的主要時(shí)期。但該時(shí)期連作障礙形成機(jī)制仍需在今后研究中取得更直接的證據(jù)予以證實(shí)。

碳水化合物、氨基酸和羧酸類碳源利用微生物也與連作障礙形成密切相關(guān)。碳水化合物類物質(zhì)是根際微生物利用最廣泛的碳源，其利用微生物減少表明土壤微生物整體多樣性下降。精氨酸、天冬酰胺酸、苯丙氨酸等氨基酸可以促進(jìn)尖孢鐮刀菌等病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，使得根際微環(huán)境有利于病原菌生長(zhǎng)，引發(fā)植株病害[39]。羧酸類利用微生物減少會(huì)造成植物根際有機(jī)酸分解減緩，加速根際酸化，如本研究中8～18 a和18～28 a階段土壤pH分別下降0.22和0.36個(gè)單位；當(dāng)根際酸化程度過(guò)大則會(huì)抑制根系生長(zhǎng)，影響作物水分和養(yǎng)分吸收，引起作物長(zhǎng)勢(shì)變差。因此，當(dāng)參與眾多土壤生物化學(xué)過(guò)程的微生物種群大幅減少時(shí)，其維持土壤物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)的能力也相應(yīng)下降，土壤微生態(tài)環(huán)境逐步惡化，從而表現(xiàn)出較嚴(yán)重的連作障礙問(wèn)題。

3.5 小結(jié)與展望

本研究采用BIOLOG微平板法研究了不同種植年限胡椒園土壤微生物功能多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，隨種植年限增加，胡椒園土壤微生物功能多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，同時(shí)土壤pH值明顯下降，養(yǎng)分逐漸失衡，這些因素共同作用是導(dǎo)致胡椒連作障礙形成的主要原因。但由于BIOLOG法培養(yǎng)的微生物只占自然完整微生物中的10%[7]，不能完全反映連作障礙形成過(guò)程中所有微生物群落變化等信息[40]。因此，今后需采用更先進(jìn)的研究方法，如454、Illumina等高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)開(kāi)展相關(guān)研究[10]，為揭示胡椒連作障礙形成中微生物參與機(jī)制提供更加直接、明確的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄔華松， 楊建峰， 王 燦. 胡椒優(yōu)勢(shì)區(qū)域布局[M] // 農(nóng)業(yè)部農(nóng)墾局（南亞辦）， 中國(guó)農(nóng)墾經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心（南亞中心）編. 主要熱帶作物優(yōu)勢(shì)區(qū)域布局規(guī)劃（2016-2020年）. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2016： 216-226.

[2] 李志剛， 劉愛(ài)勤， 祖 超， 等. 不同種植年限胡椒園土壤理化性質(zhì)及微生物生態(tài)特征研究初報(bào)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 33（7）： 1 245-1 249.

[3] Schloter M， Dilly O， Munch J N. Indicators for evaluating soil quality[J]. Agriculture Ecosystem and Environment， 2003， 98： 255-262.

[4] 張子龍， 王文權(quán). 植物連作障礙的形成機(jī)制及其調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志， 2010， 27（5）： 69-72.

[5] 張瑞福， 沈其榮. 抑病型土壤的微生物區(qū)系特征及調(diào)控[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 35（5）： 125-132.

[6] 施 寵， 梁 智， 徐萬(wàn)里， 等. 不同連作年限棉田土壤微生物和酶的特征[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 47（1）： 163-167.

[7] 李春格， 李曉鳴， 王敬國(guó). 大豆連作對(duì)土體和根際微生物群落功能的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006， 26（4）： 1 144-1 150.

[8] 馬云華， 魏 珉， 王秀峰. 日光溫室連作黃瓜根區(qū)微生物區(qū)系及酶活性的變化[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2004， 15（6）： 1 005-1 008.

[9] 胡元森， 劉亞峰， 吳 坤， 等. 黃瓜連作土壤微生物區(qū)系變化研究[J]. 土壤通報(bào)， 2006， 37（1）： 126-129.

[10] 王 玲， 黃世文， 劉連盟， 等. 2009. 三種研究農(nóng)田土壤微生物多樣性方法的比較[J]. 科技通報(bào)， 2009， 25（5）： 588-592.

[11] 田雅楠， 王紅旗. Biolog法在環(huán)境微生物功能多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)， 2011， 34（3）： 50-57.

[12] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社， 1999.

[13] 楊永華， 姚 健， 華曉梅. 農(nóng)藥污染對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 微生物學(xué)雜志， 2000， 20（2）： 23-25.

[14] 張志明， 許艷麗， 韓曉增， 等. 連續(xù)施肥對(duì)農(nóng)田黑土微生物功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2012， 31（3）： 647-651.

[15] Mafham J P， Boddy L， Randerson P F. Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilisation profiles-a critique[J]. FEMS Microbiology Ecology， 2002， 42（1）： 1-14.

[16] Choi K H， Dobbs F C. Comparison of two kinds of Biolog microplates （GN and ECO） in their ability to distinguish among aquatic microbial communities[J]. Journal of Microbiological Methods， 1999， 36（3）： 203-213.

[17] 阮維斌， 王敬國(guó)， 張福鎖， 等. 根際微生態(tài)系統(tǒng)理論在連作障礙中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 1999， 1（4）： 53-58.

[18] 張重義， 陳 慧， 楊艷會(huì)， 等. 連作對(duì)地黃根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2010， 21（11）： 2 843-2 848.

[19] 時(shí) 鵬， 高 強(qiáng)， 王淑平， 等. 玉米連作及其施肥對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2010， 30（22）： 6 173-6 182.

[20] 岳冰冰， 李 鑫， 張會(huì)慧， 等. 連作對(duì)黑龍江烤煙土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 土壤， 2013， 45（1）： 116-119.

[21] 李 娟， 趙秉強(qiáng)， 李秀英， 等. 長(zhǎng)期不同施肥制度下幾種土壤微生物學(xué)特征變化[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2008， 32（4）： 891-899.

[22] Kennedy A C， Smith K L. Soil microbial diversity and the sustainability of agricultural soils[J]. Plant Soil， 1995， 170： 75-86.

[23] Badri D V， Chaparro J M， Zhang R F， et al. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of arabidopsisto the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome[J]. The journal of biological chemistry， 2013， 288（7）： 4 502-4 512.

[24] Weller D M， Raaijmakers J M， Gardener B B M， et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology， 2002， 40： 309-348.

[25] Irikiin Y， Nishiyama M， OtsukaS， et al. Rhizobacterial community-level， sole carbon source utilization pattern affects the delay in the bacterial wilt of tomato grown in rhizobacterial community model system[J]. Applied Soil Ecology， 2006， 34： 27-32.

[26] 董 艷， 楊智仙， 董 坤， 等. 施氮水平對(duì)蠶豆枯萎病和根際微生物代謝功能多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013， 24（4）： 1 101-1 108.

[27] Li S， Zhang N， Zhang Z， et al. Antagonist Bacillus subtilis HJ5 controls Verticillium wilt of cotton by root colonization and biofilm formation[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49： 295-303.

[28] 胡江春， 薛德林， 馬成新， 等. 植物根際促生菌（PGPR）的研究與應(yīng)用前景. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2004， 15（10）： 1 963-1 966.

[29] 崔曉雙， 王 偉， 張 如， 等. 基于根際營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的植物根際促生菌的篩選及促生效應(yīng)研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 38（6）： 958-966.

[30] 陳曉芬， 李忠佩， 劉 明， 等. 長(zhǎng)期施肥處理對(duì)紅壤水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2015， 34（7）： 1 815-1 822.

[31] 羅希茜， 郝曉暉， 陳 濤， 等. 長(zhǎng)期不同施肥對(duì)稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2009， 29（2）： 740-748.

[32] 胡 可， 李華興， 盧維盛， 等. 生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物活性的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2010， 18（2）： 303-306.

[33] 肖相政， 廖宗文， 杜建軍. 生物有機(jī)肥對(duì)青枯病防效及土壤微生物多樣性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（9）： 119-122.

[34] 吳鳳芝， 王學(xué)征. 設(shè)施黃瓜連作和輪作中土壤微生物群落多樣性的變化及其與產(chǎn)量品質(zhì)的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 40（10）： 2 274-2 280.

[35] 蘇世鳴， 任麗軒， 霍振華， 等. 西瓜與旱作水稻間作改善西瓜連作障礙及對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 41（3）： 704-712.

[36] 張淑香， 高子勤， 劉海玲， 等. 連作障礙與根際微生態(tài)研究Ⅲ. 土壤酚酸物質(zhì)及其生物學(xué)效應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2000， 11（5）： 741-744.

[37] 楊宇虹， 陳冬梅， 晉 艷， 等. 不同肥料種類對(duì)連作煙草根際土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2011， 37（1）： 105-111.

[38] Prabhakaran Nair K P. The agronomy and economy of Black Pepper （Piper Nigrum L.）- The King of Spices[J]. Advances in Agronomy， 2004， 82： 306.

[39] Hao WY， Ren LX， RanW， et al. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f. sp. niveum[J]. Plant and Soil， 2010， 336： 485-497

[40] 章家恩， 蔡燕飛， 高愛(ài)霞， 等.土壤微生物多樣性實(shí)驗(yàn)研究方法概述[J]. 土壤， 2004， 36（4）： 346-350.