朱晨　張舒婷　常笑君　王仲　許長(zhǎng)同　張梓浩　林玉玲　賴鐘雄　郭玉瓊

摘 要 利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)福建省7個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)品種進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析。篩選出的12條引物共擴(kuò)增出97條條帶，其中多態(tài)性條帶有92條，多態(tài)性譜帶百分率為94.84%；53份供試材料可劃分為5大類（GS=0.71），遺傳距離介于0.66～0.99之間；Nei基因多樣性指數(shù)為0.224，Shannon's信息指數(shù)為0.368，不同地區(qū)茶樹(shù)的遺傳多樣性參數(shù)差異較大，其中寧德福安地區(qū)最高，福州鼓山地區(qū)最低；總變異系數(shù)為0.332，地區(qū)內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性為0.154，而地區(qū)間為0.231，福州地區(qū)與其他地區(qū)之間的相似性較弱；研究認(rèn)為，福建省茶樹(shù)遺傳多樣性豐富，不同地區(qū)茶樹(shù)存在高頻率遺傳變異，而缺乏遺傳信息交流是造成福州地區(qū)遺傳多樣性較低的可能因素。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The genetic diversity and genetic structure of tea plant in seven regions of Fujian Province were examined by ISSR.The results showed that， 97 bands were amplified with 12 ISSR primers， the polymorphic bands of which were 92， and their polymorphism percentage was 94.84%. 53 tea plant resources were divided into 5 groups（GS=0.71）. The range of genetic distance was between 0.66～0.99. The Neis genetic distance was 0.224， the Shannons information index was 0.368， and the genetic diversity in different regions of tea plant had significant？difference. Fu'an in Ningde was the highest when the Gushan Mountain in Fuzhou got the lowest similarity with the others. The coefficient of gene variation was 0.332. The values of genetic diversity in and between the regions was 0.154 and 0.231， respectively.The Fuzhou area got low similarity with the others. The results indicated that， there was high genetic diversity of tea plant in Fujian Province， which had high frequency of heritable variation in different regions. The insufficiency of genetic information flow might be the main fact of the genetic diversity in Fuzhou area.

Key words Camellia sinensis； germplasm resources； ISSR； genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.019

茶樹(shù)（Camellia sinensis）屬于山茶科山茶屬，是多年生、木本、常綠植物，福建省是茶葉的主產(chǎn)地，栽培歷史悠久，茶樹(shù)種質(zhì)資源豐富[1]。近年來(lái)隨著新品種選育研究和示范推廣工作的不斷深入，越來(lái)越多的優(yōu)良茶樹(shù)新品種對(duì)茶區(qū)產(chǎn)量和品質(zhì)的提升起到了推動(dòng)作用[2]，但由于異花授粉和近交衰退的影響，造成選育的新品種遺傳基礎(chǔ)單一，新品種的優(yōu)良性狀不能較好的遺傳保持，子代的遺傳性狀良莠不齊，不利于茶產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。同時(shí)傳統(tǒng)的育種方法選育周期長(zhǎng)，親本選擇范圍有限，大多只考慮表型性狀因素[3]，限制了茶樹(shù)種質(zhì)資源的研究和新品種的選育。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于基因組DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、指紋圖譜的繪制和品種鑒定、種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究以及基因標(biāo)記和定位等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，這為茶樹(shù)優(yōu)良品種的選育開(kāi)拓了新的思路。因此利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)福建省現(xiàn)有的茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳性狀進(jìn)行分析、鑒定和分類，可以為親本的選配提供科學(xué)依據(jù)，降低選育的難度，推進(jìn)良種培育的進(jìn)程[4-5]。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)不同物種SSR位點(diǎn)間的序列長(zhǎng)度來(lái)判斷其多態(tài)性[6]。與AFLP、RAPD和SSR等其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，ISSR技術(shù)多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，相對(duì)成本較低，適用于親緣關(guān)系較近的材料[7-10]。同時(shí)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在茶樹(shù)及其他植物基因型鑒定和親緣關(guān)系的分析利用等方面已有相關(guān)報(bào)道[11-18]，而有關(guān)福建省茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性的綜合分析還鮮有報(bào)道。

本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)福建省內(nèi)不同地區(qū)的53份茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系的探究和遺傳多樣性的分析，以期為有效地鑒別福建省茶山林海中未收集保存的珍稀茶樹(shù)種質(zhì)資源、保護(hù)和利用已培育的優(yōu)良茶樹(shù)新品種提供新的技術(shù)手段；更為今后福建省茶樹(shù)核心種質(zhì)庫(kù)建立以及雜交育種親本選配提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

53份供試材料采自福建省7個(gè)地區(qū)（表1）。采后茶樹(shù)葉片置于密封袋中，經(jīng)液氮處理后放置-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

茶樹(shù)基因組DNA提取參照唐玉海等[19]的改良CTAB法。ISSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化參照林鄭和等[20]的方法。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s；退火溫度（根據(jù)不同引物而定）退火30 s；72 ℃延伸2 min，37個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

電泳圖上同一位點(diǎn)無(wú)條帶和虛弱條帶統(tǒng)一標(biāo)記為0，有明顯條帶的標(biāo)記為1，并建立原始二元數(shù)據(jù)矩陣[21]，計(jì)算每個(gè)引物的多態(tài)性比率（多態(tài)性帶數(shù)/總帶數(shù)）。利用NTsys2.0、Popgene32和STRUCTURE2.3.4軟件分別進(jìn)行遺傳距離聚類分析[22-23]、遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算和遺傳結(jié)構(gòu)分析[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選與擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

根據(jù)條帶清晰程度和多態(tài)性程度來(lái)篩選引物并確定最適退火溫度，最終篩選出12條引物及其最適退火溫度，各個(gè)引物的最佳退火溫度一般會(huì)略高于或低于引物理論退火溫度。

用所篩選出來(lái)的12條引物對(duì)53份供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，部分引物擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，共擴(kuò)增出97條清晰可見(jiàn)的條帶，其中92條是多態(tài)性條帶，每條引物平均擴(kuò)增8.08個(gè)條帶和7.67個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達(dá)到94.84%（表2），其中引物UBC844的多態(tài)性最弱，僅為80%，而引物UBC811、UBC818、UBC827、UBC840、UBC854、UBC856、UBC857和UBC895的多態(tài)性最好，多態(tài)性百分率均到達(dá)100%。同時(shí)不同引物擴(kuò)增結(jié)果也不相同，引物UBC811、UBC816、UBC856和UBC857擴(kuò)增的條帶明顯多于引物UBC818和UBC895。

2.2 福建省茶樹(shù)遺傳距離分析

在圖2中以遺傳距離GS=0.71為標(biāo)準(zhǔn)，將供試材料劃分為5大類（表3），其中A類共有39個(gè)茶樹(shù)品種，以GS=0.74為標(biāo)準(zhǔn)又可以把A類分為4個(gè)組，其中Ⅰ組的金牡丹和金觀音之間的遺傳相似性系數(shù)高達(dá)0.99；羅源飛竹外坂和羅源西洋1號(hào)的相似性系數(shù)也高達(dá)0.90。由于金牡丹和金觀音的選育親本相同，因此兩者遺傳背景相似；羅源飛竹外坂和羅源西洋1號(hào)同處于羅源縣飛竹鎮(zhèn)，生長(zhǎng)環(huán)境和氣候相似，因此遺傳距離相近。Ⅱ組主要有武夷山地區(qū)的大紅袍、水仙、肉桂等品種。采自閩侯方山的5個(gè)品種聚類為Ⅲ組；B類只有福安菜茶1個(gè)茶樹(shù)品種，可能與福安菜茶品種的不確定性和遺傳背景的復(fù)雜性有關(guān)。C類分別是早春毫、白云特早、矮腳烏龍6號(hào)和雜交1號(hào)；D類是采自建甌的矮腳烏龍1號(hào)、2號(hào)和5號(hào)；黃旦、黃觀音和黃玫瑰等都?xì)w入E類。南平建甌的矮腳烏龍1～6號(hào)分別聚類到A、C、D類中，是由于建甌矮腳烏龍1～6號(hào)采自建甌東峰鎮(zhèn)百年矮腳烏龍種植園，其遺傳背景存在差異。

2.3 福建省茶樹(shù)遺傳多樣性分析

采用Popgene32對(duì)福建省7個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，其等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性參數(shù)（H）、Shannon′s信息指數(shù)（I）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（N.P.B）和多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）等參數(shù)分析結(jié)果顯示（表4），不同地區(qū)茶樹(shù)的Nei基因多樣性指數(shù)（H）介于0.099～0.207，平均為0.154；Shannon′s信息指數(shù)（I）介于0.148～0.324，平均為0.242；可見(jiàn)，福建省茶樹(shù)的遺傳多樣性水平較高。進(jìn)一步依據(jù)不同地區(qū)的基因多樣性指數(shù)從大到小排列發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間茶樹(shù)的遺傳多樣性水平存在明顯差異，分別為南平建甌>寧德福安>南平武夷山>閩侯方山>福州羅源>福州鼓山>福州永泰。7個(gè)地區(qū)茶樹(shù)的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)介于24～88，多態(tài)性位點(diǎn)百分率介于22.49%～86.80%，總多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)到95.58%。其中，南平建甌、寧德福安和南平武夷山地區(qū)的茶樹(shù)的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)較高，而福州鼓山和福州永泰的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最低。

2.4 福建省茶樹(shù)遺傳分化分析

福建省茶樹(shù)總遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.332，即66.80%的遺傳分化來(lái)源于不同地區(qū)茶樹(shù)內(nèi)部，而33.20%的遺傳分化來(lái)源于地區(qū)之間，可見(jiàn)福建省茶樹(shù)的遺傳分化或遺傳變異主要來(lái)源于地區(qū)內(nèi)部。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，基因流（Nm）為1.007，略大于1.0，表明不同地區(qū)茶樹(shù)之間遺傳漂移阻礙較小，存在一定頻率的遺傳信息交流。而在地區(qū)內(nèi)部和地區(qū)間茶樹(shù)分析中，地區(qū)內(nèi)部茶樹(shù)間的遺傳多樣性（Hs）僅為0.154，地區(qū)間茶樹(shù)的遺傳多樣性（Ht）為0.231，結(jié)合各項(xiàng)遺傳分化參數(shù)推斷，福建省茶樹(shù)遺傳多樣性主要由于不同地區(qū)茶樹(shù)的遺傳分化或變異水平所導(dǎo)致的，與茶樹(shù)生長(zhǎng)環(huán)境差異可能存在較大關(guān)系，這對(duì)鑒別珍貴茶樹(shù)種質(zhì)資源提供了新的參考依據(jù)。

進(jìn)一步分析遺傳相似系數(shù)（表5）發(fā)現(xiàn)，福州羅源和寧德福安茶樹(shù)的親緣關(guān)系最近，遺傳相似度達(dá)到0.981，推測(cè)可能與這兩個(gè)地區(qū)距離較近且生態(tài)環(huán)境較一致有關(guān)；福州鼓山與福州永泰茶樹(shù)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，僅為0.763，可能由二地之間的局部環(huán)境差異導(dǎo)致。

2.5 福建省茶樹(shù)遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用STRUCTURE 2.3.4軟件對(duì)福建省茶樹(shù)53份樣品進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=3時(shí)，能取得最大的△K值和穩(wěn)定的lnP（K）值。因此，福建省7個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)可分為3大類（圖3），群體Ⅰ主要由南平建甌、福州羅源和寧德福安的大部分品種組成；群體Ⅱ主要由福州鼓山、福州羅源和寧德福安的部分品種組成；群體Ⅲ包含南平武夷山、福州永泰、閩侯方山和寧德福安的部分品種。在遺傳結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步驗(yàn)證不同地區(qū)茶樹(shù)之間可能存在較高頻率的遺傳信息交流。值得注意的是，霞浦元宵綠、泮野2號(hào)和矮腳烏龍3號(hào)在概率上無(wú)法和其他樣品一樣準(zhǔn)確歸屬到具體某一個(gè)類別中，由此可見(jiàn)福建省茶樹(shù)遺傳背景確實(shí)相對(duì)復(fù)雜。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，福建省茶樹(shù)模型聚類的后驗(yàn)概率Q值介于0.468～0.975之間，南平武夷山、福州永泰、閩侯方山和南平建甌地區(qū)的概率值幾乎都大于0.7，且87.5%的茶樹(shù)個(gè)體分布Q值大于0.9，說(shuō)明這4個(gè)地區(qū)茶樹(shù)個(gè)體之間的遺傳信息交流較為有限。而福州鼓山、福州羅源和寧德福安地區(qū)的Q值介于0.468～0.597之間，其中大于0.9的茶樹(shù)個(gè)體僅占65.51%，與其他4個(gè)地區(qū)相比，這3個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)可能存在更復(fù)雜的遺傳背景，具有更豐富的遺傳多樣性，因此這些地區(qū)的茶樹(shù)種質(zhì)資源具有更高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

3 討論

3.1 福建省茶樹(shù)的遺傳多樣性豐富

利用篩選后的12條引物對(duì)福建省茶樹(shù)53份供試材料進(jìn)行了ISSR分析，由于樣品既有來(lái)自同一地區(qū)的不同品種，也有來(lái)自不同地區(qū)的相同品種，還有同一地區(qū)的相同品種，樣品間的遺傳背景較為復(fù)雜。原產(chǎn)于南平武夷山地區(qū)而引種至寧德福安地區(qū)的武夷菜茶1號(hào)和2號(hào)與寧德福安地區(qū)其他茶樹(shù)品種劃分在同一組別，可能是經(jīng)過(guò)不斷的引種馴化和人工選育，以及品種間自然雜交，或是由于環(huán)境因素的影響而表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系[25]。綜合STRUCTURE分類結(jié)果與福建各地氣候環(huán)境進(jìn)行分析，福州地區(qū)處沿海地帶，受海洋氣流影響，終年溫暖濕潤(rùn)，陽(yáng)光充足，霜少無(wú)雪，因此茶樹(shù)主要以提高抗蟲(chóng)病能力為主；福安、建甌和羅源地區(qū)茶樹(shù)多分布于內(nèi)陸山區(qū)，冬季易受南下冷空氣影響，主要以增強(qiáng)抗寒性變異為主；而南平武夷山和閩侯方山為山地氣候類型，具有明顯的垂直分布區(qū)域性特點(diǎn)，影響因素更為復(fù)雜。因此，福建茶樹(shù)品種的豐富性、福建各地氣候環(huán)境的多樣性和茶樹(shù)的引種馴化和人工選育共同造就了福建省茶樹(shù)豐富的遺傳多樣性。

3.2 福建省不同地區(qū)茶樹(shù)存在高頻率遺傳變異

地區(qū)內(nèi)和地區(qū)間遺傳變異信息是制定物種保護(hù)策略的重要參考依據(jù)[26]。物種的遺傳多樣性水平影響因素除了地區(qū)間的遺傳信息交流，還可能來(lái)源于環(huán)境和基因型引起的不同地區(qū)個(gè)體之間的特殊變異。Roy[27]，Liu[28]和Joshi等[29]研究均發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)不同地區(qū)的遺傳分化水平高于地區(qū)內(nèi)個(gè)體的遺傳分化水平，即茶樹(shù)的遺傳變異主要來(lái)源于地區(qū)之間。而本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不僅地區(qū)之間，同一地區(qū)內(nèi)茶樹(shù)的遺傳變異也會(huì)引起地區(qū)內(nèi)部的個(gè)體間差異，模型聚類結(jié)果也表明福建省茶樹(shù)遺傳結(jié)構(gòu)并不按照地區(qū)差異進(jìn)行劃分?？梢?jiàn)，自然選擇或地理環(huán)境對(duì)不同地區(qū)茶樹(shù)變異的影響具有一定的平行性，而且這種生活環(huán)境的異質(zhì)化所造成的不同地區(qū)的差異是茶樹(shù)主要的變異來(lái)源，而作為亞類群，不同品種在其中的影響力較弱。此外，這種地區(qū)間高水平的遺傳變異也可能與較高的基因流有關(guān)[30-31]?？偠灾?，受外界條件干擾，福建省不同地區(qū)茶樹(shù)存在高頻率遺傳變異，而這種干擾在品種間的差別可能較小。

3.3 部分地區(qū)茶樹(shù)種質(zhì)資源亟需重點(diǎn)保護(hù)

遺傳多樣性分析是植物新品種選育的基礎(chǔ)，而不同物種瀕危類型所表現(xiàn)出的遺傳多樣性程度也不同[32-33]。福建省茶樹(shù)總Nei遺傳多樣性參數(shù)達(dá)到0.224，高于Wachira[34]報(bào)道的日本（0.169）、越南（0.194）、斯里蘭卡（0.199）和肯尼亞（0.201）等國(guó)茶樹(shù)的平均遺傳多樣性水平，福建省茶樹(shù)具有更高的遺傳多樣性。此外，Irwin[35]研究發(fā)現(xiàn)，福建省茶樹(shù)遺傳漂移阻礙相對(duì)較小，存在較高頻率遺傳信息交流。然而不同地區(qū)遺傳多樣性差異較顯著，從大到小排列為南平建甌>寧德福安>南平武夷山>閩侯方山>福州羅源>福州鼓山>福州永泰，且福州羅源、鼓山和永泰地區(qū)與其他地區(qū)的遺傳相似度較低。結(jié)合福州地區(qū)茶樹(shù)分布實(shí)地調(diào)查推斷，遺傳多樣性的豐富與否可能造成不同茶樹(shù)品種之間生存、繁殖和適應(yīng)能力等方面差異從而影響茶樹(shù)的空間結(jié)構(gòu)分布。隨著茶樹(shù)無(wú)性系良種的不斷推廣，地區(qū)特色茶樹(shù)品種已逐步被相對(duì)單一的無(wú)性系良種取代，從而導(dǎo)致地區(qū)內(nèi)部的品種多樣性逐漸喪失。因此，城市化高速發(fā)展的福州地區(qū)是福建省茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)的重點(diǎn)，注重地方品種資源的收集、保存和保護(hù)，防止遺傳多樣性的進(jìn)一步丟失。

今后可利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，在全省乃至全國(guó)范圍內(nèi)收集茶樹(shù)種質(zhì)資源，建立省級(jí)和國(guó)家級(jí)優(yōu)良茶樹(shù)品種的ISSR指紋圖譜，可以對(duì)現(xiàn)有珍稀茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行有效的鑒別和保護(hù)，為優(yōu)良茶樹(shù)品種的選育以及全國(guó)性的茶樹(shù)種質(zhì)資源庫(kù)的建立提供科學(xué)依據(jù)[36]。

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