朱晨　張舒婷　常笑君　王仲　許長同　張梓浩　林玉玲　賴鐘雄　郭玉瓊

摘 要 利用ISSR分子標記技術對福建省7個地區(qū)的茶樹品種進行遺傳多樣性和遺傳結構的分析。篩選出的12條引物共擴增出97條條帶，其中多態(tài)性條帶有92條，多態(tài)性譜帶百分率為94.84%；53份供試材料可劃分為5大類（GS=0.71），遺傳距離介于0.66～0.99之間；Nei基因多樣性指數(shù)為0.224，Shannon's信息指數(shù)為0.368，不同地區(qū)茶樹的遺傳多樣性參數(shù)差異較大，其中寧德福安地區(qū)最高，福州鼓山地區(qū)最低；總變異系數(shù)為0.332，地區(qū)內(nèi)個體間遺傳多樣性為0.154，而地區(qū)間為0.231，福州地區(qū)與其他地區(qū)之間的相似性較弱；研究認為，福建省茶樹遺傳多樣性豐富，不同地區(qū)茶樹存在高頻率遺傳變異，而缺乏遺傳信息交流是造成福州地區(qū)遺傳多樣性較低的可能因素。

關鍵詞 茶樹；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Abstract The genetic diversity and genetic structure of tea plant in seven regions of Fujian Province were examined by ISSR.The results showed that， 97 bands were amplified with 12 ISSR primers， the polymorphic bands of which were 92， and their polymorphism percentage was 94.84%. 53 tea plant resources were divided into 5 groups（GS=0.71）. The range of genetic distance was between 0.66～0.99. The Neis genetic distance was 0.224， the Shannons information index was 0.368， and the genetic diversity in different regions of tea plant had significant？difference. Fu'an in Ningde was the highest when the Gushan Mountain in Fuzhou got the lowest similarity with the others. The coefficient of gene variation was 0.332. The values of genetic diversity in and between the regions was 0.154 and 0.231， respectively.The Fuzhou area got low similarity with the others. The results indicated that， there was high genetic diversity of tea plant in Fujian Province， which had high frequency of heritable variation in different regions. The insufficiency of genetic information flow might be the main fact of the genetic diversity in Fuzhou area.

Key words Camellia sinensis； germplasm resources； ISSR； genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.019

茶樹（Camellia sinensis）屬于山茶科山茶屬，是多年生、木本、常綠植物，福建省是茶葉的主產(chǎn)地，栽培歷史悠久，茶樹種質(zhì)資源豐富[1]。近年來隨著新品種選育研究和示范推廣工作的不斷深入，越來越多的優(yōu)良茶樹新品種對茶區(qū)產(chǎn)量和品質(zhì)的提升起到了推動作用[2]，但由于異花授粉和近交衰退的影響，造成選育的新品種遺傳基礎單一，新品種的優(yōu)良性狀不能較好的遺傳保持，子代的遺傳性狀良莠不齊，不利于茶產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。同時傳統(tǒng)的育種方法選育周期長，親本選擇范圍有限，大多只考慮表型性狀因素[3]，限制了茶樹種質(zhì)資源的研究和新品種的選育。隨著分子生物學的發(fā)展，基于基因組DNA水平的分子標記技術在植物遺傳連鎖圖譜構建、指紋圖譜的繪制和品種鑒定、種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究以及基因標記和定位等方面的應用越來越廣泛，這為茶樹優(yōu)良品種的選育開拓了新的思路。因此利用分子標記技術對福建省現(xiàn)有的茶樹種質(zhì)資源進行遺傳多樣性、親緣關系和遺傳性狀進行分析、鑒定和分類，可以為親本的選配提供科學依據(jù)，降低選育的難度，推進良種培育的進程[4-5]。

ISSR分子標記技術是一種利用簡單序列重復的寡核苷酸引物進行PCR擴增，通過檢測不同物種SSR位點間的序列長度來判斷其多態(tài)性[6]。與AFLP、RAPD和SSR等其他分子標記技術相比，ISSR技術多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性強，操作簡單，相對成本較低，適用于親緣關系較近的材料[7-10]。同時ISSR分子標記技術在茶樹及其他植物基因型鑒定和親緣關系的分析利用等方面已有相關報道[11-18]，而有關福建省茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的綜合分析還鮮有報道。

本研究采用ISSR分子標記技術結合生物信息學分析對福建省內(nèi)不同地區(qū)的53份茶樹種質(zhì)資源進行親緣關系的探究和遺傳多樣性的分析，以期為有效地鑒別福建省茶山林海中未收集保存的珍稀茶樹種質(zhì)資源、保護和利用已培育的優(yōu)良茶樹新品種提供新的技術手段；更為今后福建省茶樹核心種質(zhì)庫建立以及雜交育種親本選配提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

53份供試材料采自福建省7個地區(qū)（表1）。采后茶樹葉片置于密封袋中，經(jīng)液氮處理后放置-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

茶樹基因組DNA提取參照唐玉海等[19]的改良CTAB法。ISSR-PCR擴增體系優(yōu)化參照林鄭和等[20]的方法。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s；退火溫度（根據(jù)不同引物而定）退火30 s；72 ℃延伸2 min，37個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

電泳圖上同一位點無條帶和虛弱條帶統(tǒng)一標記為0，有明顯條帶的標記為1，并建立原始二元數(shù)據(jù)矩陣[21]，計算每個引物的多態(tài)性比率（多態(tài)性帶數(shù)/總帶數(shù)）。利用NTsys2.0、Popgene32和STRUCTURE2.3.4軟件分別進行遺傳距離聚類分析[22-23]、遺傳多樣性參數(shù)計算和遺傳結構分析[24]。

2 結果與分析

2.1 ISSR引物篩選與擴增結果多態(tài)性分析

根據(jù)條帶清晰程度和多態(tài)性程度來篩選引物并確定最適退火溫度，最終篩選出12條引物及其最適退火溫度，各個引物的最佳退火溫度一般會略高于或低于引物理論退火溫度。

用所篩選出來的12條引物對53份供試材料進行擴增，部分引物擴增結果如圖1所示，共擴增出97條清晰可見的條帶，其中92條是多態(tài)性條帶，每條引物平均擴增8.08個條帶和7.67個多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達到94.84%（表2），其中引物UBC844的多態(tài)性最弱，僅為80%，而引物UBC811、UBC818、UBC827、UBC840、UBC854、UBC856、UBC857和UBC895的多態(tài)性最好，多態(tài)性百分率均到達100%。同時不同引物擴增結果也不相同，引物UBC811、UBC816、UBC856和UBC857擴增的條帶明顯多于引物UBC818和UBC895。

2.2 福建省茶樹遺傳距離分析

在圖2中以遺傳距離GS=0.71為標準，將供試材料劃分為5大類（表3），其中A類共有39個茶樹品種，以GS=0.74為標準又可以把A類分為4個組，其中Ⅰ組的金牡丹和金觀音之間的遺傳相似性系數(shù)高達0.99；羅源飛竹外坂和羅源西洋1號的相似性系數(shù)也高達0.90。由于金牡丹和金觀音的選育親本相同，因此兩者遺傳背景相似；羅源飛竹外坂和羅源西洋1號同處于羅源縣飛竹鎮(zhèn)，生長環(huán)境和氣候相似，因此遺傳距離相近。Ⅱ組主要有武夷山地區(qū)的大紅袍、水仙、肉桂等品種。采自閩侯方山的5個品種聚類為Ⅲ組；B類只有福安菜茶1個茶樹品種，可能與福安菜茶品種的不確定性和遺傳背景的復雜性有關。C類分別是早春毫、白云特早、矮腳烏龍6號和雜交1號；D類是采自建甌的矮腳烏龍1號、2號和5號；黃旦、黃觀音和黃玫瑰等都歸入E類。南平建甌的矮腳烏龍1～6號分別聚類到A、C、D類中，是由于建甌矮腳烏龍1～6號采自建甌東峰鎮(zhèn)百年矮腳烏龍種植園，其遺傳背景存在差異。

2.3 福建省茶樹遺傳多樣性分析

采用Popgene32對福建省7個地區(qū)的茶樹進行遺傳多樣性分析，其等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性參數(shù)（H）、Shannon′s信息指數(shù)（I）、多態(tài)性位點數(shù)（N.P.B）和多態(tài)位點百分率（PPB）等參數(shù)分析結果顯示（表4），不同地區(qū)茶樹的Nei基因多樣性指數(shù)（H）介于0.099～0.207，平均為0.154；Shannon′s信息指數(shù)（I）介于0.148～0.324，平均為0.242；可見，福建省茶樹的遺傳多樣性水平較高。進一步依據(jù)不同地區(qū)的基因多樣性指數(shù)從大到小排列發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間茶樹的遺傳多樣性水平存在明顯差異，分別為南平建甌>寧德福安>南平武夷山>閩侯方山>福州羅源>福州鼓山>福州永泰。7個地區(qū)茶樹的多態(tài)性位點數(shù)介于24～88，多態(tài)性位點百分率介于22.49%～86.80%，總多態(tài)性位點百分率達到95.58%。其中，南平建甌、寧德福安和南平武夷山地區(qū)的茶樹的多態(tài)性位點數(shù)較高，而福州鼓山和福州永泰的多態(tài)性位點數(shù)最低。

2.4 福建省茶樹遺傳分化分析

福建省茶樹總遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.332，即66.80%的遺傳分化來源于不同地區(qū)茶樹內(nèi)部，而33.20%的遺傳分化來源于地區(qū)之間，可見福建省茶樹的遺傳分化或遺傳變異主要來源于地區(qū)內(nèi)部。進一步分析發(fā)現(xiàn)，基因流（Nm）為1.007，略大于1.0，表明不同地區(qū)茶樹之間遺傳漂移阻礙較小，存在一定頻率的遺傳信息交流。而在地區(qū)內(nèi)部和地區(qū)間茶樹分析中，地區(qū)內(nèi)部茶樹間的遺傳多樣性（Hs）僅為0.154，地區(qū)間茶樹的遺傳多樣性（Ht）為0.231，結合各項遺傳分化參數(shù)推斷，福建省茶樹遺傳多樣性主要由于不同地區(qū)茶樹的遺傳分化或變異水平所導致的，與茶樹生長環(huán)境差異可能存在較大關系，這對鑒別珍貴茶樹種質(zhì)資源提供了新的參考依據(jù)。

進一步分析遺傳相似系數(shù)（表5）發(fā)現(xiàn)，福州羅源和寧德福安茶樹的親緣關系最近，遺傳相似度達到0.981，推測可能與這兩個地區(qū)距離較近且生態(tài)環(huán)境較一致有關；福州鼓山與福州永泰茶樹的親緣關系最遠，僅為0.763，可能由二地之間的局部環(huán)境差異導致。

2.5 福建省茶樹遺傳結構分析

采用STRUCTURE 2.3.4軟件對福建省茶樹53份樣品進行遺傳結構分析發(fā)現(xiàn)，當K=3時，能取得最大的△K值和穩(wěn)定的lnP（K）值。因此，福建省7個地區(qū)的茶樹可分為3大類（圖3），群體Ⅰ主要由南平建甌、福州羅源和寧德福安的大部分品種組成；群體Ⅱ主要由福州鼓山、福州羅源和寧德福安的部分品種組成；群體Ⅲ包含南平武夷山、福州永泰、閩侯方山和寧德福安的部分品種。在遺傳結構上進一步驗證不同地區(qū)茶樹之間可能存在較高頻率的遺傳信息交流。值得注意的是，霞浦元宵綠、泮野2號和矮腳烏龍3號在概率上無法和其他樣品一樣準確歸屬到具體某一個類別中，由此可見福建省茶樹遺傳背景確實相對復雜。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，福建省茶樹模型聚類的后驗概率Q值介于0.468～0.975之間，南平武夷山、福州永泰、閩侯方山和南平建甌地區(qū)的概率值幾乎都大于0.7，且87.5%的茶樹個體分布Q值大于0.9，說明這4個地區(qū)茶樹個體之間的遺傳信息交流較為有限。而福州鼓山、福州羅源和寧德福安地區(qū)的Q值介于0.468～0.597之間，其中大于0.9的茶樹個體僅占65.51%，與其他4個地區(qū)相比，這3個地區(qū)的茶樹可能存在更復雜的遺傳背景，具有更豐富的遺傳多樣性，因此這些地區(qū)的茶樹種質(zhì)資源具有更高的開發(fā)利用價值。

3 討論

3.1 福建省茶樹的遺傳多樣性豐富

利用篩選后的12條引物對福建省茶樹53份供試材料進行了ISSR分析，由于樣品既有來自同一地區(qū)的不同品種，也有來自不同地區(qū)的相同品種，還有同一地區(qū)的相同品種，樣品間的遺傳背景較為復雜。原產(chǎn)于南平武夷山地區(qū)而引種至寧德福安地區(qū)的武夷菜茶1號和2號與寧德福安地區(qū)其他茶樹品種劃分在同一組別，可能是經(jīng)過不斷的引種馴化和人工選育，以及品種間自然雜交，或是由于環(huán)境因素的影響而表現(xiàn)出較近的親緣關系[25]。綜合STRUCTURE分類結果與福建各地氣候環(huán)境進行分析，福州地區(qū)處沿海地帶，受海洋氣流影響，終年溫暖濕潤，陽光充足，霜少無雪，因此茶樹主要以提高抗蟲病能力為主；福安、建甌和羅源地區(qū)茶樹多分布于內(nèi)陸山區(qū)，冬季易受南下冷空氣影響，主要以增強抗寒性變異為主；而南平武夷山和閩侯方山為山地氣候類型，具有明顯的垂直分布區(qū)域性特點，影響因素更為復雜。因此，福建茶樹品種的豐富性、福建各地氣候環(huán)境的多樣性和茶樹的引種馴化和人工選育共同造就了福建省茶樹豐富的遺傳多樣性。

3.2 福建省不同地區(qū)茶樹存在高頻率遺傳變異

地區(qū)內(nèi)和地區(qū)間遺傳變異信息是制定物種保護策略的重要參考依據(jù)[26]。物種的遺傳多樣性水平影響因素除了地區(qū)間的遺傳信息交流，還可能來源于環(huán)境和基因型引起的不同地區(qū)個體之間的特殊變異。Roy[27]，Liu[28]和Joshi等[29]研究均發(fā)現(xiàn)茶樹不同地區(qū)的遺傳分化水平高于地區(qū)內(nèi)個體的遺傳分化水平，即茶樹的遺傳變異主要來源于地區(qū)之間。而本試驗研究發(fā)現(xiàn)，不僅地區(qū)之間，同一地區(qū)內(nèi)茶樹的遺傳變異也會引起地區(qū)內(nèi)部的個體間差異，模型聚類結果也表明福建省茶樹遺傳結構并不按照地區(qū)差異進行劃分。可見，自然選擇或地理環(huán)境對不同地區(qū)茶樹變異的影響具有一定的平行性，而且這種生活環(huán)境的異質(zhì)化所造成的不同地區(qū)的差異是茶樹主要的變異來源，而作為亞類群，不同品種在其中的影響力較弱。此外，這種地區(qū)間高水平的遺傳變異也可能與較高的基因流有關[30-31]。總而言之，受外界條件干擾，福建省不同地區(qū)茶樹存在高頻率遺傳變異，而這種干擾在品種間的差別可能較小。

3.3 部分地區(qū)茶樹種質(zhì)資源亟需重點保護

遺傳多樣性分析是植物新品種選育的基礎，而不同物種瀕危類型所表現(xiàn)出的遺傳多樣性程度也不同[32-33]。福建省茶樹總Nei遺傳多樣性參數(shù)達到0.224，高于Wachira[34]報道的日本（0.169）、越南（0.194）、斯里蘭卡（0.199）和肯尼亞（0.201）等國茶樹的平均遺傳多樣性水平，福建省茶樹具有更高的遺傳多樣性。此外，Irwin[35]研究發(fā)現(xiàn)，福建省茶樹遺傳漂移阻礙相對較小，存在較高頻率遺傳信息交流。然而不同地區(qū)遺傳多樣性差異較顯著，從大到小排列為南平建甌>寧德福安>南平武夷山>閩侯方山>福州羅源>福州鼓山>福州永泰，且福州羅源、鼓山和永泰地區(qū)與其他地區(qū)的遺傳相似度較低。結合福州地區(qū)茶樹分布實地調(diào)查推斷，遺傳多樣性的豐富與否可能造成不同茶樹品種之間生存、繁殖和適應能力等方面差異從而影響茶樹的空間結構分布。隨著茶樹無性系良種的不斷推廣，地區(qū)特色茶樹品種已逐步被相對單一的無性系良種取代，從而導致地區(qū)內(nèi)部的品種多樣性逐漸喪失。因此，城市化高速發(fā)展的福州地區(qū)是福建省茶樹種質(zhì)資源保護的重點，注重地方品種資源的收集、保存和保護，防止遺傳多樣性的進一步丟失。

今后可利用ISSR分子標記技術，在全省乃至全國范圍內(nèi)收集茶樹種質(zhì)資源，建立省級和國家級優(yōu)良茶樹品種的ISSR指紋圖譜，可以對現(xiàn)有珍稀茶樹種質(zhì)資源進行有效的鑒別和保護，為優(yōu)良茶樹品種的選育以及全國性的茶樹種質(zhì)資源庫的建立提供科學依據(jù)[36]。

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