庹德財(cái) 沈文濤 言普 黎小瑛 周鵬

摘 要 侵染性克隆是研究病毒的重要工具，而偏大的病毒基因組及其在大腸桿菌中的不穩(wěn)定給構(gòu)建侵染性克隆造成很大困難。通常采用插入內(nèi)含子和酵母同源重組等方式可以獲得穩(wěn)定克隆，但本實(shí)驗(yàn)最初利用酵母同源重組系統(tǒng)并未成功構(gòu)建番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）的侵染性克隆。經(jīng)研究證實(shí)，該不穩(wěn)定現(xiàn)象確實(shí)存在于大腸桿菌中，而非酵母和農(nóng)桿菌細(xì)胞。通過改良酵母同源重組方法，成功構(gòu)建了有/無內(nèi)含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2，農(nóng)桿菌注射接種番木瓜均發(fā)病，侵染效率達(dá)64.7%～69.7%。本研究通過酵母同源重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，建立了一種10 d內(nèi)即可穩(wěn)定快速構(gòu)建PLDMV侵染性克隆的E. coli-Free酵母同源重組新方法。該方法對(duì)其他在大腸桿菌中不穩(wěn)定的植物病毒侵染性克隆的構(gòu)建具有重要意義。

關(guān)鍵詞 酵母同源重組；番木瓜畸形花葉病毒；侵染性克??；不穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

A Novel E. coli-Free Method for the Rapid Construction of

Full-Length cDNA Infectious Clone of Papaya leaf distortion mosaic

virus（PLDMV）by Yeast Homologous Recombination System

TUO Decai， SHEN Wentao， YAN Pu， LI Xiaoying， ZHOU Peng*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Infectious full-length clone provides an important research tool for further study of the basic viral biology and pathogenic mechanisms. However， many large viral genomes have been proven difficult to assemble and propagate in Escherichia coli（E. coli）. Many studies have reported that the insertion of introns into viral genome or using yeast homologous recombination method can facilitate the amplification of infectious full-length clones in E. coli， but we did not construct successfully full-length cDNA infectious clones of Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）by yeast homologous recombination system in this initial work. In this study， the unstable phenomenon have been proven only occurred in E. coli， but not in yeast and agrobacterium. Then two types of PLDMV infectious clones were successfully constructed with/without intron 2 by improved yeast homologous recombination method， named p35S-FL and p35S-FL-In2， respectively. Both of the agro-inoculated papaya displayed systemic infections and higher infection efficiency（64.7%-69.7%）. In this work， in order to avoid instability in E. coli， a novel E. coli-free method for the rapid construction of full-length cDNA infectious clone of PLDMV was developed by yeast homologous recombination system in 10 days， and should have broad applications， in particular for the study of highly unstable plant viruses in bacterium.

Key words Yeast homologous recombination； Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； infectious clone； instability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.019

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV）屬于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬病毒，是一種新的威脅番木瓜種植業(yè)的病毒病害，近年來發(fā)病率逐年遞增，且存在向全球蔓延的趨勢[1-2]。PLDMV是單分體正義（+）單鏈ssRNA線狀病毒，病毒顆粒平均長約750～825 nm[3]。PLDMV基因組由約10 153個(gè)核苷酸組成（不含3′端poly A），5′端和3′端各有1個(gè)非編碼區(qū)，包含1個(gè)大的開放閱讀框（ORF）和1個(gè)小的ORF（pipo），大的ORF編碼3 269個(gè)氨基酸的多聚蛋白，經(jīng)多聚蛋白自身的蛋白酶水解加工產(chǎn)生10個(gè)成熟蛋白（P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP）[1]。目前，有關(guān)PLDMV基因功能、致病機(jī)理、傳播媒介、寄主范圍等研究較少，從而使PLDMV的防治面臨巨大困難。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人類發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒病原的能力得到巨大提升。例如，2009～2015年，研究者們已相繼從植物上新發(fā)現(xiàn)4種類病毒，49種RNA病毒和DNA病毒[4]。為此，需迫切開展新病毒的基因功能、病毒與宿主、病毒與傳播媒介互作等相關(guān)研究工作，而病毒侵染性克隆作為上述病毒研究的必備工具，其構(gòu)建逐漸發(fā)展為病毒研究實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技能，也成為限制病毒研究的關(guān)鍵因素[5]。雖然目前構(gòu)建侵染性克隆的技術(shù)方法已取得較大進(jìn)步，但其構(gòu)建仍然耗時(shí)耗力，還沒有一種通用的能適合所有病毒的方法，尤其是對(duì)基因組較大的病毒的克隆，而且病毒克隆在大腸桿菌（Escherichia coli， E. coli）中普遍存在的不穩(wěn)定性問題[6-8]，導(dǎo)致侵染性克隆的構(gòu)建面臨巨大挑戰(zhàn)和困難。為了提高病毒基因組序列克隆在E. coli中的穩(wěn)定性，有采用低拷貝載體[9-10]、降低培養(yǎng)溫度[11]、接種前進(jìn)行體外連接[12]、插入內(nèi)含子[6-7， 13-15]及酵母同源重組[14， 16-18]等方法和策略。目前，后2種方法可能是應(yīng)用較多且最有效的方式。本研究室在之前利用In-Fusion法構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄的PLDMV全長cDNA侵染性克隆時(shí)發(fā)生缺失、突變、重組等不穩(wěn)定現(xiàn)象，通過插入內(nèi)含子的方式獲得其在E. coli中穩(wěn)定的克隆[19]。但插入內(nèi)含子的方法可能受病毒種類、插入位點(diǎn)、內(nèi)含子種類及數(shù)量等的影響，從而使其應(yīng)用受到限制。而酵母同源重組可能是目前大片段DNA體內(nèi)拼接克隆最強(qiáng)大的分子克隆技術(shù)，Gibson等[20]報(bào)道了一步法可將25個(gè)重疊DNA大片段在酵母細(xì)胞中成功拼接獲得完整的支原體基因組。由此可見，酵母重組方法完全可以滿足病毒學(xué)研究的需要，但目前利用酵母同源重組系統(tǒng)構(gòu)建病毒侵染性克隆的策略，都是將病毒全長基因組序列與酵母-大腸桿菌穿梭載體或者酵母-大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體經(jīng)酵母同源重組后，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制、增殖，由于病毒序列可能對(duì)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，從而仍然會(huì)導(dǎo)致病毒克隆在E. coli中的極不穩(wěn)定現(xiàn)象。因此，本研究為了解決病毒序列克隆在E. coli中不穩(wěn)定性，通過對(duì)酵母同源重組系統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，避開E. coli，建立了不轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. coli-Free）的酵母同源重組系統(tǒng)，并成功構(gòu)建了適用于農(nóng)桿菌注射接種的PLDMV全長cDNA侵染性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 番木瓜畸形花葉病毒海南分離物（PLDMV-DF）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，并完成其全長基因組序列測定（GenBank登錄號(hào)：JX974555）[1]；PLDMV-DF的體外轉(zhuǎn)錄侵染性克隆pT7-PLDMV-In2本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建保存[19]。

1.1.2 試劑 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒、E. coli HST08 Premium化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、Trans10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trizol、Stbl3化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒Yeast Plasmid Mini Kit購自O(shè)MEGA公司；Phusion超保真DNA聚合酶購自NEB公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體及菌株 用于酵母同源重組系統(tǒng)的酵母-大腸桿菌穿梭載體Yeast-pBS70T、雙元載體pBIN61、酵母菌株YPH501和農(nóng)桿菌C58C1菌株均由法國Thierry Candresse實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)[18]。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)PLDMV-DF的全長基因組序列，參考Youssef等[18]文獻(xiàn)中報(bào)道的酵母同源重組的方法，利用Vector NTI Advance 11軟件設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所需引物（表1）。引物合成和測序均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2.2 酵母同源重組構(gòu)建體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF侵染性克隆 為了驗(yàn)證在酵母同源重組系統(tǒng)中，PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆分別在酵母、大腸桿菌和農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采取在第3 709 nt位點(diǎn)插入內(nèi)含子intron 2和不插入內(nèi)含子兩種方式構(gòu)建適用農(nóng)桿菌接種的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（圖1）。

（1）無內(nèi)含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的構(gòu)建。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建PLDMV-DF體外轉(zhuǎn)錄侵染性克隆時(shí)獲得的第4 998 nt位腺苷酸發(fā)生缺失突變的質(zhì)粒pT7-PLDMV4[19]為模板，分別用引物對(duì)PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3進(jìn)行PCR擴(kuò)增病毒基因片段1F和1R；用引物對(duì)PLDPCR2F/PCR2R和PCR3F/PCR3R分別從質(zhì)粒pBin61上PCR擴(kuò)增載體片段2和3；用引物對(duì)PCR4F/PLDPCR4R從質(zhì)粒Yeast-pBS70T上PCR擴(kuò)增載體片段4，本研究中用于載體構(gòu)建的PCR反應(yīng)均使用Phusion超保真DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物用0.8%普通瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并回收其目的片段。將5個(gè)具有25～32 bp重疊區(qū)的DNA片段1F、1R、2、3和4用醋酸鋰法化學(xué)轉(zhuǎn)化自制的酵母YPH501感受態(tài)細(xì)胞，在色氨酸缺陷型的SD平板上篩選。后續(xù)的克隆鑒定時(shí)，采取以下2種方法：

方法一（圖2-A），主要是參照Youssef等[18]文獻(xiàn)中報(bào)道的方法，基本操作流程是通過收集SD缺陷型平板上生長的所有酵母菌落，并提取混合菌落的酵母質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，比較其生長情況及在不同大腸桿菌中的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化E. coli后進(jìn)行PCR和測序鑒定，測序結(jié)果正確的克隆電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細(xì)胞并直接進(jìn)行侵染性分析。

方法二（圖2-B），是對(duì)Youssef等[18]文獻(xiàn)中方法的改進(jìn)和優(yōu)化，總體流程是經(jīng)酵母同源重組后，為了驗(yàn)證PLDMV-DF全長克隆在酵母中的穩(wěn)定性，先菌液PCR、質(zhì)粒PCR和測序鑒定出酵母的陽性單克隆，再用酵母質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后鑒定出陽性農(nóng)桿菌克隆用于后續(xù)侵染性分析，關(guān)鍵是不轉(zhuǎn)化E. coli這一步驟。首先，從轉(zhuǎn)化的酵母平板上挑取單菌落培養(yǎng)后，用病毒5′端引物對(duì)pldmv550F/pldmv1700R進(jìn)行菌液PCR檢測，然后對(duì)檢測出的陽性克隆提取酵母質(zhì)粒，再用擴(kuò)增病毒全長基因組的引物對(duì)pldmv1F/pldmv3R進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，并對(duì)酵母質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。由于酵母質(zhì)?？截悢?shù)低，需用約50～100 mL的酵母菌液抽提質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒用乙醇沉淀濃縮后送公司測序（測通）。測序正確的克隆，直接用濃縮后的酵母質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后在含利福平、卡那霉素和慶大霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的平板上挑取單菌落進(jìn)行PCR和測序鑒定，農(nóng)桿菌菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定方法同前面酵母克隆的鑒定，農(nóng)桿菌質(zhì)粒的提取使用大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒。為了驗(yàn)證病毒序列在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，對(duì)質(zhì)粒PCR鑒定正確的克隆進(jìn)行測序分析。由于農(nóng)桿菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù)很低，需大量抽提農(nóng)桿菌質(zhì)粒后用乙醇濃縮沉淀，然后進(jìn)行測序分析。測序正確的克隆即可進(jìn)行下一步接種侵染性分析實(shí)驗(yàn)。

（2）插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的構(gòu)建。以已構(gòu)建含內(nèi)含子intron 2的體外轉(zhuǎn)錄PLDMV-DF侵染性克隆pT7-PLDMV-In2[19]為模板，用引物對(duì)PLDPCR1F/FLPLD3擴(kuò)增含intron 2的PLDMV-DF全長基因組片段1。將片段1和前面構(gòu)建克隆p35S-FL時(shí)獲得的3個(gè)載體片段（2、3和4）共同轉(zhuǎn)化酵母YPH501感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行酵母重組（方法同前）。后續(xù)的克隆鑒定時(shí)，也采用2種方法：為了驗(yàn)證插入內(nèi)含子是否在E. coli中穩(wěn)定，第1種方法采用與前面方法一相同（圖2-A），但僅轉(zhuǎn)化E. coli HST08 Premium感受態(tài)細(xì)胞；第2種方法是對(duì)前面方法二的優(yōu)化（圖2-C），根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PLDMV-DF全長cDNA克隆在酵母、農(nóng)桿菌中較穩(wěn)定，為了省去繁瑣的酵母、農(nóng)桿菌克隆鑒定過程，利用酵母混合質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌克隆經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR或測序鑒定正確后即可用于后續(xù)接種實(shí)驗(yàn)。使用內(nèi)含子intron 2插入位點(diǎn)兩端的引物pldmv3600F/pldmv4444R進(jìn)行菌液PCR檢測；質(zhì)粒PCR鑒定同上；對(duì)農(nóng)桿菌質(zhì)粒用引物對(duì)PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3將病毒全長基因組分成2個(gè)大片段PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，測序正確的克隆用于接種番木瓜。

1.2.3 PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2的侵染性分析 農(nóng)桿菌注射接種的方法主要參考Youssef等[18]文獻(xiàn)中報(bào)道的方法，接種生長至20～30 cm番木瓜的第3、4片葉（葉片長約1 cm為第1片葉）的下表皮。接種后的番木瓜苗置于25 ℃黑暗8 h和28 ℃光照16 h的溫室條件下生長，每周觀察其病癥發(fā)生情況，在接種第20、40、60天，用數(shù)碼相機(jī)拍照。用PLDMV-DF感染的番木瓜病葉摩擦接種健康番木瓜植株作為陽性對(duì)照組，陰性對(duì)照組為注射接種含空載體pBIN61的農(nóng)桿菌，每個(gè)處理組至少接種10～12株番木瓜植株，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

注射接種實(shí)驗(yàn)的第60天，取新長出的第2片或第3片葉約50 mg，用TRizol法提取植物總RNA，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，進(jìn)行RT-PCR檢測。每株苗用引物對(duì)pldmv550F/pldmv1700R、pldmv3600F/pldmv4444R分別對(duì)PLDMV基因組的5′端P1基因和部分P3及部分CI基因序列進(jìn)行RT-PCR檢測，引物對(duì)pldmv3600F/pldmv4444R用于檢測PLDMV基因組的第3 709 nt位點(diǎn)是否還含有插入的內(nèi)含子intron 2序列，并對(duì)部分樣品的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行序列測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無內(nèi)含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增獲得用于酵母同源重組的2個(gè)病毒基因組片段1F、1R和3個(gè)載體片段2、3、4（圖3-B），以上5個(gè)DNA片段經(jīng)酵母同源重組后（圖3-A）。當(dāng)采取方法一時(shí)（圖2-A），混合酵母質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，各平板的生長情況與筆者之前構(gòu)建其體外轉(zhuǎn)錄侵染性克隆類似。各轉(zhuǎn)化平板菌落生長較慢，30 °C條件下需要培養(yǎng)24～48 h才可見菌落長出，菌落數(shù)達(dá)40～100個(gè)。經(jīng)菌液PCR發(fā)現(xiàn)，插入到載體上的PLDMV-DF全長基因組序列均發(fā)生不同程度的DNA片段缺失、重組、突變等不穩(wěn)定現(xiàn)象（結(jié)果未提供）。結(jié)果從轉(zhuǎn)化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3這4種感受態(tài)細(xì)胞的平板上未鑒定出含有PLDMV-DF全長cDNA插入片段的克隆，而從轉(zhuǎn)化E. coli HST08 Premium感受態(tài)細(xì)胞的平板挑取40個(gè)克隆，菌液PCR鑒定出10個(gè)克隆含有PLDMV-DF全長基因組插入片段，但隨機(jī)挑選其中5個(gè)克隆進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)病毒PLDMV-DF全長基因組序列均發(fā)生點(diǎn)突變或堿基缺失突變（結(jié)果未提供）。結(jié)果表明，參照Youssef等[18]文獻(xiàn)中報(bào)道的方法，酵母重組后轉(zhuǎn)化E. coli很難獲得正確的PLDMV-DF全長cDNA克隆。同時(shí)也表明，E. coli HST08 Premium感受態(tài)細(xì)胞可能比其他4種感受態(tài)更適合較長的病毒基因序列的克隆。由于獲得的克隆均有突變，故沒有進(jìn)一步將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌用于后續(xù)侵染性分析實(shí)驗(yàn)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以前構(gòu)建PLDMV-DF體外轉(zhuǎn)錄侵染性克隆pT7-PLDMV[19]的結(jié)果均表明，這種不穩(wěn)定現(xiàn)象可能發(fā)生在E. coli中，因此，筆者嘗試避免轉(zhuǎn)化E. coli，酵母同源重組后直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。同時(shí)為了探究PLDMV-DF全長基因組序列在酵母和農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，從而分別對(duì)酵母重組和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)酵母同源重組系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，當(dāng)采用改進(jìn)后的方法二時(shí)（圖2-B），對(duì)轉(zhuǎn)化的酵母平板進(jìn)行單克隆鑒定，54個(gè)單克隆經(jīng)菌液PCR初步鑒定出3個(gè)克隆可能為陽性克?。ńY(jié)果未提供），經(jīng)質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒測序鑒定，這3個(gè)克隆的測序結(jié)果完全正確（結(jié)果未提供）。結(jié)果表明PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆在酵母細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，不穩(wěn)定現(xiàn)象主要發(fā)生在E. coli細(xì)胞中。挑選其中1個(gè)測序正確克隆的酵母質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1，獲得42個(gè)克隆，經(jīng)初步菌液PCR鑒定出3個(gè)克隆可能為陽性克?。ńY(jié)果未提供），其中1個(gè)克隆搖菌失敗，另外2個(gè)克隆提取質(zhì)粒后PCR鑒定和測序均正確（結(jié)果未提供），即利用改良的酵母同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了無內(nèi)含子的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆p35S-FL，并將這2個(gè)克隆用于后續(xù)侵染性分析且分別命名為：p35S-FL39-12和p35S-FL39-34。

2.2 插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的構(gòu)建

從pT7-FL-In2質(zhì)粒上經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得在第3 709 nt位點(diǎn)插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF全長基因組片段1（圖4-B），片段1與前面已獲得的片段2、3、4轉(zhuǎn)化酵母YPH501進(jìn)行酵母同源重組（圖4-A），獲得較多的酵母菌落（超過100個(gè)克?。?，收集所有菌落提取酵母混合質(zhì)粒。

當(dāng)采用第1種方法時(shí)，酵母混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli HST08 Premium長出多達(dá)100～200個(gè)克隆，隨機(jī)挑取22個(gè)克隆經(jīng)菌液PCR鑒定均可能為陽性克隆（表2），對(duì)其中1個(gè)克隆測序，結(jié)果正確（結(jié)果未提供）。測序正確的克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后隨機(jī)挑取28個(gè)克隆經(jīng)菌液PCR鑒定出27個(gè)克隆可能為陽性克隆（表2），對(duì)其中1個(gè)克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR和測序鑒定均正確（表2）。

當(dāng)采用第2種方法時(shí)，利用酵母混合質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌隨機(jī)挑取24個(gè)克隆經(jīng)菌液PCR鑒定出22個(gè)克隆可能為陽性克隆（表2），對(duì)其中1個(gè)克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR和測序鑒定，結(jié)果均正確（表2）。即利用原酵母同源重組系統(tǒng)和改良后的系統(tǒng)都成功構(gòu)建了適用于農(nóng)桿菌接種的含有內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆p35S-FL-In2，并將以上2種方法構(gòu)建獲得的測序正確的2個(gè)克隆用于后續(xù)侵染性分析且分別命名為：p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3。

2.3 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF侵染性克隆注射接種番木瓜的病癥表現(xiàn)

體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL（農(nóng)桿菌克隆p35S-FL39-12和p35S-FL39-34）和含內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2（農(nóng)桿菌克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3）農(nóng)桿菌注射接種番木瓜的結(jié)果表明：克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3接種番木瓜植株的癥狀表現(xiàn)與用PLDMV-DF感染的番木瓜病葉接種的陽性對(duì)照組一致，在接種20 d后，葉片出現(xiàn)輕微的花葉，葉脈開始褪綠及黃化，以及葉片產(chǎn)生黃綠相間的嵌紋斑（圖5-A）。在接種40 d后，葉片逐漸出現(xiàn)皺縮畸形，葉片上有綠島（green-island）形成（圖5-B）。在接種60 d后，隨著癥狀的嚴(yán)重，會(huì)出現(xiàn)完全畸形葉、雞爪形，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)葉片完全退化，僅剩下主葉脈的絲狀葉（圖5-C）。而接種轉(zhuǎn)化空載體pBIN61的農(nóng)桿菌陰性對(duì)照組在接種60 d后仍未表現(xiàn)出任何病癥（圖5-A、C）。

2.4 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF侵染性克隆注射接種番木瓜后的RT-PCR檢測及侵染效率分析

接種60 d后，對(duì)接種過的番木瓜植株分別用PLDMV-DF基因組2個(gè)基因片段引物進(jìn)行RT-PCR檢測，4個(gè)侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3與用番木瓜病葉接種的陽性對(duì)照組都能檢測出1 151 bp和845 bp的DNA條帶（圖6，泳道1～18），而轉(zhuǎn)化空載體pBIN61的農(nóng)桿菌注射接種的陰性對(duì)照組未檢測到（圖6，泳道19～20），表明注射接種含空載體的農(nóng)桿菌不能侵染番木瓜植株。而同時(shí)RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，均為PLDMV-DF病毒基因組序列，而且在第3 709 nt位點(diǎn)無內(nèi)含子intron 2插入，表明克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3在侵染后，利用番木瓜宿主系統(tǒng)可以識(shí)別并剪接插入在PLDMV-DF基因組第3 709 nt位點(diǎn)的內(nèi)含子intron 2，使子代病毒不再含有內(nèi)含子序列。經(jīng)病癥觀察、發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)及RT-PCR檢測，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中利用改良的酵母重組系統(tǒng)構(gòu)建的4個(gè)適用農(nóng)桿菌注射接種的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3都具有侵染性，能成功侵染番木瓜，侵染效率達(dá)64.7%～69.7%，且病癥觀察的發(fā)病率與RT-PCR檢測結(jié)果一致（表3）。

3 討論

病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能和病毒與宿主互作的重要工具，無論是研究植物病毒還是動(dòng)物病毒，無論是DNA病毒還是RNA病毒，其侵染性克隆的構(gòu)建已發(fā)展為病毒研究實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技能，也成為開展病毒深入研究工作的限制因素[5]，而病毒全長基因組克隆在E. coli中存在的不穩(wěn)定性問題是病毒侵染性克隆構(gòu)建面臨的最大困難和挑戰(zhàn)[6-8]。為了克服病毒基因序列在E. coli中的不穩(wěn)定性，在侵染性克隆構(gòu)建時(shí)通常采用低拷貝載體[9-10]、降低培養(yǎng)溫度[11]、接種前進(jìn)行體外連接[12]、插入內(nèi)含子[6-7， 13-15]及酵母同源重組[14， 16-18]等方式，但還沒有一種能適合所有病毒的通用方法。筆者也通過在P3基因插入內(nèi)含子，利用In-Fusion法成功構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆[19]，但插入內(nèi)含子的方法可能受病毒種類、插入位點(diǎn)、內(nèi)含子種類及數(shù)量等的影響，從而使其應(yīng)用受到限制[19]。而且體外轉(zhuǎn)錄的侵染性克隆需要昂貴的體外轉(zhuǎn)錄試劑，不便于后續(xù)研究應(yīng)用。于是，本研究嘗試?yán)媒湍竿粗亟M系統(tǒng)快速構(gòu)建適用于農(nóng)桿菌注射接種的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PLDMV-DF侵染性克隆。但研究發(fā)現(xiàn)，采用原酵母同源重組系統(tǒng)在酵母細(xì)胞中完成重組拼接后，再轉(zhuǎn)化E. coli細(xì)胞仍然存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，并不能獲得正確的克隆。而在PLDMV-DF的P3基因插入內(nèi)含子時(shí)，經(jīng)酵母重組后轉(zhuǎn)化E. coli能獲得測序正確的克隆，而且酵母重組后的克隆和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的克隆測序結(jié)果表明，不穩(wěn)定現(xiàn)象僅發(fā)生在E. coli中，而非酵母細(xì)胞和農(nóng)桿菌細(xì)胞。但Youssef等[18]利用原酵母同源重組系統(tǒng)也成功獲得適用農(nóng)桿菌接種的蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄侵染性克隆，可能不同的病毒在E. coli中的穩(wěn)定性存在著差異，不過從36個(gè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切正確的E. coli克隆中僅鑒定出1個(gè)有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E. coli細(xì)胞同樣存在著不穩(wěn)定性。因此，本研究為了克服病毒基因組序列克隆在E. coli中的不穩(wěn)定性，通過對(duì)原酵母同源重組系統(tǒng)進(jìn)行改良，采用避免轉(zhuǎn)化E. coli細(xì)胞的策略，將酵母同源重組獲得的混合酵母質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（圖2-C），10 d內(nèi)即可快速、便捷的構(gòu)建穩(wěn)定的適用于農(nóng)桿菌注射接種的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆。同時(shí)，該構(gòu)建策略為其他在E. coli細(xì)胞中不穩(wěn)定的植物病毒侵染性克隆的構(gòu)建提供了一種有效的新方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Tuo D， Shen W， Yan P， et al. Complete genome sequence of an isolate of papaya leaf distortion mosaic virus from commercialized PRSV-resistant transgenic papaya in China[J]. Acta Virologica， 2013， 57（4）： 452-455.

[2] Tuo D， Shen W， Yang Y， et al. Development and validation of a multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of three papaya viruses[J]. Viruses， 2014， 6（10）： 3 893-3 906.

[3] Kawano S and Yonaha T. The occurrence of papaya leaf-distortion mosaic virus in Okinawa[J]. Technical Bulletin of FFTC， 1992， 132： 13-23.

[4] Wu Q， Ding S W， Zhang Y， et al. Identification of viruses and viroids by next-generation sequencing and homology-dependent and homology-independent algorithms[J]. Annual Review of Phytopathology， 2015， 53： 425-444.

[5] Nagyová A， Subr Z. Infectious full-length clones of plant viruses and their use for construction of viral vectors[J]. Acta virologica， 2007， 51（4）： 223-237.

[6] Gao R， Tian Y P， Wang J， et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus（genus Potyvirus）[J]. Virus Research， 2012， 169（1）： 276-281.

[7] Lopez-Moya J J， Garcia J A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment[J]. Virus Research， 2000， 68（2）： 99-107.

[8] Yamshchikov V， Mishin V， Cominelli F. A new strategy in design of（+）RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli[J]. Virology， 2001， 281（2）： 272-280.

[9] Flasinski S， Gunasinghe U， Gonzales R A， et al. The cDNA sequence and infectious transcripts of peanut stripe virus[J]. Gene， 1996， 171（2）： 299-300.

[10] Hurrelbrink R J， Nestorowicz A， McMinn P C. Characterization of infectious Murray Valley encephalitis virus derived from a stably cloned genome-length cDNA[J]. Journal of General Virology， 1999， 80： 3 115-3 125.

[11] Joshi A， Jeang K T. Reduction in growth temperature minimizes instability of large plasmids containing HIV-1 proviral genomes[J]. Biotechniques， 1993， 14（6）： 884-886， 880.

[12] Fakhfakh H， Vilaine F， Makni M， et al. Cell-free cloning and biolistic inoculation of an infectious cDNA of potato virus Y[J]. Journal of General Virology， 1996， 77： 519-523.

[13] Yang S J， Revers F， Souche S， et al. Construction of full-length cDNA clones of lettuce mosaic virus（LMV） and the effects of intron-insertion on their viability in Escherichia coli and on their infectivity to plants[J]. Arch Virologica， 1998， 143（12）： 2 443-2 451.

[14] Desbiez C， Chandeysson C， Lecoq H， et al. A simple， rapid and efficient way to obtain infectious clones of potyviruses[J]. J Virol Methods， 2012， 183（1）： 94-97.

[15] Johansen I E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（22）： 12 400-12 405.

[16] Fernandez-Delmond I， Pierrugues O， de Wispelaere M， et al. A novel strategy for creating recombinant infectious RNA virus genomes[J]. Journal of Virological Methods， 2004， 121（2）： 247-257.

[17] Polo S， Ketner G， Levis R， et al. Infectious RNA transcripts from full-length dengue virus type 2 cDNA clones made in yeast[J]. Journal of virology， 1997， 71（7）： 5 366-5 374.

[18] Youssef F， Marais A， Faure C， et al. Strategies to facilitate the development of uncloned or cloned infectious full-length viral cDNAs： Apple chlorotic leaf spot virus as a case study[J]. Virology Journal， 2011， 8： 488.

[19] Tuo D， Shen W， Yan P， et al. Rapid construction of stable infectious full-length cDNA clone of Papaya leaf distortion mosaic virus using In-Fusion cloning[J]. Viruses， 2015， 7（12）： 6 241-6 250.

[20] Gibson D G， Benders G A， Axelrod K C， et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105（51）： 20 404-20 409.