周子燕 蘇衛(wèi)華 胡本進(jìn) 胡飛 徐麗娜 陳浩梁 李昌春

摘要[目的]探討pH、溫度環(huán)境因素對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1抑菌效果的影響以及井岡霉素A降低芽孢消解作用，為提高其生物活性提供理論依據(jù)。[方法]研究不同溫度、pH條件下多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果，測(cè)定 DN-1菌株和井岡霉素A復(fù)配對(duì)其細(xì)胞消解率的影響。[結(jié)果] pH在6.0～8.0時(shí)DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病菌均表現(xiàn)出較好的抑制效果，pH為7.0時(shí)抑菌率最佳；溫度在15～40 ℃時(shí)該菌對(duì)水稻紋枯病菌均能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，溫度在35 ℃時(shí)抑菌效果最強(qiáng)；在DN-1菌株配成的水懸液中添加不同比例的井岡霉素A，都有降低細(xì)胞消解速率的作用。[結(jié)論]溫度和pH對(duì)DN-1菌株抑制水稻紋枯病菌的效果均有影響；井岡霉素A可延長(zhǎng)含DN-1生物農(nóng)藥的貨架期。

關(guān)鍵詞多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1；pH；溫度；抑菌效果；井岡霉素A

中圖分類(lèi)號(hào)S476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）09-0137-02

Effects of Several Factors on Activity of Paenibacillus polymyxa DN-1

ZHOU Ziyan，SU Weihua，HU Benjin et al

（Institute of Plant Protection and Quality and Safety of Agricultural Products，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）

Abstract[Objective] Effects of several factors like pH and temperature on activity of Paenibacillus polymyxa DN1 and decreasing digestion rate of DN1 strain by validamycin A were studied to provide reference for improving biological activity of DN1 strain.[Method] We investigated the effect of pH，temperature and environmental factors on the inhibitory effect of Paenibacillus polymyxa DN1，and determined effect of validamycin A on digestion rate of DN1.[Result] When pH was from 6.0 to 8.0，the DN1 strain had good inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the pH was 7.0，the DN1 strain had the best inhibitory rate.When the temperature was from 15 ℃ to 40 ℃，the DN1 strain showed strong inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the temperature was 35 ℃，the inhibitory effect was the strongest.Adding different proportions of DN1 strains with the agent of validamycin A had reduced digestion rate of Bacillus.[Conclusion] Both temperature and pH have effect on inhibition of the DN1 strain to Rhizoctonia solani，and validamycin A can prolong the shelf life of biological pesticide containing DN1.

Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；pH；Temperature；Inhibitory effect；Validamycin A

多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1是安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所篩選的用于防治水稻紋枯病新的優(yōu)良拮抗菌株。該菌和井岡霉素A的組合物對(duì)水稻紋枯病有較好的防治效果，田間施用量為120億芽孢/L時(shí)，多年田間防治紋枯病效果均在75%以上[1-2]。

Haggag等[3]發(fā)現(xiàn)多粘類(lèi)芽孢桿菌菌懸液對(duì)花生根腐病有很好的防治作用。多粘類(lèi)芽孢桿菌還可防治辣椒疫病[4]、花生莖腐病[5]和西瓜枯萎病[6]等植物病害，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)病害也有一定防治效果。作為一種植物根際促生細(xì)菌，多粘類(lèi)芽抱桿菌具有許多有益的農(nóng)用功能，包括固氮[7]、溶磷[8]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[9]以及抑制植物病原菌的生長(zhǎng)[10]等。因此，多粘類(lèi)芽孢桿菌在植物病害防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于pH、溫度等對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)及芽孢量的影響文獻(xiàn)報(bào)道較多，但不同pH、溫度條件下生防菌株對(duì)紋枯病菌的抑制效果報(bào)道較少。鑒于此，筆者以DN-1菌株為研究對(duì)象，考察不同溫度、pH條件對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果，同時(shí)測(cè)定了該菌和井岡霉素A復(fù)配后對(duì)其細(xì)胞消解率的影響，以期為提高其生物活性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1，于青島海域海泥中分離（GenBank 登錄號(hào)：KM891591），由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所保存。水稻紋枯病病菌由田間分離并鑒定，經(jīng)轉(zhuǎn)接、純化培養(yǎng)后供試。

1.1.2供試培養(yǎng)基。LB 培養(yǎng)基[11]用于DN-1菌株活化；PDA 培養(yǎng)基[12]用于水稻紋枯病菌培養(yǎng)及平板對(duì)峙試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1多粘類(lèi)芽孢桿菌 DN-1的芽孢液制備與測(cè)定方法。

將經(jīng) LB 培養(yǎng)基活化后的DN-1菌株接入種子培養(yǎng)液（PD）中，培養(yǎng) 24 h 獲得種子液，然后按接種量 10%轉(zhuǎn)至固體培養(yǎng)基（配方專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?201410339808.2）中，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng) 72 h后，獲得芽孢母粉，將母粉以0.1 g/mL的量加滅菌水稀釋后作為芽孢母液。

1.2.2溫度對(duì)DN-1菌株抑制病菌效果的影響測(cè)定。鑒于DN-1菌株在不同溫度下生長(zhǎng)的速率有差異，為考察不同溫度下該菌對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果， 分別在15、25、30、35、40 ℃下測(cè)定DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果。取1 mL多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株母液加入500 mL培養(yǎng)基中，用PDA培養(yǎng)基配制成藥液平板，每皿約10 mL，同時(shí)設(shè)置無(wú)菌平板對(duì)照（CK），每處理4皿，4次重復(fù)。

1.2.3pH對(duì)DN-1菌株抑制病菌效果的影響測(cè)定。目標(biāo)DN-1菌株發(fā)酵適宜的pH測(cè)定為6.5，為進(jìn)一步考察該菌在不同pH條件下對(duì)水稻紋枯的抑制效果，用稀HCl或NaOH溶液將LB液體培養(yǎng)基初始pH調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5個(gè)不同的初始值處理，每處理4皿，4次重復(fù)。

1.2.4井岡霉素A添加量對(duì)DN-1菌株細(xì)胞消解率的影響測(cè)定。

將20億的母粉和60%井岡霉素A（有效量）以質(zhì)量比1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1共4個(gè)比例混合，取各比例混配物及芽孢桿菌母粉1 g于加100 mL水的三角瓶中，常溫保存，重復(fù)4次，分別在1、7、14、30、60 d時(shí)測(cè)定三角瓶水懸液中DN-1菌株細(xì)胞總量，計(jì)算細(xì)胞消解率。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)DN-1菌株抑制病菌效果的影響

由圖1可知，溫度在15、25、30、35、40 ℃時(shí)，DN-1菌株抑制水稻紋枯病效果分別為60.35%、69.31%、73.56%、89.13%和85.22%，15 ℃時(shí)該菌對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果僅有6035%，隨著溫度的升高目標(biāo)菌株對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果顯著提高，當(dāng)溫度達(dá)35 ℃時(shí)，該菌對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果最佳，達(dá)89.13%，進(jìn)一步升高溫度，該菌對(duì)水稻紋枯病的抑制效果下降，溫度40 ℃時(shí)該菌對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率下降到85.22%。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度在15～40 ℃時(shí)該菌對(duì)水稻紋枯病菌均有較好的抑菌效果， 35 ℃時(shí)該菌對(duì)水稻紋枯病的抑菌效果最強(qiáng)。

2.2pH對(duì)DN-1菌株抑制病菌效果的影響

由圖2可知，當(dāng)pH為6.0～8.0時(shí)，DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病的抑菌率分別為73.18%、85.16%、85.90%、80.26%、75.15%，pH為7.0時(shí)，DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病的抑菌率最高，隨后，pH升高，DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病的抑菌率顯著下降。由此可見(jiàn)，pH在6.5～7.5時(shí)DN-1菌株對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果較好，pH為7.0時(shí)抑菌率最高。

2.3井岡霉素A對(duì)DN-1菌株消解率的影響

由圖3可知，多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株在水中不添加任何物質(zhì)時(shí)，60 d后自行消解率為12.06%，但芽孢桿菌：井岡霉素A的量為0.125∶1時(shí)，即添加井岡霉素A的量為1.25%時(shí)，60 d后DN-1菌株細(xì)胞消解率為9.29%；隨著添加井岡霉素A量的增加DN-1菌株細(xì)胞消解率不斷降低；井岡霉素A添加量和DN-1菌株量為1∶1時(shí)，即井岡霉素A的添加量為10%時(shí)，60 d后DN-1菌株細(xì)胞消解率最低，為5.03%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在DN-1菌株懸浮液中添加井岡霉素A，可有效降低其細(xì)胞的消解率。

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，溫度和pH對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株抑制水稻紋枯病菌的效果均有影響。菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成都需要在一定的溫度下進(jìn)行，溫度是發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)與產(chǎn)生芽孢的主要環(huán)境影響因素之一。pH 主要通過(guò)改變菌體的膜滲透性、細(xì)胞膜電荷及物質(zhì)的離子化程度來(lái)影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響菌株的芽孢產(chǎn)量，進(jìn)而影響DN-1菌株對(duì)病原菌的抑制效果。在多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株懸浮液中添加井岡霉素A可有效降低其細(xì)胞消解率，添加的60%井岡霉素A是水鏈霉菌代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)過(guò)程也是通過(guò)培養(yǎng)基發(fā)酵而來(lái)，其中可能殘存菌株或培養(yǎng)基成分，可為DN-1菌株提供營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而使菌株在混合液中細(xì)胞的消解減緩。pH在6.0～7.0、溫度在15～40 ℃時(shí)多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株均能有效地抑制水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)，以pH中性、溫度35 ℃時(shí)抑菌效果最強(qiáng)；在多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株水懸液中添加井岡霉素A可有效地延緩菌株細(xì)胞的消解，DN-1菌株和井岡霉素A復(fù)配后可延長(zhǎng)該生物農(nóng)藥的貨架期，為人們將多粘類(lèi)芽孢桿菌DN-1菌株與井岡霉素A復(fù)配形成性能穩(wěn)定的生物農(nóng)藥指明了方向，多年的田間試驗(yàn)結(jié)果也和該研究結(jié)論相吻合。

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