姚艷玲

摘要[目的]比較不同聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)在食品源性分析中的應用，分析引物、熒光染料和探針的特點及其發(fā)展前景。[方法]介紹PCR、熒光定量PCR技術(shù)，比較該技術(shù)及熒光標記基團的特性，及其在食品源性成分鑒定方面的實際應用。[結(jié)果]通過完善DNA提取方法、優(yōu)化反應體系、設計特異性引物或探針均能有效提高PCR檢測的靈敏度及準確性。[結(jié)論]采用PCR、熒光定量PCR技術(shù)能有效地實現(xiàn)食品中源性成分鑒定，且方法具有高靈敏度、高特異性、高效率等優(yōu)勢，能滿足實驗室對食品中源性成分的檢測分析。

關(guān)鍵詞聚合酶鏈式反應；熒光定量聚合酶鏈式反應；源性成分

中圖分類號TS207.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）09-0098-03

Application of Polymerase Chain Reaction in Food Derived Materials Determination

YAO Yanling

（Jiaxing Testing Institute for Food and Drug Control，Jiaxing，Zhejiang 314001）

Abstract[Objective] The application of different polymerase chain reactions（PCRs） in food derived materials′ determination were compared，in order to analyze the diversification and prospect of the primer，dye and probe in PCR.[Method] The techniques of PCR and fluorogenic quantitative PCR were introduced，and the characters and the applications of these techniques in the determination of food derived materials were compared.[Result] The sensitivity and availability of the technology of PCR can be improved by improving extraction methods of DNA，optimizing the reaction systems，and designing the distinct primes or probes.[Conclusion] The technologies of PCR and fluorogenic quantitative PCR can be used in the determinations of food derived materials，and they have the characteristics of sensitive，efficient and specific.

Key wordsPolymerase chain reaction；Fluorogenic quantitative PCR；Derived materials

近年來，食品中摻假、造假事件屢見不鮮，以鴨肉代替牛羊肉，用果葡糖漿充當蜂蜜，以海藻酸鈉、明礬、明膠等為主要原料制作的假雞蛋，用地溝油代替食用植物油等事件屢遭曝光，卻屢禁不止。為了追求更高的商業(yè)利益，制造商不惜鋌而走險，不僅破壞了市場消費信譽，降低了人們對食品安全的信心，很大程度上也增加了食品安全監(jiān)管的壓力。目前，對摻假食品的檢驗方法還不盡完善，甚至還有缺失。

對于物種源性鑒別常采用感官檢驗和免疫學方法，但肉奶制品經(jīng)熱加工處理，導致其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其他免疫原性物質(zhì)被破壞而難以鑒別[1]，而聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)剛好可以彌補這個缺陷。正確選擇物種的特異性基因進行源性成分鑒定，不受食品深加工工藝的影響，大大提高了檢測的準確性和有效性。PCR技術(shù)早在1985年由科學家Kary Mullis和Cetus研究發(fā)明，是最基本的擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法[2]，它可看作是模擬體內(nèi)DNA復制的原理在體外酶促合成特異DNA片段[3] ，在短時間內(nèi)使微量DNA呈指數(shù)型增長，從而達到檢測目的。該技術(shù)快速準確、靈敏度高，已被廣泛應用于食品源性分析的研究中，為完善食品源性成分鑒定檢驗的標準體系積累了一定的技術(shù)基礎。

1PCR技術(shù)

1.1PCR反應體系

PCR技術(shù)是對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級擴增，在擴增反應結(jié)束之后，通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性或定量分析，進而對產(chǎn)物進行測序比對。該方法迅速發(fā)展和廣泛應用源于反應體系的建立，PCR反應體系主要包括緩沖液、氯化鎂溶液、dNTP、Taq DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）、引物和DNA模板等。其中的Taq酶具有熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性，促進體外擴增有效進行，大大提高了擴增的效率，使PCR技術(shù)得到快速發(fā)展。反應體系中的特異性引物是目標DNA擴增的直接影響因子，通常試驗者利用軟件進行引物設計。目前常用的引物設計軟件有Premier Primer、Oligo 6、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga和Dnastar等，這些軟件都帶有引物自動搜索功能，同時結(jié)合人工分析便能更有效地設計特異性引物。除了引物和Taq酶以外，dNTP、DNA模板和Mg2+的含量均會影響擴增結(jié)果。因此，在建立PCR反應體系時，可以通過優(yōu)化各反應條件，以得到更高的靈敏度和準確性。

1.2熒光定量 PCR

熒光定量 PCR是在普通PCR的基礎上發(fā)展起來的分析方法，該方法在反應體系中加入熒光染料或探針等熒光物質(zhì)，通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號進行實時檢測，實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析。根據(jù)熒光化學模式不同，可分為熒光染料法和熒光探針法，常見的熒光標記基團的特性見表1。

SYBR Green I是應用最廣泛的一種熒光染料，能結(jié)合所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，而未結(jié)合的染料不能發(fā)射熒光信號。但是，在做染料法熒光定量PCR時，要注意區(qū)分假陽性現(xiàn)象，非特異性擴增和引物二聚體均能結(jié)合SYBR Green I而干擾檢驗結(jié)果。目前的熒光染料除了SYBR Green I以外，還有LC Green TM1和Pico Green等新型熒光染料[4]。

目前應用最廣泛的熒光探針是TaqMan水解探針，探針上5′端和3′端分別標記了1個報告熒光基團和1個淬滅熒光基團。在反應初始時，系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被

鄰近的淬滅基團吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而

當PCR過程中聚合酶擴增到探針結(jié)合模版的位點時，其5′～3′核酸外切酶酶切探針5′端的報告基團，此時游離的報告基團遠離淬滅基團，產(chǎn)生熒光信號而被檢測到。該水解探針法中，一旦報告基團水解離開淬滅基團，就一直游離于反應體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，信號不可逆。而雜交探針FRET不同，上游探針的3′端和下游探針的5′端分別標記供體熒光基團和受體熒光基團，復性時2條特異性探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生熒光信號；升溫變性時2條特異性探針又遠離模板，此時供體和受體熒光基團分開，熒光信號消失，所以利用該法檢測到的是實時信號，而非累積信號，信號可逆。除了以上兩者以外，熒光探針還有TaqMan MGB探針、分子信標等[5]。

2PCR在物種源性成分鑒定方面的應用

2.1利用PCR進行物種源性成分分析

動物源性分析時主要針對其各自線粒體基因保守序列設計引物，優(yōu)化反應體系，建立分析方法。于衛(wèi)霞等[6]利用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)對魚種進行鑒定。試驗人員從基因庫中找到8種海魚以及其他12種參照海魚魚種的線粒體細胞色素C氧化酶亞基III基因（MT-co3），通過比對分析自行設計通用引物進行DNA擴增，對擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，然后根據(jù)生物信息軟件提供的限制性內(nèi)切酶酶切信息，篩選出Nla III和Hinf I 2種內(nèi)切酶組合體系，對10種海魚的PCR產(chǎn)物進行酶切分析，獲得了各種魚類特異的酶切片段圖譜。試驗結(jié)果表明，引物MT-co3對10種海洋魚的通用性較高，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，選用MT-co3基因作為分子標記鑒定的魚種與形態(tài)學鑒定的魚種相似度不低于99%，同時試驗獲得了基因庫中未找到的另外2種海魚的MT-co3全序列。通過酶切圖譜分析，使用單一的Hinf I或Nla III酶切都不能將10種海魚進行區(qū)分，但依次使用Hinf I或Nla III 2種酶酶切，可將這10種海魚進行有效區(qū)分。該試驗方法首次采用MT-co3基因作為分子標記，采用PCR技術(shù)進行魚類種屬的鑒別，結(jié)合適宜的限制性內(nèi)切酶酶切分析技術(shù)，可對10種海魚進行種源性鑒別。

尚柯等[7]通過在基因庫中分析和比對豬、牛、羊的線粒體基因保守序列，確定了針對不同物種線粒體cyt-b基因中的特定片段，分別設計相同的上游引物和具有各自物種特異性的下游引物。通過多次優(yōu)化反應體系及引物配比，確定多重PCR試驗條件，所擴增得到的豬、牛、羊的基因片段大小分別為384、258和318 bp，通過基因片段大小差異對樣品肉的源性進行鑒定。同時，他們還進行了檢測限試驗，通過設定不同的模板比例，最終確定該多重PCR體系對豬牛肉、豬羊肉混合樣品的最低檢測限可達10%。該研究確定了針對以上3種動物的共同序列及其特異性序列，建立了這3類常見畜肉的特異性檢測引物體系，能有效進行豬、牛、羊源性分析。

曲莉等[8]采用改良鹽析法和柱層析法有效提取鴨肉、雞肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉和驢肉的mtDNA，通過在GenBank中下載綠頭鴨線粒體細胞色素b（AY676201.1）基因序列，進行引物設計，通過反復梯度PCR試驗，確定最佳退火溫度為62 ℃；同時，以提取的7種肉類mtDNA為模板，驗證所設計的鴨肉引物的特異性。結(jié)果表明，設計的引物僅在鴨肉模板上有明顯擴增，擴增產(chǎn)物大小為223 bp。該研究改良了2種DNA提取方法，采用PCR技術(shù)對肉類產(chǎn)品中的鴨源性成分進行鑒定，比起商品化試劑盒的提取更能縮短提取時間、降低試驗成本。

國外在這方面的研究比國內(nèi)開展得更早，如Tartaglia等[9]根據(jù)牛線粒體DNA中的特異性序列設計引物，通過試驗后建立了適用于飼料中牛源性成分的檢測方法，該方法靈敏度可達0.125%。Arslan等[10]以經(jīng)烹飪、蒸烤、壓力等處理過的牛肉制品為研究對象，經(jīng)試驗證明經(jīng)水烹飪過后的牛肉制品仍可提取其線粒體DNA片段，后經(jīng)PCR擴增可以對其牛源性成分進行鑒別，因此以牛線粒體DNA為模板，采用PCR技術(shù)可以對經(jīng)水烹飪后的牛肉制品進行牛源性分析。

綜上所述，采用PCR技術(shù)可對魚類、畜肉、禽肉、熟肉制品和飼料等進行肉源性分析，方法檢出限、靈敏度均能滿足要求。但該方法后續(xù)均需進行凝膠電泳，并對電泳結(jié)果進行成像分析，使用試劑多、耗時長，不能實時檢測，對日常監(jiān)督檢驗要求來說顯得較為冗長滯后。

2.2利用熒光定量PCR進行物種源性成分分析熒光定量PCR主要采用熒光染料或者標記各種不同熒光基團及熒光淬滅基團的探針來實現(xiàn)實時熒光檢測。

楊麗霞等[11]根據(jù)鴨線粒體基因序列的位點差異設計特異性引物，采用SYBR Green I染料，通過溶解曲線分析，建立熒光定量PCR檢測方法。試驗以鴨肉、牛肉混合樣品為試驗對象，結(jié)果表明，試驗針對鴨線粒體基因設計的引物特異性較好，擴增試驗中僅鴨線粒體DNA有擴增，其Ct值為12.82，而牛線粒體DNA未擴增；鴨基因組檢測靈敏度為1 pg DNA；溶解曲線試驗顯示，鴨DNA擴增產(chǎn)物的溶解溫度為79.15 ℃，可以有效區(qū)分目的片段、非特異性擴增和引物二聚體。試驗將牛肉、鴨肉以9∶1的比例混合后在100 ℃加熱15 min，采用試驗中建立的方法進行檢測，鴨肉DNA擴增Ct值為26.99，產(chǎn)物溶解溫度亦為79.15 ℃，說明該方法也適用于熟鴨肉的檢測，靈敏度及特異性均可滿足實驗室鴨肉源性成分鑒定。

趙冉[12] 選取GenBank上已發(fā)表的豬、牛源性mtDNA D-loop序列，在NCBI中進行比對后，分別針對豬、牛線粒體DNA種間保守基因，設計特異性引物與TaqMan探針、豬探針報告熒光基團ROX、熒光淬滅基團BHQ2；牛探針報告熒光基團HEX、熒光淬滅基團BHQ1。通過對反應體系和反應條件的優(yōu)化篩選，利用以上2種發(fā)射波長相差較大的報告熒光基團，在ROX、HEX熒光通道搜集信號，建立了豬、牛雙重熒光PCR檢測方法。試驗通過對16種不同來源的動物源性核酸進行檢測，確定該方法所設計的豬牛引物的特異性，同時對豬、牛DNA模板進行梯度稀釋，確定其方法最低檢出限均達10-5。試驗對不同狀態(tài)的樣品進行檢測，結(jié)果顯示，建立的雙重熒光PCR法還適用于蒸煮、腌制肉制品、動物血液、奶制品及飼料中豬牛源性分析檢測。

史艷宇等[13]以鴨線粒體基因全序列為靶位點設計引物和探針，經(jīng)Blast軟件對相似序列搜索后，篩選出最優(yōu)且與常見畜禽肉無交叉反應的引物及探針，所用到的探針為TaqMan水解探針，報告熒光基團FAM，熒光淬滅基團TAMRA，采用熒光定量PCR儀進行檢測。試驗分別用羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉、豬肉、兔肉、馬肉和鹿肉等對引物進行特異性試驗，同時，用羊肉DNA溶液對鴨肉DNA進行梯度稀釋，再進行鴨肉檢測靈敏度試驗。通過優(yōu)化PCR反應體系，最終建立了鴨源性成分檢測方法，該方法具有較強特異性，所設計的引物及探針對鴨肉的檢測靈敏度可達0.1 μg/kg，并且高濃度羊肉成分的存在對鴨肉靈敏度檢測沒有影響。

范麗麗等[14]以雞線粒體細胞色素b為目的基因，設計特異性引物和TaqMan水解探針，探針的報告熒光基團FAM，熒光淬滅基團TAMRA。利用所設計的特異性引物對雞DNA模板進行擴增，所得產(chǎn)物片段為110 bp。在特異性試驗中，試驗人員將雞、豬、牛、羊、鴨、火雞、鵪鶉和鴿子等DNA模板進行PCR反應，結(jié)果顯示設計的引物探針體系只對雞DNA模板進行擴增，Ct值為35，其他源性成分均未有效擴增；靈敏度試驗顯示該方法最低可檢測3.5 pg/μL雞肉DNA，可用于對食品中雞源性成分的摻假鑒別。

綜上，熒光定量PCR目前較常用的熒光基團較集中于SYBR Green I和TaqMan探針，SYBR Green I信號可逆，利用該特性結(jié)合溶解曲線分析可實現(xiàn)多重檢測；TaqMan探針上標記的熒光報告基團和淬滅基團可根據(jù)檢測通道不同分別進行設計，在同一反應體系中加入標記不同熒光基團的探針也可實現(xiàn)多通道檢測，因此在熒光定量PCR檢測時，引物及探針的設計至關(guān)重要，在今后的工作中有待更深入的探索試驗。在已發(fā)表的文獻中，利用雙雜交探針FRET、分子信標及LUX引物在源性鑒定分析方面應用還較少。使用雜交探針在探針合成時標記較為復雜，且雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性較差；而LUX引物在合成時不需要專門設計探針，其特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性擴增或引物二聚體沒有影響，其特異性又優(yōu)于SYBR Green I。鑒于各染料、探針及引物的特性不同，在食品源性成分分析鑒定方面的應用還有待更深入的研究與探索。

安徽農(nóng)業(yè)科學2017年

3前景與展望

利用PCR、熒光定量PCR技術(shù)，從分子角度進行物種源性分析檢測，是當前食品安全檢測的新興行業(yè)，近年來發(fā)展尤為迅速。PCR技術(shù)在源性成分分析時，針對目標DNA設計特異性引物以實現(xiàn)DNA模板的擴增；多重檢測時，通過設計通用性的上游引物及特異性的下游引物，或在同一反應體系中設計各自不同的上下游引物，以實現(xiàn)物種鑒定的多重快速檢測。熒光定量PCR技術(shù)以實時、快速、簡捷的特性在食品源性成分鑒定方面也得到了迅速發(fā)展。除了嵌入式熒光染料的使用外， TaqMan探針的應用最為常見，利用標記不同的熒光報告基團及淬滅基團的TaqMan探針，可實現(xiàn)多通道實時檢測。在熒光淬滅物質(zhì)設計方面，有研究者利用一種單層的、二維的碳納米材料——氧化石墨烯作為反應時的淬滅劑，該物質(zhì)能吸附單鏈DNA，對標記在單鏈核酸上的熒光染料具有很強的淬滅作用[15]，這在熒光定量PCR技術(shù)應用方面又開拓了新的發(fā)展方向。由于目前檢測儀器的通道限制，多通道檢測目前多局限于雙重或三重，在今后的研究工作中，隨著熒光標記物質(zhì)的不斷開發(fā)，相應儀器的檢測通道會不斷增加，多重檢測必將是PCR技術(shù)發(fā)展的主要方向。

食品源性成分檢測方法的建立，通過改良DNA提取技術(shù)以提高目標DNA提取效率，采用限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)以實現(xiàn)物種多態(tài)性分析，優(yōu)化擴增反應體系及溫度條件以提高檢測靈敏度，設計不同引物、標記熒光基團的探針以提高檢測專一性等，這些技術(shù)在一定程度上不斷開發(fā)PCR技術(shù)的潛力，延伸其在物種鑒定方面的發(fā)展空間。今后，通過對雙雜交探針FRET、分子信標及LUX引物等技術(shù)研究的不斷深入，食品源性鑒定分析的方法必將朝著多元化的方向發(fā)展。

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