陳瑤 刁瑕 宦云敏 杜陽(yáng)春 李維 何兵

摘要： 為探究小檗科植物八角蓮組織培養(yǎng)的器官發(fā)生方式，該研究以八角蓮離體葉片、葉柄在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織、不定芽、不定根為對(duì)象，用連續(xù)石蠟切片技術(shù)分析八角蓮組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑。結(jié)果表明：八角蓮愈傷組織形成的解剖學(xué)特征是靠近表皮的薄壁細(xì)胞經(jīng)激素刺激恢復(fù)分裂能力，繼續(xù)培養(yǎng)形成擬分生組織。擬分生組織可形成許多分化中心。通過(guò)對(duì)八角蓮組織培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽細(xì)胞組織學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)芽原基起源于愈傷組織外側(cè)的幾層薄壁細(xì)胞，芽原基背離愈傷組織中央生長(zhǎng)形成不定芽，故八角蓮脫分化形成的芽起源方式為外起源。而八角蓮的根原基起源于組織深處髓部薄壁細(xì)胞和部分維管形成層細(xì)胞，進(jìn)而形成類(lèi)似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓，根原基繼續(xù)發(fā)育會(huì)突破表皮生成不定根，起源方式為內(nèi)起源。八角蓮離體再生途徑為器官發(fā)生型，在組培苗生長(zhǎng)過(guò)程中先誘導(dǎo)形成不定芽，再誘導(dǎo)形成不定根，在愈傷組織上形成維管組織將不定芽和不定根連接成完整植株。

關(guān)鍵詞： 八角蓮， 不定芽， 不定根， 組培苗， 石蠟切片

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.1， Q945文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）09111111

Abstract： To study the organic regeneration pathway of tissue culture of Dysosma versipellis， we used callus， adventitious buds and roots induced from in vitro leaves and petioles of D. versipellis on MS medium to analyze it， based on the technique of serial paraffin slices. The results showed that the parenchyma cells which were near the epidermis recovered cell division ability through the hormone stimulation. Originally cells of the stationary state altered cell metabolism after they were stimulated， and cell division became active. The parenchyma cells were continued to culture and formed meristemoid with cells division potential of totipotency of plant cell， which could form a lot of differentiation centers. Histological observation of D. versipellis proved that the bud primodium derived from the subsurface layers of callus and grew away from the middle of callus， so the buds which produced by dedifferentiation originated in exogenous way， formed the adventitious buds. Furthermore， the root primodium originated from parenchyma cells in the pith and partial vascular cambium cells in the depth of tissue， which raised towards the phloem liked spherical or wedge. It would continue growing and break epidermis， then adventitious buds were formed. This way was endogenous. Organogenesis type was the conventional way for D. versipellis to regenerate in vitro. Adventitious buds were induced at first during the growth process of tissue culture seedling， which was followed by the formation of adventitious roots. Because of vascular bundle of adventitious roots being originated from callus must link vascular bundle of stem and branch， it played an important role in supporting small plant development. At last， the vascular bundle formed from callus would connect the two into a complete plant. The research result has important guiding significance for scale planting cultivation of D. versipellis while protecting of germplasm resources.

Key words： Dysosma versipellis， adventitious bud， adventitious root， tissue culture seedling， paraffin section

八角蓮（Dysosma versipellis）又名旱八角、金魁蓮是中國(guó)特有瀕危保護(hù)植物，屬于小檗科（Berberidaceae）鬼臼屬（Dysosma），主要分布在浙江、湖南、湖北、云南、四川等地（中國(guó)植物志，2001）。八角蓮藥用價(jià)值高，能抑制多種細(xì)菌（Zheng et al，2016），治療蛇毒咬傷、關(guān)節(jié)酸痛、半身不遂等疾?。ㄖ袊?guó)植物志，2001）。八角蓮的有效成分黃酮類(lèi)化合物、鬼臼毒素等具有抗病毒、抗腫瘤等作用（陳日道等，2016），尤其用于治療食道癌、子宮癌（Yuan et al，2011）、前列腺癌等（Jiang et al，2007）。近年來(lái)，適合八角蓮生存的陰暗潮濕生境被強(qiáng)烈破壞，導(dǎo)致八角蓮棲息地面積逐漸減小，野生八角蓮分布地區(qū)和數(shù)量銳減，再加上人們長(zhǎng)期對(duì)野生八角蓮無(wú)規(guī)律采挖，最終導(dǎo)致野生八角蓮資源瀕于滅絕。因此必須盡快建立八角蓮人工高效繁殖體系。

目前，八角蓮的研究主要集中在其種質(zhì)資源、化學(xué)成分、藥用價(jià)值、離體快繁等方面。八角蓮離體快繁是解決野生八角蓮資源短缺的重要途徑之一，很多學(xué)者就此進(jìn)行了深入研究，并且取得了一定的成果，Jiang et al（2012）成功建立了八角蓮再生體系。但已有研究都是從外植體選擇、培養(yǎng)基種類(lèi)、激素種類(lèi)及其配比等方面入手，目前未發(fā)現(xiàn)有研究者對(duì)八角蓮離體器官的形態(tài)發(fā)生途徑進(jìn)行研究。因此，本研究以八角蓮葉柄、葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，以獲得組培苗。運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀(guān)察和解剖學(xué)方法對(duì)八角蓮組培苗器官發(fā)生途徑進(jìn)行研究，目的在于揭示八角蓮離體培養(yǎng)器官發(fā)生途徑和植株再生規(guī)律；探索八角蓮植株高效再生的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件；用于指導(dǎo)八角蓮種苗生產(chǎn)；同時(shí)也為研究鬼臼屬植物離體再生規(guī)律提供理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2015年10月至2016年6月在四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.1 材料本研究使用的外植體為八角蓮離體葉片和葉柄，引種自四川省峨眉山，移栽在四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地生物園中。

1.1.2 方法

1.1.2.1 八角蓮組織培養(yǎng)八角蓮組織培養(yǎng)分為三個(gè)步驟。第一，在培養(yǎng)基（A）中誘導(dǎo)外植體（葉柄、葉片）脫分化形成愈傷組織；第二，在培養(yǎng)基（B）中誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成芽；第三，在生根培養(yǎng)基（C）中誘導(dǎo)芽生根（具體配方見(jiàn)表1）。培養(yǎng)條件：溫度為（22±1）℃，光照時(shí)間為14 h·d1，濕度為75%，光照強(qiáng)度為1 000 lx。

1.1.2.2 形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀(guān)察從外植體接入培養(yǎng)基開(kāi)始，每隔一周觀(guān)察外植體形態(tài)變化。當(dāng)愈傷組織產(chǎn)生時(shí)，取樣做石蠟切片，直到形成完整植株。石蠟切片用番紅-固綠染色，在Leica DM 3000顯微鏡下進(jìn)行解剖學(xué)觀(guān)察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)形成愈傷組織

2.1.1 八角蓮愈傷組織形成的形態(tài)學(xué)觀(guān)察外植體在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)30～35 d，葉片明顯增大并且邊緣向上卷曲（圖1：A），葉柄彎曲（圖2：A）。延長(zhǎng)培養(yǎng)到40～45 d，葉脈開(kāi)始膨大、葉片增厚（圖1：B）；葉柄切口處膨大（圖2：B），表明此時(shí)細(xì)胞已開(kāi)始增殖。培養(yǎng)到第55～65天可在葉片、葉柄切口處脫分化形成顆粒狀、淡黃綠色的愈傷組織（圖1：C；圖2：C），但愈傷組織生長(zhǎng)緩慢。繼續(xù)培養(yǎng)，可產(chǎn)生一團(tuán)淡綠色或淡黃色、有光澤的愈傷組織（圖1：D；圖2：D）。

2.1.2 八角蓮愈傷組織形成的解剖學(xué)特征觀(guān)察八角蓮愈傷組織石蠟切片發(fā)現(xiàn)靠近表皮的薄壁細(xì)胞在激素刺激下逐漸脫分化恢復(fù)分裂能力，分裂產(chǎn)生的細(xì)胞體積小，細(xì)胞核染色較深，細(xì)胞無(wú)規(guī)則，細(xì)胞間隙大且缺少有組織的結(jié)構(gòu)（圖3：A）。繼續(xù)培養(yǎng)，恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞快速進(jìn)行有絲分裂（圖3：B），形成分生細(xì)胞團(tuán)，分生細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部細(xì)胞之間無(wú)間隙，細(xì)胞體積稍小，分生細(xì)胞團(tuán)之間存在空泡狀細(xì)胞（圖3：C）。有的愈傷組織在激素刺激下產(chǎn)生擬分生組織（圖3：D，E，F(xiàn)）。這些分生細(xì)胞團(tuán)和擬分生組織對(duì)八角蓮后期的器官形成和輸導(dǎo)組織分化有重大作用。

分生細(xì)胞團(tuán)中的部分細(xì)胞開(kāi)始分化，細(xì)胞縱向生長(zhǎng)，細(xì)胞側(cè)壁不同程度加厚，原生質(zhì)體分解，相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞橫壁溶解，最終分化形成導(dǎo)管（圖4：A，B）；有些擬分生組織還會(huì)分化形成篩管，伴胞清晰可見(jiàn)（圖4：C）。導(dǎo)管和篩管等輸導(dǎo)組織對(duì)愈傷組織的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸起重要作用。擬分生組織可形成許多分化中心，并且可在愈傷組織近表層形成芽原基。

2.2 誘導(dǎo)分化不定芽

2.2.1 八角蓮不定芽形成的形態(tài)學(xué)觀(guān)察將八角蓮愈傷組織轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)25～30 d發(fā)現(xiàn)在呈塊狀、結(jié)構(gòu)緊致，表面粗糙、顏色偏暗的愈傷組織塊上很難誘導(dǎo)出不定芽，在呈淡黃綠色的顆粒狀愈傷組織上才能誘導(dǎo)分化出不定芽（圖5：A），延長(zhǎng)培養(yǎng)，不定芽分化出葉片（圖5：B），繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右可形成叢生芽（圖5：C，D）。

2.2.2八角蓮不定芽形成的解剖學(xué)特征愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（B）30 d后，每隔5 d取一次樣做石蠟切片，連續(xù)做7次。在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)八角蓮組織培養(yǎng)產(chǎn)生的芽原基起源于愈傷組織外側(cè)的幾層薄壁細(xì)胞，這些能夠分化形成芽原基部位的愈傷組織最外層有一層表皮細(xì)胞。這層表皮細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，細(xì)胞排列緊密，無(wú)間隙。這層表皮細(xì)胞以?xún)?nèi)的幾層細(xì)胞薄壁細(xì)胞進(jìn)行垂周分裂，產(chǎn)生的細(xì)胞不規(guī)則，細(xì)胞體積小，但是細(xì)胞核明顯，細(xì)胞排列緊密，無(wú)間隙。垂周分裂產(chǎn)生的細(xì)胞形成新的生長(zhǎng)點(diǎn)，即原始芽原基（圖6：A），原始芽原基的生長(zhǎng)點(diǎn)背離愈傷組織中央，隨著細(xì)胞加速分裂可形成明顯的芽原基（圖6：B，C）。這些芽原基在培養(yǎng)基（B）中培養(yǎng)會(huì)分化出不定芽。

不定芽在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)形成不同的形態(tài)。有的芽原基直接分裂分化形成融合的不定芽（圖7：A）；有的不定芽的頂端分生組織直接向外生長(zhǎng)（圖7：B）；部分不定芽由兩片葉原基保護(hù)著向外生長(zhǎng) （圖7：C）；有的不定芽由封閉的葉原基包裹 （圖7：D-a）；有的芽原基會(huì)形成酒杯狀的不定芽（圖7：D-b）；也有由葉原基保護(hù)的圓屋頂狀的頂點(diǎn)分生的不定芽（圖7：E）；有的芽原基形成具有多層幼葉的結(jié)構(gòu)（圖7：F）。由此可知八角蓮愈傷組織分化形成的芽是不定芽，其起源方式為外起源，發(fā)生方式屬于器官發(fā)生型。

雖然誘導(dǎo)分化的不定芽有不同的形態(tài)，但不定芽頂端分生區(qū)的細(xì)胞有相同的解剖學(xué)特點(diǎn)。其表皮層細(xì)胞近方形，細(xì)胞體積小，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)稠密，無(wú)液泡，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間的間隙小甚至無(wú)間隙。表皮層內(nèi)的細(xì)胞近圓形，細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)稠密，細(xì)胞間略有間隙。但是隨著細(xì)胞不斷遠(yuǎn)離不定芽頂端分生組織，細(xì)胞核逐漸變小，細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞體積變大，達(dá)到一定程度后細(xì)胞不再變化（圖8：A，B，C）。

在八角蓮芽原基發(fā)育為不定芽的過(guò)程中，不定芽?jī)?nèi)的細(xì)胞逐漸分化形成螺紋狀的篩管（圖9：A，B，C，D），維管束（圖9：E，F(xiàn)）。這些維管組織在不定芽生長(zhǎng)過(guò)程中為其運(yùn)輸必需的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 誘導(dǎo)八角蓮不定芽生根

2.3.1八角蓮不定芽生根的形態(tài)學(xué)觀(guān)察叢生芽在培養(yǎng)基（C）中培養(yǎng)10 d左右，不定芽基部的愈傷組織上出現(xiàn)白色瘤狀凸起（圖10：A），繼續(xù)培養(yǎng)8 d左右白色瘤狀凸起發(fā)育形成不定根（圖10：B，C），待根系繼續(xù)生長(zhǎng)5 d左右既可以進(jìn)行移栽， 移栽后組培苗根系可正常生長(zhǎng)。（圖10：D）。

2.3.2不定芽生根過(guò)程的細(xì)胞組織學(xué)觀(guān)察將2～3 cm高的不定芽接入生根培養(yǎng)基C中，每隔3 d取樣做石蠟切片，共取5次樣。觀(guān)察大量石蠟切片發(fā)現(xiàn)愈傷組織深處的髓部薄壁細(xì)胞首先再分化產(chǎn)生新的薄壁細(xì)胞，新薄壁細(xì)胞構(gòu)成維管形成層。維管形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃、細(xì)胞核染色較深（圖11：A）。薄壁細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次有絲分裂，形成層加寬，有些地方出現(xiàn)染色比其他區(qū)域稍深的細(xì)胞團(tuán)。這些細(xì)胞團(tuán)排列緊密，細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核相對(duì)較大。這些細(xì)胞團(tuán)具有強(qiáng)烈的分裂能力，可分裂分化形成類(lèi)似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓，同時(shí)表皮細(xì)胞溶解。在后期的切片中可觀(guān)察到原始根原基（圖11：B），此生長(zhǎng)點(diǎn)可形成根原基。根原基形成的頂端分生組織明顯，細(xì)胞分裂能力旺盛，不斷向外生長(zhǎng)。中后部細(xì)胞染色變淺，分生能力減弱，逐漸變成薄壁細(xì)胞（圖11：C），直到形成完整的不定根（圖11：D）。根原基起始于愈傷組織深處的薄壁細(xì)胞，可見(jiàn)八角蓮離體組織培養(yǎng)的根起源方式為內(nèi)起源，生成的根為不定根。

不定根頂端分生組織的部分薄壁細(xì)胞可分化形成導(dǎo)管（圖12：A-b，C），愈傷組織中的一些薄壁細(xì)胞也分化形成導(dǎo)管（圖12：A-a，B），并且與不定根中的導(dǎo)管相連。這些導(dǎo)管可以將愈傷組織中的水分運(yùn)輸?shù)讲欢ǜ?，為不定根的生長(zhǎng)提供充足的水分和礦物質(zhì)。在形成不定根的愈傷組織上還發(fā)現(xiàn)了更完整、更龐大的維管組織（圖12：D，E，F(xiàn)，G，H，I），這些維管組織不僅與不定芽中的維管組織相連，還和不定根中的維管組織相連。這樣不定芽與不定根就通過(guò)維管組織連接形成完整植株。這些維管組織不僅可以將愈傷組織中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)讲欢ㄑ亢筒欢ǜ腥?。還可將不定根從土壤里吸收的水分、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)運(yùn)輸?shù)街仓甑母鱾€(gè)部位，從而提高八角蓮組培苗移栽成活率。

3討論與結(jié)論

植株離體再生途徑包括體細(xì)胞胚發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑（薛銀芳等，2012）。觀(guān)察八角蓮組培苗器官的形態(tài)學(xué)發(fā)育過(guò)程和各發(fā)育階段解剖學(xué)特征可知：八角蓮離體再生途徑屬于器官發(fā)生途徑中的器官發(fā)生型，在激素的刺激下先以外起源的方式形成不定芽，再以?xún)?nèi)起源的方式形成不定根。在八角蓮組織培養(yǎng)三個(gè)階段中誘導(dǎo)外植體脫分化形成愈傷組織需要70 d左右，愈傷組織形成后增殖緩慢。愈傷組織再分化形成不定芽需30 d左右，繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右可形成大量叢生芽，并在其內(nèi)部產(chǎn)生大量維管組織，為后期組培苗運(yùn)輸水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。不定芽生根過(guò)程僅需要15 d左右。在八角蓮規(guī)?；纳a(chǎn)中建議先在分化培養(yǎng)基（B）中大量誘導(dǎo)形成叢生芽，再誘導(dǎo)叢生芽生根，此方法可節(jié)約種苗生產(chǎn)時(shí)間。不定根形成后應(yīng)在生根培養(yǎng)基（C）中繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右，以便不定根中的輸導(dǎo)組織和不定芽中的輸導(dǎo)組織連接成一個(gè)整體，從而提高組培苗移栽成活率。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)板結(jié)致密的愈傷組織不易誘導(dǎo)形成不定芽，在后期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素的種類(lèi)及使用比例，以誘導(dǎo)形成淡黃綠色的顆粒狀胚性愈傷組織，以便更好更快地誘導(dǎo)形成不定芽。

3.1 不定芽發(fā)生途徑

根據(jù)解剖學(xué)研究分析可得出八角蓮愈傷組織再分化途徑為器官發(fā)生途徑：即在愈傷組織不同部位分別形成不定芽、不定根，然后不定芽和不定根通過(guò)維管組織連接形成完整組織。這與亞洲百合的花絲離體再生途徑相似（姚紹嫦等，2009）。關(guān)于體細(xì)胞脫分化形成的擬分生組織先發(fā)育形成芽原基，隨后再形成葉原基；還是先形成葉原基后再形成芽原基；或者芽原基和葉原基同時(shí)形成等問(wèn)題存在爭(zhēng)議（蔡潤(rùn)等，2002；Bowman & Eshd，2000；Barton & Poething，1993）。由圖6：A，B，C可知八角蓮離體植株再生是先形成芽原基，芽原基發(fā)育為不定芽時(shí)會(huì)有葉原基形成（圖7：C，Da，E，F(xiàn)），但并非所有不定芽都伴有葉原基（圖7：A，B，Db）。

3.2 不定根發(fā)生途徑

根原基產(chǎn)生部位常有形成層、皮層薄壁細(xì)胞、韌皮部、髓射線(xiàn)細(xì)胞、愈傷組織（Fahn，1997），并分為潛伏根原基和誘生根原基（Davis，1994）。通過(guò)對(duì)八角蓮不定根發(fā)生過(guò)程的解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，八角蓮愈傷組織中無(wú)潛伏根原基存在，形成不定根的誘生根原基是在生長(zhǎng)素IBA誘導(dǎo)下才形成。生長(zhǎng)素IBA在誘導(dǎo)不定根形成中起著重要作用，如鐵棒錘（陳紅剛等，2016）、金鐵鎖（李斌等，2016）不定根的形成都與IBA密切相關(guān)。八角蓮組培苗不定根的根原基起源于愈傷組織深處的髓部薄壁細(xì)胞。這些細(xì)胞分裂分化形成類(lèi)似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓、根原基、最終形成不定根。李志軍和于軍（2002）發(fā)現(xiàn)田旋花不定根起源于維管形成細(xì)胞。于宏等（2008）研究表明珍稀藥用植物杏香兔耳風(fēng)組培苗的根原基源于髓射線(xiàn)分生細(xì)胞，也屬于誘導(dǎo)根原基。其根系發(fā)育過(guò)程可分為髓射線(xiàn)分生細(xì)胞分化、形成根原基、形成不定根三個(gè)階段。紫花含笑組培苗在誘導(dǎo)生根前不含根原始體，根原基起始于髓射線(xiàn)與形成層交接處的薄壁細(xì)胞（宋曉琛等，2014）。本研究結(jié)果表明八角蓮組培苗生根過(guò)程還與油茶（吳幼媚等，2013）、鐵線(xiàn)蓮（張啟香等，2010）等組培苗形成不定根的過(guò)程相似。

Salaj et al（2005）發(fā)現(xiàn)亞麻愈傷組織中的分生結(jié)節(jié)在合適的培養(yǎng)條件下可直接形成器官，也可以誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚。吳澤等（2014）發(fā)現(xiàn)百合的胚性愈傷組織上的分生結(jié)節(jié)就可發(fā)育為體細(xì)胞胚。在八角蓮離體器官發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)愈傷組織中存在分生結(jié)節(jié)，在后期的研究中可進(jìn)行相關(guān)研究。

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