王倩穎 唐佳妮 劉志高 張明如 申亞梅

摘要： 該研究以景寧木蘭（Magnolia sinostellata）為材料，從外植體類型的選擇、消毒時間、預(yù)處理方法、離體培養(yǎng)條件和抗褐化劑類型選擇等方面進行綜合研究，以期篩選出景寧木蘭組織培養(yǎng)的最佳方案。結(jié)果表明：利用0.1% 氯化汞（HgCl2）浸泡處理14和8 min分別是景寧木蘭葉片和帶芽莖段、根部的最佳消毒時間；景寧木蘭葉片及莖段的褐化率在暗培養(yǎng)7 d時， 分別為60.00%和56.67%， 14 d時顯著升高， 而根部則在暗培養(yǎng)14 d時褐化率最低（45%）；利用1 g·L1聚乙烯吡咯烷酮（PVP）浸泡預(yù)處理景寧木蘭外植體6 h可顯著降低（P<0.05）其褐化程度，處理后葉片、帶芽莖段和根部的褐化率分別降至45.00%、28.33%和63.33%。不同的抗褐化劑均可減輕外植體的褐化程度，但針對不同外植體其效果不同。景寧木蘭葉片最佳抗褐化劑為0.02 g·L1硝酸銀（AgNO3），可使其褐化率降低至16.67%，成活率為11.67%；帶芽莖段和根部的最優(yōu)抗褐化劑為2 g·L1檸檬酸（CA），褐化率分別降至30.00%和5.00%，成活率依次為50.00%和76.67%。綜上所述，帶芽莖段和根部抗褐化處理后褐化率較低且成活率較高，為景寧木蘭組織培養(yǎng)最佳外植體。

關(guān)鍵詞： 景寧木蘭， 消毒時間， 暗培養(yǎng)， 抗褐化劑， 組織培養(yǎng)， 抗褐化， 成活率

中圖分類號： Q943.1文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）09108808

Abstract： Magnolia sinostellata is one of the endangered plants in Magnoliaceae， and is also facing the challenge of tissue culture for browning. Therefore， the leaf， stem with bud and root of M. sinostellata as explants were treated in different disinfection time （8， 10， 12， 14 min）， light and dark condition， pretreated by PVP and Vc， and the basic media was MS（Murashige and Skoog ）+0.5 mg·L1 6BA+0.3 mg·L1 IAA， pH5.8） in this study. And then， three explants were treated by the basic media with 0.5， 1， 2 g·L1 antibrowning substance （Vc， PVP， CA， AgNO3， Na2S2O3） for getting the optimal tissue culture methods. All culture processes were put in 25 ℃ condition. The results showed that 14 min was the best sterilization time for the leaves and stems with bud， and 8 min was the optimal sterilization time for the roots under 0.1% HgCl2 disinfection. The browning rates of leaves and stems were the lowest at 7 d during the early stage under dark culture condition， which was 60.00% and 56.67% respectively， and the browning rate of root was 45.00% at 14 d. Soaking explants in 1 g·L1 PVP for 6 h as pretreatment can significantly reduce the browning rate（P<0.05）， the browning rate of leaves， stems with buds and roots were reduced to 45%， 28.33% and 63.33% respectively. Antibrowning agents and concentrations can effectively reduce the degree of browning of the explants in M. sinostellata. The best antibrowning substance for leaves was 0.02 g·L1 AgNO3 and its browning rate reduced to 16.67%， the survival rate was 11.67%； 2 g·L1 CA was the optimal antibrowning substance for stems with buds and root， the browning rate were 30% and 50%，the survival rate was 50.00% and 76.67%. In conclusion， we found that the stem segment with bud and root were the best explants for tissue culture of M. sinostellata. This research had obtained the best scheme for preventing the browning of explants in M. sinostellata， which is helpful for the rapid propagation technique of M. sinostellata， and to provide reference for the study of other species of Magnoliaceae.

Key words： Magnolia sinostellata， disinfection time， dark culture， antibrowning substance， tissue culture， antibrowning， survival rate

木蘭科（Magnoliaceae）植物為古老的木本植物類群，因其具有較高的觀賞價值而得到廣泛關(guān)注。但是，該類植物多因結(jié)實率低、繁殖能力弱、生長勢弱等問題而面臨滅絕。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是保存植物種質(zhì)資源的一種有效手段，也是開展植物基因組研究的重要條件。國內(nèi)對木蘭科植物的研究主要集中在遺傳多樣性（王佳媛等，2012；楊梅等，2014）、瀕危機制（袁春明等，2012；陳紅峰等，2011）以及分類學(xué)（方大鳳等，2015；劉克旺和楊旭紅，2001）等方面。相較于其他模式植物，因沒有完善的組培再生體系，木蘭屬（Magnolia）植物極少開展基因組學(xué)研究。僅有的對于木蘭屬植物的基因功能驗證，也只能進行模式植物轉(zhuǎn)化間接驗證（Jing et al，2014），從而影響了木蘭屬植物的研究和育種工作。因此，建立木蘭科植物完整的擴繁體系，不僅可以解決其無性繁殖的問題，更好地保護木蘭科種質(zhì)資源，還可為木蘭科植物基因功能驗證等相關(guān)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

目前，僅鵝掌楸（Liriodendron chinense） （郭治友等，2008）、北美鵝掌楸（L. tulipifera）（陳穎等，2009）、紅花山玉蘭（Magnolia delavayi） （唐軍榮等，2014）等少數(shù)幾個木蘭科植物具有外植體再生體系或外植體無菌再生體系。木蘭科植物本身含有諸多酚類物質(zhì)，造成其組培過程中褐化現(xiàn)象嚴重。因此抑制褐化現(xiàn)象是木蘭科植物組織培養(yǎng)能否取得成功的關(guān)鍵步驟。褐化主要分為兩種，即酶促褐化和非酶促褐化。植物體內(nèi)的多酚氧化酶（PPO）和外植體分泌的酶類、酚類、單寧類等次生代謝底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生毒害物質(zhì)，致使細胞失活、外植體死亡的現(xiàn)象即為酶促褐化。如木蘭科植物外植體切割后，分泌的酚類化合物發(fā)生氧化反應(yīng)后形成醌類化合物，在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致其他酶系統(tǒng)的失活，代謝紊亂，進而影響植物的生長（黃烈健和王鴻，2016）。非酶促褐化是指由外界環(huán)境（如溫度等）所引起的植物細胞程序性死亡或細胞壞死現(xiàn)象，其不會引起酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。外植體的褐化與其樹齡、選取部位、大小等均有密切關(guān)系，因此選擇合適外植體與培養(yǎng)條件是解決褐化的基本條件。預(yù)防組織培養(yǎng)中的外植體褐化問題，主要方式有選擇最適外植體、對外植體浸泡預(yù)處理、培養(yǎng)基中加入抗褐化劑和適宜的培養(yǎng)條件。在木蘭科植物組培研究中，體胚繁殖雖取得一定的進展（陳穎等，2009），但木蘭科植物多為瀕危物種，本身存在結(jié)實率低，甚至不結(jié)實等問題，使得一些種類的體胚繁殖受到阻礙，因此莖段與芽成為研究者采用最多的外植體（曾宋君等，2000； 黎明和馬煥成，2003）。對白玉蘭（Magnolia denudata） （周麗艷等，2008）、天女木蘭（M. sieboldii） （王歡等，2012）的研究表明，適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)及低溫可有效降低外植體的褐化率，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）等抗褐化劑預(yù)處理外植體或加入至培養(yǎng)基中亦可有效降低外植體褐化率。

景寧木蘭（M. sinostellata）是木蘭科木蘭屬新種，落葉灌木，花瓣數(shù)量9～18瓣不等，分布于浙江南部地區(qū)，屬于極度瀕危物種。該物種在組培過程中存在嚴重的褐化現(xiàn)象，阻礙了組織細胞的分化。因該物種結(jié)實率極低，故本研究選擇嫩葉、帶芽莖段和根為外植體，通過比較不同消毒時間、外植體預(yù)處理方式、離體培養(yǎng)的環(huán)境條件和抗褐化劑類型及濃度等，篩選出景寧木蘭組織培養(yǎng)最佳外植體、最佳消毒時間及防止外植體褐化的最佳方案，以期為景寧木蘭的離體快繁技術(shù)奠定基礎(chǔ)，并為木蘭科其他物種的研究提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體的選取外植體選取景寧木蘭生長健壯，無病蟲害的當(dāng)年生嫩葉、帶芽莖段和根部。2016年6月1日采自浙江農(nóng)林大學(xué)苗圃內(nèi)種植的景寧木蘭。

1.1.2 培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L16BA+0.3 mg·L1IAA，MS培養(yǎng)基附加8 g·L1的瓊脂，pH 5.8。

1.2 處理方法

將采回的景寧木蘭嫩葉、帶芽莖段及根部先用洗潔精清洗，去除表面灰塵和雜物等，再用流水沖洗2 h，放在超凈工作臺上用75%的酒精對其表面消毒30 s，無菌水沖洗3～4次。之后，用0.1%的HgCl2浸泡消毒，無菌水沖洗3～4次，無菌紙吸干，最后將帶芽莖段、根部修剪成1～1.5 cm，葉片修剪成1 cm × 1 cm，分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為（25 ± 2）℃，光照時間為12 h·d1，光照強度為2 000～2 500 lx。實驗處理采用單因素實驗。每個處理接種5瓶，每瓶接種4個外植體，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計污染率及成活率。

1.2.1 消毒時間的設(shè)置設(shè)4個時間處理：處理時間分別為8、10、12和14 min。將消毒后的三種景寧木蘭外植體接種于基本培養(yǎng)基上，并統(tǒng)計污染率及成活率。

1.2.2 培養(yǎng)條件的設(shè)置基于1.2.1的研究結(jié)果，將3種外植體按其最佳消毒時間消毒后，接種于基本培養(yǎng)基上，之后在三種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)外植體，統(tǒng)計褐化率及成活率并比較。三種培養(yǎng)條件如下：（1）接種后于25 ℃暗培養(yǎng)14 d，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，光照時間為12 h·d1；（2） 接種后于25 ℃暗培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，光照時間為12 h·d1；（3）接種后直接25 ℃光培養(yǎng)，光照時間為12 h·d1，并以此組作為對照組（CK）。

1.2.3 抗褐化劑預(yù)處理將景寧木蘭外植體在接種前分別在1 g·L1聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和1 g·L1 L抗壞血酸（Vc）中浸泡6 h，之后接種到MS+0.5 mg·L1 6BA+0.3 mg·L1 IAA基本培養(yǎng)基上，并統(tǒng)計褐化率及成活率。

1.2.4 抗褐化劑及用量（添加入培養(yǎng)基）在基本培養(yǎng)基中分別加入不同用量的不同種類的抗褐化劑：0.5、1、2 g·L1活性炭（AC）；0.5、1、2 g·L1 抗壞血酸（Vc）；0.5、1、2 g·L1聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.5、1、2 g·L1檸檬酸（CA）；0.01、0.02、0.03 g·L1硝酸銀（AgNO3）；0.1、0.2、0.5 g·L1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）。將三種外植體接種在加入了褐化劑的培養(yǎng)基中，并統(tǒng)計褐化率及成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

在第30天統(tǒng)計各處理培養(yǎng)的污染率、褐化率。污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；褐化率=褐化外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。采用Excel 2007與SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對三種外植體滅菌效果的影響

對景寧木蘭嫩葉、帶芽莖段和根部的消毒處理結(jié)果表明（表1），隨著消毒時間的延長，景寧木蘭嫩葉及帶芽莖段的污染率顯著降低（P<0.05），在14 min時達到最佳，其污染率分別降至78.33%和25.00%；而根部的污染率則隨著消毒處理時間的延長呈增長趨勢，在消毒處理8 min時，消毒效果最好，污染率為0，而同樣處理14 min后， 根部污染率反而增加到56.67%。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，消毒處理14 min的嫩葉培養(yǎng)到第3天時開始出現(xiàn)污染；相同處理時間的帶芽莖段第5天出現(xiàn)污染，培養(yǎng)到15 d后，污染極少出現(xiàn)。而處理10 min的根在第5天出現(xiàn)污染，培養(yǎng)到15 d后不出現(xiàn)污染。30 d后統(tǒng)計成活率顯示（圖1：A），嫩葉、帶芽莖段與根部之間差異顯著（P<0.05），然而處理時間之間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 不同培養(yǎng)條件對三種外植體褐化的影響

由表2可知，將外植體放入黑暗環(huán)境中預(yù)培養(yǎng)適當(dāng)時間可以降低景寧木蘭外植體的褐化程度，但不同外植體暗培養(yǎng)時間與褐化率的關(guān)系不同。在暗培養(yǎng)0 d和7 d時，嫩葉和帶芽莖段的褐化率均為80%；而在持續(xù)暗培養(yǎng)7 d后，嫩葉及帶芽莖段的褐化率顯著降低（P<0.05），分別降至60.00%和56.67%。但此后再延長暗培養(yǎng)時間，無法再降低這兩種外植體的褐化率，反而會使褐化率提高。表2結(jié)果表明，暗培養(yǎng)14 d后，嫩葉與帶芽莖段的褐化率分別升高到73.33%和66.67%，顯著高于對照組（P<0.05）。由此可知，對于這兩種外植體，暗培養(yǎng)時間并非越長越好，合適的暗培養(yǎng)時間為7 d。而當(dāng)外植體為景寧木蘭根部時，褐化率隨著暗培養(yǎng)時間的延長而顯著降低（P<0.05），在暗培養(yǎng)14 d后，其褐化率從66.67%降低到45%， 且三種培養(yǎng)條件下，根部褐化率皆顯著低于嫩葉及帶芽莖段褐化率（P<0.05）。30 d后統(tǒng)計成活率顯示（圖1：B），暗培養(yǎng)后，嫩葉、帶芽莖段與根部之間成活率差異顯著 （P<0.05），而同一外植體在不同暗培養(yǎng)處理時間下，成活率差異不顯著（P>0.05）。

2.3 不同抗褐化劑預(yù)處理對三種外植體褐化的影響

將景寧木蘭外植體用1 g·L1Vc和1 g·L1PVP分別浸泡6 h，結(jié)果顯示景寧木蘭嫩葉、帶芽莖段及根部的褐化率均低于未經(jīng)處理的對照CK（P<0.05）（表3）。1 g·L1PVP預(yù)處理后的外植體抗褐化效果最好，與未經(jīng)預(yù)處理（CK）存在顯著差異（P<0.05）。帶芽莖段經(jīng)過1 g·L1PVP預(yù)處理后，褐化率由80.00%降為28.33%，顯著低于嫩葉（45.00%）及根部褐化率（63.33%） （P<0.05）。成活率統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖1：C），嫩葉、帶芽莖段與根部之間差異顯著（P<0.05），處理時間之間差異不顯著（P>0.05）。

2.4 不同濃度抗褐化劑處理對三種外植體褐化的影響

從表4可以看出，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的抗氧化劑、吸附劑均能顯著降低（P<0.05）景寧木蘭的褐化程度，但對于不同的外植體，降低褐化程度的有效抗褐化劑不同。景寧木蘭嫩葉作為外植體時，0.02 g·L1 AgNO3為最佳抗褐化劑，褐化率降低至16.67%，顯著低于其他抗褐化劑（P<0.05）；而2 g·L1CA為景寧木蘭帶芽莖段及根部的最優(yōu)抗褐化劑，褐化率分別從80.00%和70.00%（與CK對比）降低至30.00%和5.00%，與其他抗褐化劑相比，其抑制景寧木蘭褐化率效果最好（P<0.05）。成活率統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖1：D），嫩葉、帶芽莖段與根部之間差異顯著（P<0.05），不同處理間也差異顯著（P<0.05）。

3討論與結(jié)論

多數(shù)木本植物組培研究結(jié)果表明，外植體的褐化與外植體本身的年齡、部位、大小以及取材有著密切的關(guān)系（黃烈健等，2012）。高度分化的組織、樹齡越大、木質(zhì)化程度越高的外植體褐化程度高，幼嫩的材料褐化率相對較低，同時取材時間也是影響褐化的重要原因（崔堂兵等，2016）。一般植物外植體取材以冬春季節(jié)的嫩稍、嫩莖為主 （黃烈健和王鴻，2016），但景寧木蘭為先花后葉植物，葉芽在夏初萌動，因此本研究選擇初夏季節(jié)景寧木蘭的嫩葉、帶芽莖段為外植體，取材時間在夏初，有別于其他物種。同時，首次嘗試使用根部作為外植體，經(jīng)75%的酒精消毒處理8 min時，根部污染率為0，消毒14 min時，葉片及莖段的污染率分別為78.33%和25.00%，但因褐化的原因?qū)е氯N外植體組培成活率較低。

培養(yǎng)初期的黑暗環(huán)境培養(yǎng)可以降低景寧木蘭外植體的褐化程度（周麗艷等，2008；王歡等，2012；葉小玲等，2016）。這應(yīng)該是由于適當(dāng)?shù)暮诎堤幚斫档土送庵搀w內(nèi)受光誘導(dǎo)的多酚氧化酶等的活性，且使傷口細胞活化，在一定程度上減少了外植體酚類物質(zhì)的溢出，有利于芽的分化。但是，隨著暗處理時間的延長，葉片和莖段的褐化率顯著升高（P<0.05），推測其原因可能是由于光合作用被抑制，葉片和莖段自身保護酶活性降低，電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致細圖 1不同處理下三種外植體的存活率A. 不同消毒時間； B. 不同培養(yǎng)條件； C. 不同抗褐化劑預(yù)處理； D. 不同褐化劑濃度。

胞膜系統(tǒng)受到損傷，最終引起褐化。而根部本身對光不敏感，因而隨著暗培養(yǎng)時間的延長，根部褐化率顯著下降（P<0.05）。本研究中暗處理7 d時，葉和莖段的褐化率最低，根部暗處理14 d時褐化率最低驗證了以上觀點。

本研究中，使用PVP或Vc兩種抗褐化劑浸泡處理過的葉和莖段的褐化率明顯低于根，并且PVP對莖段褐化抑制效果最明顯。而在抗褐化劑處理下，根的褐化率反而最高，可能由于根部細胞組織結(jié)構(gòu)有別于葉片和莖段組織，在PVP等抗褐化劑長時間處理下，其細胞組織更容易受到抗褐化劑的破壞從而導(dǎo)致在處理8 min后，褐化率反而隨時間延長而增加的現(xiàn)象。將抗氧化劑和吸附劑加入培養(yǎng)基是遏制抗褐化的有效辦法（黃烈健和王鴻，2016）。不同部位和生理狀態(tài)下的外植體，酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性是有差異的（徐石等，2008；唐軍榮等，2014）。因此不同抗褐化劑對景寧木蘭的不同組織防褐化的效果存在差異。研究得出：接種前將景寧木蘭外植體在1 g·L1PVP浸泡6 h后可以有效降低外植體的褐化率；培養(yǎng)基中加入0.02 g·L1AgNO3景寧木蘭葉片褐化率最低，加入2 g·L1CA景寧木蘭帶芽莖段及根部褐化率最低。MS培養(yǎng)基含有大量的NH4+，容易引起酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，培養(yǎng)基中加入AgNO3，NO3-降低NH4+濃度（FettNeto et al，1992），促進了景寧木蘭愈傷組織的生長，降低了其褐化率。CA通過降低POD活性或結(jié)合培養(yǎng)基中的金屬離子抑制多酚氧化酶（PPO）的活性，防止酶促褐變，降低景寧木蘭外植體的褐化率。PVP通過吸附外植體產(chǎn)生的酚類和醌類物質(zhì)防止外植體的褐化。將PVP加入培養(yǎng)基中，防褐化及啟動效果顯著低于AgNO3和CA（P<0.05），可能是因為PVP在吸附外植體分泌到培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)時，同時延緩了細胞分裂素6芐氨基腺嘌呤（6BA）的作用（陳彪等，1999），刺激了多酚氧化酶的活性（Mulin，1995）。故而得出結(jié)論，在景寧木蘭的組織培養(yǎng)中，宜將外植體在PVP溶液中浸泡，而不適宜將其作為抗褐化劑加入至培養(yǎng)基中。

綜上所述，帶芽莖段及根部適宜作為景寧木蘭最佳外植體，在單因素的處理下，適當(dāng)?shù)暮诎堤幚怼? g·L1PVP預(yù)處理、培養(yǎng)基中加入2 g·L1CA，都可有效防止景寧木蘭褐化。但對于景寧木蘭組培過程中防褐化的問題仍需進一步的研究。

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