紀昌偉 陸宇豪 杜夢 王子元

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116）

摘要[目的]對一株從連云港青口鹵水中分離純化出的細菌LYG2#進行分類學(xué)鑒定。[方法]通過16S rRNA基因序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析和一系列生理生化指標測定對該細菌LYG2#進行鑒定。[結(jié)果]該菌為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為圓形，粉紅色。電鏡下觀察菌體為螺旋狀，長1.50～2.00 μm，寬0.24 μm。LYG2#最適生長鹽濃度為9.6%，最適生長溫度為32 ℃，最適pH為8.5。通過16S rRNA基因序列比對，發(fā)現(xiàn)其與Spiribacter salinus M19-40T的相似度最高，為95.98%。菌株LYG2#在中國科學(xué)院的保藏號為CGMCC 1.12136，GenBank序列登錄號為JQ087462。[結(jié)論]分離的菌株LYG2#為一株中度嗜鹽菌，是Spiribacter屬的一個新種資源。

關(guān)鍵詞中度嗜鹽菌；分類學(xué)鑒定；新種；連云港青口水樣

中圖分類號S182文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0005-03

Isolation and Identification of a Moderately Halophilic Bacterium LYG2#

JI Changwei， LU Yuhao， DU Meng et al

（School of Life Science， Jiangsu Normal University， Xuzhou， Jiangsu 221116）

Abstract[Objective] To identify a strain LYG2# isolated from Lianyungang Qingkou Salinas. [Method] We identified the strain LYG2# by means of 16S rRNA gene sequence blast， phylogenetic analysis and the determination of physiological and biochemical characteristics. [Result] The bacteria was gram negative， appeared pink and round colony. Strain LYG2# was spiral， the length of the bacteria was from 1.50 to 2.00 μm， and the width was 0.24 μm. The optimum salt concentration， temperature and pH were 9.6%， 32℃ and 8.5. By 16S rRNA gene sequence blast， the 16S rDNA of the strain LYG2# and Spiribacter salinus M1940T showed the highest similarity， was 95.98%. Strain LYG2# was preserved at China General Microbiological Culture Collection Center， the number was CGMCC 1.12136， the GenBank accession number for 16S rDNA of the strain was JQ087461. [Conclusion] The bacteria isolated was a moderately halophilic bacterium， and was a new species of the Spiribacter genus.

Key wordsModerately halophilic bacterium；Identify；New species；Lianyungang Qingkou Salinas

地球上存在著各種各樣的高鹽環(huán)境，它們大部分是由海水的蒸發(fā)而形成，鈉離子和氯離子是此類環(huán)境中的主要離子，其pH接近中性到弱堿性。嗜鹽菌是生活在此類高鹽環(huán)境中的主要微生物，這類微生物基因型獨特，生理機制和代謝產(chǎn)物也不同于一般細菌，已經(jīng)逐漸適應(yīng)了這種高鹽環(huán)境[1-3]。我國有各種各樣的高鹽環(huán)境，孕育了豐富的嗜鹽菌。

嗜鹽菌種類繁多，根據(jù)目前受到普遍認可的Kushner[4]的分類系統(tǒng)，按照嗜鹽菌對不同NaCl濃度的需求，大致可分為非嗜鹽細菌（<0.2 mol/L NaCl）、輕度嗜鹽菌（0.2～<0.5 mol/L NaCl）、中度嗜鹽菌（0.5～<2.5 mol/L NaCl）、極端嗜鹽菌（2.5～5.2 mol/L NaCl）以及耐鹽菌。中度嗜鹽菌生長的鹽濃度范圍相對較寬，其生長又對鹽有著絕對的依賴性，加之比較容易分離培養(yǎng)等優(yōu)點，引起了人們的廣泛關(guān)注，關(guān)于中度嗜鹽菌的相關(guān)報道也越來越多。

筆者從連云港青口水樣中分離純化出一株嗜鹽細菌LYG2#，并對其進行了分類學(xué)鑒定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌。菌株LYG2#從連云港青口（119°12′～119°15′ E，34°40′～34°42′ N）鹵水中分離得到。

1.1.2試劑。DNA Marker、限制性內(nèi)切酶等購自Fermentas 公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3主要儀器。恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.4培養(yǎng)基。10% MGM培養(yǎng)基（1 L）：30%人工海水333 mL，蛋白胨5 g，酵母膏1 g。配制固體培養(yǎng)基時加1.5%瓊脂。其他鹽濃度的培養(yǎng)基采用相同方法配制。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化。用20%的人工海水，按照10-2、10-3、10-4梯度稀釋樣品，吸取0.1 mL稀釋液涂10% MGM平板，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)?？偱囵B(yǎng)時間為30 d左右，在此期間注意觀察，根據(jù)形態(tài)、顏色、大小對平板上生長的單菌落進行篩選。為了確保菌種的純度，每個單菌落劃線3次，純化后的細菌分別保存于-80 ℃和室溫。將斜面保存的細菌寄存到中國科學(xué)院微生物保存中心進行保藏。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定。將菌株LYG2#在10% MGM固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察。

1.2.3生理生化指標的鑒定。生化和酶學(xué)鑒定參考東秀珠等[5]的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，測定菌株的各種特征?？股孛舾性囼瀰⒄彰绹鴩遗R床實驗室標準委員會推薦的K-B法（紙片擴散法）[6]。

1.2.4化學(xué)指標的測定。菌株基因組G+C含量的測定采用熱變性法[7]，用Thermo scientific Evolution 300測定Tm值，細菌DNA（G+C）mol%=（Tm - 69.3）×2.44。脂肪酸、呼吸醌測定由德國DSMZ公司完成。

1.2.5

菌株最適生長環(huán)境的測定。

1.2.5.1最適生長鹽濃度。將菌株LYG2#等量的菌液分別接種于鹽濃度為5.6%、6.4%、8.0%、9.6%、11.2%、12.8%、14.4%、16.0%、17.6%、19.2%的MGM液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)。

1.2.5.2最適生長溫度。將菌株LYG2#等量的菌液接種于最適鹽濃度的MGM液體培養(yǎng)基中，分別于22、28、32、37、42、46、50 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.5.3最適生長pH。將菌株LYG2#等量的菌液接種于最適鹽濃度，pH為6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的MGM液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.6菌株16S rRNA 基因序列分析以及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。依據(jù)總基因組提取方法獲得基因組DNA，利用通用引物對（B27F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，B1492R：CTACGGTTA CCTTGTTACGAC）對菌株16S rRNA 基因進行擴增。 PCR擴增體系：10×PCR緩沖液5.0 μL，B27F（10 μmol/L）2.0 μL，B1492R（10 μmol/L）2.0 μL，dNTPs（5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，Taq DNA聚合酶（5.0 U/μL）0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，加水至50.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆，送上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序，測序引物是通用引物T7和SP6。將測序得到的菌株16S rDNA序列到GenBank和EzTaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫上進行同源性搜索，獲得序列同源性高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列。用CLUSAL X 1.83軟件包進行序列比對。通過MEGA version 4.1軟件，使用Neighbour-joining法[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過1 000次獨立取樣確定其Bootstrap值。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的采集與分離

細菌分離自連云港青口鹵水樣中，命名為LYG2#。該菌株已保存于CGMCC，保藏號為CGMCC1.12136。

2.2菌株的形態(tài)學(xué)特征

菌株LYG2#接種于10% MGM平板，生長6 d后的菌落形態(tài)為圓形，粉紅色小菌落，菌落凸起，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色為陰性，電鏡下觀察菌體為螺旋狀，長1.50～2.00 μm，寬約0.25 μm（圖1）。

2.3菌株的生理生化特性

菌株LYG2#氧化酶和接觸酶反應(yīng)呈陽性；MR和VP反應(yīng)呈陰性；硝酸還原的生化反應(yīng)呈陰性。此外，該菌株不產(chǎn)生吲哚和H2S；表1列出了菌株LYG2#具體的碳源利用和糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)的結(jié)果；表2列出了菌株LYG2#抗生素敏感試驗的結(jié)果。

2.4菌株的化學(xué)特性

LYG2#基因組G+C含量為66.6%，經(jīng)德國DSMZ公司測定菌株LYG2#合成的主要脂肪酸為C18∶1 ω7C（44.54%）、C16∶0（14.27%）、C19∶0 CYCLO ω8C（1216%）和C12∶0（4.76%）。主要呼吸醌為輔酶Q8。

2.5菌株的最適生長環(huán)境

2.5.1菌株的最適生長鹽濃度。LYG2#可耐受的鹽濃度范圍很廣，最佳生長鹽濃度為9.6%（圖2）。

2.5.2菌株的最適生長溫度。LYG2#的最適生長溫度為32 ℃（圖3）。

2.5.3菌株的最適生長pH。LYG2#的最適生長pH為8.5（圖4）。

2.6菌株16S rRNA序列分析與構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

LYG2#的16S rRNA基因序列全長為1 502 bp（GenBank：JQ087462）。

將測序得到的序列在NCBI中的Blast和EzTaxon server 2.1中分別進行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株和最近的模式種Spiribacter salinus M19-40T的相似度最高，為95.98%，與其他模式種的相似度均在95.00%以下。分析系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系，獲得進化樹（圖5）。

從進化樹上看，LYG2#與Spiribacter salinus M19-40T單獨聚類在一起，與其他的菌種不在一個分支上，可以斷定菌株LYG2#屬于Spiribacter屬。而Spiribacter屬目前只有這一個有效的命名種[9]。將菌株LYG2#與模式種Spiribacter salinus M19-40T進行了特征比較（表3）。結(jié)果表明，LYG2#與Spiribacter salinus M19-40T大多數(shù)的特征是相似的，卻又在最適鹽濃度、最適溫度以及主要脂肪酸含量上有所不同，表現(xiàn)出一定的獨特性。

3結(jié)論

從連云港青口鹵水中分離純化出一株嗜鹽細菌LYG2#，并對該細菌進行了多項分類學(xué)鑒定。根據(jù)16S rRNA基因序列相似性、生理生化特性研究以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，判斷LYG2#為Spiribacter屬的一個新種資源，命名為Spiribacter lygqingkouensis sp.nov.。該菌可以耐受很廣的鹽濃度范圍，其生長對鹽濃度有嚴格的依賴性，是一株中度嗜鹽菌。自然界中嗜鹽微生物具有極其豐富的多樣性，新發(fā)現(xiàn)的嗜鹽微生物的數(shù)量也越來越多，人們對這些微生物的研究也逐漸深入，嗜鹽菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用也會越來越廣泛。

參考文獻

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