劉肖++金曉娟+趙釗

[摘要] 目的 探討人CCR9基因在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。 方法 取扁桃體標(biāo)本并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增CCR9基因，連接至pEGFP-N2質(zhì)粒，脂質(zhì)體感染人MCF-7乳腺癌細(xì)胞。免疫印跡證實(shí)CCR9基因在MCF-7乳腺癌細(xì)胞表達(dá)。CCK-8方法檢測(cè)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖。 結(jié)果 免疫印跡證實(shí)構(gòu)建pEGFP-N2-CCR9質(zhì)粒及CCR9基因在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)，且CCR9基因能促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞過(guò)度增殖和侵襲（P<0.05或P<0.01）。 結(jié)論 CCR9基因促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。

[關(guān)鍵詞] CCR9；增殖；侵襲；乳腺癌細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）35-0028-03

Effects of CCR9 on proliferation and invasion of breast cancer MCF-7 cells

LIU Xiao1 JIN Xiaojuan1 ZHAO Zhao2

1.Clinical Laboratory， The 117 Hospital of PLA， Hangzhou 310012， China； 2.Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To explore the biological function of human CCR9 gene in breast cancer cells. Methods Tonsil samples were taken and reverse-transcripted into cDNA. CCR9 gene was amplified， and was ligated to pEGFP-N2 plasmid. MCF-7 human breast cancer cells were infected by liposome. Immunoblotting confirmed the expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCK-8 assay was used to detect the proliferation of MCF-7 breast cancer cells. Results Western blot confirmed the construction of pEGFP-N2-CCR9 plasmid and efficient and stable expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCR9 gene could promote the over-proliferatioin and invasion of MCF-7 breast cancer cells（P<0.05 or P<0.01）. Conclusion CCR9 gene promotes the proliferation and invasion of MCF-7 breast cancer cells.

[Key words] CCR9； Proliferation； Invasion； Breast cancer cells

趨化因子是分子量為10 kDa左右的一類小分子蛋白，與相對(duì)應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合具有趨化白細(xì)胞的功能。趨化因子受體是具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體。趨化因子受體9（CC chemokine receptor 9，CCR9）與其相對(duì)應(yīng)的配體CCL25結(jié)合后與T淋巴細(xì)胞的趨化有關(guān)。趨化因子受體及其配體廣泛參與機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移等各種生理病理過(guò)程。趨化因子及受體的相互結(jié)合在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中扮演非常重要的作用，腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞表達(dá)特定的趨化因子受體，其受體與配體的相互結(jié)合引起腫瘤細(xì)胞的定向其靶器官的轉(zhuǎn)移或免疫抑制細(xì)胞的招募，從而最終引起患者死亡。

乳腺癌的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預(yù)后的重要因素，對(duì)預(yù)測(cè)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的研究具有重要的臨床意義，其中趨化因子受體CCR9表達(dá)于大部分腫瘤細(xì)胞上，它的高表達(dá)會(huì)通過(guò)相應(yīng)的細(xì)胞骨架信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，趨化因子及其受體在乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移中的作用引起了重視[1，3]。本研究通過(guò)在人MCF-7乳腺癌細(xì)胞過(guò)度表達(dá)CCR9，并分析與乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)功能指標(biāo)，初步探討CCR9在乳腺癌細(xì)胞中的功能。

1 材料與方法

1.1乳腺癌細(xì)胞和質(zhì)粒

1640培養(yǎng)基購(gòu)自杭州Invitrogen公司，人MCF-7細(xì)胞購(gòu)自北京細(xì)胞庫(kù)，pEGFP-N2質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。

1.2試劑

限制性內(nèi)切酶BglII和SalI（美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：R6085、R6051）；T4連接酶（美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：M1801）；胎牛血清（杭州四季青公司，貨號(hào)：HB0205）；有基質(zhì)膠的Transwell（美國(guó)BD公司，貨號(hào)：356234）；人CCR9一抗（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab32556），大腸桿菌DH5α菌株購(gòu)自杭州達(dá)科為公司，質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工公司，貨號(hào)B518191），Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，引物由上海生工公司合成，CCK-8（CK04，日本同仁公司）。

1.3 方法

1.3.1 人MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃的5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3.2 構(gòu)建pEGFP-N2-CCR9 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株 取正常人手術(shù)切除扁桃體標(biāo)本，提取總RNA，在引物前后各加入BglII和SalI酶切位點(diǎn)，Taq酶擴(kuò)增CCR9的基因，取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳。將產(chǎn)物和pEGFP-N2質(zhì)粒酶切，電泳回收并用T4連接酶連接，再將質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化，搖菌并提取質(zhì)粒。用1640培養(yǎng)基液稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體混勻并孵育20 min加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

1.3.3 免疫印跡檢測(cè)CCR9蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，100℃變性10 min并用免疫印跡電泳。用5%BSA將NC膜孵育0.5 h，加入β-actin或CCR9抗體與NC膜孵育1 h。用PBS溶液洗4次，加入HRP二抗，孵育0.5 h，PBS溶液洗4次，最后顯影。

1.3.4 檢測(cè)CCR9對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MCF-7細(xì)胞和MCF-7-CCR9細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到1、2和3 d 時(shí)，每一孔加入10 μL CCK-8并于在培養(yǎng)箱中孵育45 min，然后酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.3.5 檢測(cè)CCR9對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲的影響 將MCF-7或MCF-7-CCR9細(xì)胞分別接種到含有基質(zhì)膠的Transwell板上。下面再加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加100%甲醇固定小室5 min，用結(jié)晶紫染色30 min，最后清洗拍照。

2 結(jié)果

2.1 在MCF-7乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)后CCR9蛋白的表達(dá)

免疫印跡顯示CCR9和β-actin在特定位置有特異性條帶。MCF-7-CCR9細(xì)胞組比MCF-7組顏色加深（封三圖5），證實(shí)MCF-7-CCR9組中CCR9蛋白表達(dá)量比MCF-7組顯著升高（封三圖5）。

2.2 過(guò)表達(dá)CCR9對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

使用CCK-8實(shí)驗(yàn)在1、2和3 d測(cè)定細(xì)胞增殖并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示CCR9對(duì)過(guò)表達(dá)CCR9的MCF-7細(xì)胞增殖顯著上升（P<0.05）（封三圖6）。

2.3過(guò)表達(dá)CCR9對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)

鋪有基質(zhì)膠的侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CCR9的MCF-7細(xì)胞侵襲能力顯著上升（封三圖7A、7B），MCF-7-CCR9及MCF-7或每組拍照5個(gè)視野并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示CCR9對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力顯著上升（P<0.01，封三圖7C）。

3 討論

趨化因子為機(jī)體免疫細(xì)胞分泌的小分子活性蛋白，活化的免疫細(xì)胞可產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的趨化因子。當(dāng)趨化因子與其受體相互結(jié)合后，可促進(jìn)細(xì)胞的歸巢和造血組織和器官形成[4]。許多研究證實(shí)，趨化因子的受體及其配體的相互作用與腫瘤細(xì)胞的定向遷移有著緊密的聯(lián)系[5-7]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)具有特異組織性長(zhǎng)期過(guò)程，原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移到特定組織的分子相關(guān)機(jī)制的研究并不十分明確。目前有很多學(xué)說(shuō)可以解釋腫瘤轉(zhuǎn)移：包括種子土壤學(xué)說(shuō)等。但最近研究顯示，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，趨化因子不僅參與了正常淋巴細(xì)胞的趨化，也參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并非隨意性，轉(zhuǎn)移到特定器官的惡性腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)出高度的組織特異性[5]。大量研究證實(shí)特定分子能促進(jìn)其增殖和侵襲，其中包括增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞粘附到特定組織的內(nèi)皮細(xì)胞上：如靶器官會(huì)釋放大量的趨化因子，而靶器官分泌相對(duì)應(yīng)的趨化因子則能招募對(duì)應(yīng)表達(dá)相應(yīng)趨化因子受體的腫瘤細(xì)胞招募并大量生長(zhǎng)[7]。在腫瘤細(xì)胞定向遷移的過(guò)程中，趨化因子則會(huì)通過(guò)與表達(dá)相應(yīng)趨化因子受體的腫瘤細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)重排，促使腫瘤細(xì)胞能夠穿透淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞，并最終轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端器官，從而在遠(yuǎn)端器官定植，擴(kuò)增，形成轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致患者的重要器官功能衰竭并死亡。

大量研究證實(shí)：趨化因子受體CCR9與對(duì)應(yīng)配體趨化因子CCL25的結(jié)合在腫瘤細(xì)胞的組織特異性轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[8-10]，例如：Zhong Y等[11]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常的肺組織，CCR9在肺癌組織中高表達(dá)，而且CCR9的表達(dá)水平與肺癌腫瘤組織的大小，淋巴結(jié)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及TNM腫瘤分期密切相關(guān)，且高表達(dá)CCR9的肺癌病人比低表達(dá)CCR9的肺癌病人生存期短，且是肺癌病人預(yù)后的獨(dú)立因子。體外實(shí)驗(yàn)也支持CCR9-CCL25相互作用對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力上發(fā)揮重要作用，CCR9-CCL25之間的相互作用能夠防止肺癌細(xì)胞過(guò)度凋亡，包括上調(diào)抗凋亡蛋白，下調(diào)凋亡蛋白，并且這種作用是依賴PI3K-/Akt 信號(hào)通路完成的，如果抑制PI3K-/Akt 信號(hào)通路，CCR9-CCL25之間的相互作用就會(huì)消失。此外，如果在運(yùn)用慢病毒構(gòu)建的CCR9干擾質(zhì)粒，肺癌細(xì)胞則會(huì)過(guò)度的凋亡，體內(nèi)小鼠動(dòng)物模型中腫瘤的負(fù)擔(dān)也會(huì)明顯減小[12-14]。另外，CCR9在前列腺癌細(xì)胞上也有高度表達(dá)，CCR9高表達(dá)在LNCaP和PC3前列癌細(xì)胞上，而不表達(dá)或低表達(dá)于正常的前列腺上皮細(xì)胞，抗體阻斷CCL25-CCR9的相互結(jié)合可以顯著減低LNCaP和PC3前列腺癌細(xì)胞的近端侵襲與遠(yuǎn)端遷移，并且CCL25影響了膠原酶I和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1，MMP-13，MMP-10，MMP-11，MMP-2，而不是通過(guò)MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-12，or MMP-14，說(shuō)明CCL25-CCR9的相互作用還會(huì)通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和降解來(lái)促進(jìn)腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[15]。

此外，Johnson-Holiday C等[16，17]應(yīng)用半定量免疫組化證實(shí)，CCR9在中低分化的乳腺癌組織中的表達(dá)量高于正常乳腺導(dǎo)管組織，且與乳腺癌細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)胞水平上，惡性MDA-MD-231乳腺癌細(xì)胞上的CCR9表達(dá)顯著高于低惡性MCF-7，阻斷CCR9顯著降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。另外，CCR9-CCL25相互作用可以顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。隨后研究也顯示，CCL25趨化因子可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的過(guò)度增殖和抑制乳腺癌細(xì)胞的正常凋亡，可能是CCL25誘導(dǎo)PI3K信號(hào)通路等生存信號(hào)的活化來(lái)完成的。因此，CCL25也可能通過(guò)PI3K信號(hào)通路來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，侵襲和遷移。

Heinrich EL等[18，19]發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞能夠分泌CCR9對(duì)應(yīng)的趨化因子CCL25，并可通過(guò)自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。并用免疫組化方法檢測(cè)了胰腺癌組織和癌旁組織CCR9和CCL25的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示胰腺癌組織高度表達(dá)趨化因子受體CCR9，但癌旁組織中沒(méi)有CCR9的表達(dá)，同樣，胰腺癌組織高度表達(dá)趨化因子CCL25，但癌旁組織中沒(méi)有CCL25表達(dá)。從而在胰腺癌組織中，高度表達(dá)的CCR9和CCL25相互作用進(jìn)一步促進(jìn)了胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。此外，PANC-1胰腺癌細(xì)胞也分泌CCL25，并且用CCR9的抗體能夠阻止胰腺癌細(xì)胞的侵襲。

Chamorro S等[20]構(gòu)建了特異性的CCR9抗體，并發(fā)現(xiàn)在急性T淋巴細(xì)胞白血病的免疫缺陷小鼠模型中使用CCR9抗體會(huì)減少85%腫瘤的大小，在腫瘤組織部位也伴隨著大量凋亡的腫瘤細(xì)胞和壞死區(qū)域，腫瘤細(xì)胞的增值率和腫瘤部位異常豐富的血供也明顯減少。并且在體外T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞加入CCR9抗體，會(huì)導(dǎo)致白血病細(xì)胞的溶解。同樣，在黑色素瘤，乳腺癌小鼠腫瘤模型應(yīng)用了此種抗體，小鼠的腫瘤體積都明顯減少。

總之，我們的初步研究中成功構(gòu)建了CCR9 的表達(dá)質(zhì)粒，并證實(shí)CCR9在體外能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖，為以后的小鼠功能學(xué)研究做了鋪墊。

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（收稿日期：2016-08-04）