郭旭超
摘 要:目的 分析制藥廢水中活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的組成。方法 以采集的制藥廢水為研究對(duì)象,經(jīng)處理后,利用MPN法分離VBNC狀態(tài)細(xì)菌,并利用Rpf誘導(dǎo),分析VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成。結(jié)果 制藥廢水中,存在具有優(yōu)勢(shì)的、敏感于Rpf的VBNC菌群,其組成包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等。結(jié)論 VBNC狀態(tài)細(xì)菌存在于制藥廢水中,為深度處理制藥廢水方法的研制提供參考。
關(guān)鍵詞:生物反應(yīng)器 制藥廢水 活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌
中圖分類號(hào):G8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1672-3791(2017)04(a)-0245-02
近年來,人們不斷提升藥品需求,促使制藥行業(yè)快速的發(fā)展,由此也增加了制藥廢水的排放量。在制藥廢水中,鹽、難溶化合物、有機(jī)物、無機(jī)物等均包含其中,且具有比較高的化學(xué)需氧量,處理時(shí),無論是化學(xué)法或是物理法,都難以有效處理,因此,制藥廢水處理研究中,熱點(diǎn)問題即為微生物處理技術(shù)的開發(fā)[1]。該文以微生物學(xué)為切入點(diǎn),分析制藥廢水中VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成,現(xiàn)報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
制藥廢水:采集于制藥公司,尚未進(jìn)行處理,置入生物反應(yīng)器中,分別進(jìn)行30 d、61 d、183 d及361 d的連續(xù)流運(yùn)行,在生物反應(yīng)器最初出水段的三點(diǎn)分別進(jìn)行取樣,折算為干重后,共3 g,于100 mL錐形瓶中放置,將蒸餾水27 mL加入其中,進(jìn)行20 min的攪拌,保證充分混勻,制成懸液待用。
試驗(yàn)菌種:藤黃微球菌,來源于分子細(xì)胞生物學(xué)研究所,制備菌種DNA,按照規(guī)定方法進(jìn)行,將其Rpf基因確定,同時(shí),保證其表達(dá)于大腸桿菌中。
主要儀器及試劑:PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒等。
1.2 方法
1.2.1 制備培養(yǎng)基
反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基選擇為MPN培養(yǎng)系液體培養(yǎng)基,高壓滅菌15 min;由PYM培養(yǎng)基作為MPN培養(yǎng)系分離純化培養(yǎng)基,高壓滅菌15 min。
1.2.2 MPN法和MPN培養(yǎng)系
樣品中,可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的統(tǒng)計(jì)利用MPN法、MPN培養(yǎng)系進(jìn)行。培養(yǎng)容器選擇為透明玻璃瓶,容量2.5~5.0 mL,于液體培養(yǎng)基中加入10%制備液(其中含有Rpf),作為實(shí)驗(yàn)組,于另外液體培養(yǎng)基中加入10%制備液(不含Rpf),作為對(duì)照組,稀釋10%的樣品懸液,濃度梯度為10倍,直至10~6停止,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均分別進(jìn)行3次,靜置培養(yǎng)時(shí)溫度維持在30℃。以生物反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間為依據(jù),將兩組吸光值的變化(OD660)測(cè)量出來,同時(shí),結(jié)合肉眼判斷,將兩組培育液混濁情況準(zhǔn)確記錄,有混濁為陽性,否則為陰性。根據(jù)MPN值,查出兩組細(xì)菌總數(shù)。
1.2.3 判斷Rpf閾值、VBNC狀態(tài)菌
Rpf閾值為實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)與對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)的比值。Rpf閾值在5以上時(shí),實(shí)驗(yàn)組最前方培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后表現(xiàn)為混濁,為陽性,對(duì)照組為陰性,稀釋平板分離實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液后,可得到單位樣品中總數(shù)屬于優(yōu)勢(shì)的VBNC狀態(tài)菌;Rpf閾值為5~1時(shí),稀釋平板分離兩組最前方混濁培養(yǎng)液,對(duì)細(xì)菌落形態(tài)特征存在的差異做出判斷,特征性菌落為實(shí)驗(yàn)組特有時(shí),表明VBNC狀態(tài)細(xì)菌敏感于Rpf。
1.2.4 分離菌株
依照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行VBNC狀態(tài)細(xì)菌DNA的提取,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析分離出來的菌株。
2 結(jié)果
2.1 MPN值與樣品細(xì)菌總數(shù)
生物反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間不同時(shí),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的MPN值、細(xì)菌總數(shù)見表1。經(jīng)計(jì)算可知,運(yùn)行30 d時(shí),VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為94.1%;運(yùn)行61 d時(shí),VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率97.9%;運(yùn)行183 d時(shí),VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為55.1%;運(yùn)行361 d時(shí),VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為48.0%(VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)-對(duì)照組細(xì)菌總數(shù))/實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)×100%)。見表1。
2.2 Rpf閾值、OD660值
由Rpf閾值可知,處于優(yōu)勢(shì)的、敏感于Rfp的VBNC狀態(tài)菌存在于單位樣品中。由OD660值可知,實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組,Rpf具有刺激細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。
2.3 菌株分離結(jié)果
實(shí)驗(yàn)組經(jīng)培養(yǎng)分離后,在分離中,發(fā)現(xiàn)包含豐富的菌株類型,主要為革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌。
3 討論
在制藥行業(yè)生產(chǎn)過程中,會(huì)產(chǎn)生大量的制藥廢水,屬于有機(jī)廢水,濃度比較高,降解難度大?,F(xiàn)階段,主要包含6種制藥廢水,分別為化學(xué)合成類、發(fā)酵類、提取類、傳統(tǒng)中藥類、混裝制劑類、生物工程類,其中,占據(jù)比重比較大的為化學(xué)合成類和發(fā)酵類,這兩類的污染程度也比較高[2]?;谥扑帍U水的特殊特點(diǎn),行業(yè)研究的熱點(diǎn)問題之一即為開發(fā)出高效的微生物處理技術(shù),以能有效地處理制藥廢水。
該研究中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)加入了含有Rpf的制備液,對(duì)照組加入的制備液中則不含有Rpf,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌總數(shù)多于對(duì)照組,而且OD660值也高于對(duì)照組,這說明,Rpf蛋白能夠刺激部分細(xì)菌菌種的生長(zhǎng)。此外,經(jīng)分離實(shí)驗(yàn)組VBNC狀態(tài)細(xì)菌后,得到的菌株類型包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等,均屬于近緣菌。實(shí)際上,采用普通方法培養(yǎng)細(xì)菌時(shí),這些細(xì)菌并無法獲取,不過利用Rpf蛋白誘導(dǎo)后,改變了細(xì)菌的VBNC狀態(tài),變?yōu)榭膳囵B(yǎng)狀態(tài),從而被分離出來,這表示,Rpf蛋白能夠復(fù)蘇、刺激革蘭氏陽性菌及陰性菌生長(zhǎng)的作用。
綜上所述,制藥廢水在生物反應(yīng)器作用下,經(jīng)Rpf蛋白的誘導(dǎo),能夠分離出處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌,并能刺激其復(fù)活、生長(zhǎng),有利于深入的認(rèn)識(shí)其中VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成,為微生物處理技術(shù)的開發(fā)提供參考。
參考文獻(xiàn)
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