郭旭超

摘 要：目的 分析制藥廢水中活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的組成。方法 以采集的制藥廢水為研究對象，經(jīng)處理后，利用MPN法分離VBNC狀態(tài)細菌，并利用Rpf誘導，分析VBNC狀態(tài)細菌的組成。結(jié)果 制藥廢水中，存在具有優(yōu)勢的、敏感于Rpf的VBNC菌群，其組成包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等。結(jié)論 VBNC狀態(tài)細菌存在于制藥廢水中，為深度處理制藥廢水方法的研制提供參考。

關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器 制藥廢水 活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細菌

中圖分類號：G8 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）04（a）-0245-02

近年來，人們不斷提升藥品需求，促使制藥行業(yè)快速的發(fā)展，由此也增加了制藥廢水的排放量。在制藥廢水中，鹽、難溶化合物、有機物、無機物等均包含其中，且具有比較高的化學需氧量，處理時，無論是化學法或是物理法，都難以有效處理，因此，制藥廢水處理研究中，熱點問題即為微生物處理技術(shù)的開發(fā)[1]。該文以微生物學為切入點，分析制藥廢水中VBNC狀態(tài)細菌的組成，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

制藥廢水：采集于制藥公司，尚未進行處理，置入生物反應(yīng)器中，分別進行30 d、61 d、183 d及361 d的連續(xù)流運行，在生物反應(yīng)器最初出水段的三點分別進行取樣，折算為干重后，共3 g，于100 mL錐形瓶中放置，將蒸餾水27 mL加入其中，進行20 min的攪拌，保證充分混勻，制成懸液待用。

試驗菌種：藤黃微球菌，來源于分子細胞生物學研究所，制備菌種DNA，按照規(guī)定方法進行，將其Rpf基因確定，同時，保證其表達于大腸桿菌中。

主要儀器及試劑：PCR反應(yīng)擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)、UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 制備培養(yǎng)基

反硝化細菌培養(yǎng)基選擇為MPN培養(yǎng)系液體培養(yǎng)基，高壓滅菌15 min；由PYM培養(yǎng)基作為MPN培養(yǎng)系分離純化培養(yǎng)基，高壓滅菌15 min。

1.2.2 MPN法和MPN培養(yǎng)系

樣品中，可培養(yǎng)細菌總數(shù)的統(tǒng)計利用MPN法、MPN培養(yǎng)系進行。培養(yǎng)容器選擇為透明玻璃瓶，容量2.5～5.0 mL，于液體培養(yǎng)基中加入10%制備液（其中含有Rpf），作為實驗組，于另外液體培養(yǎng)基中加入10%制備液（不含Rpf），作為對照組，稀釋10%的樣品懸液，濃度梯度為10倍，直至10～6停止，實驗組與對照組均分別進行3次，靜置培養(yǎng)時溫度維持在30℃。以生物反應(yīng)器運行時間為依據(jù)，將兩組吸光值的變化（OD660）測量出來，同時，結(jié)合肉眼判斷，將兩組培育液混濁情況準確記錄，有混濁為陽性，否則為陰性。根據(jù)MPN值，查出兩組細菌總數(shù)。

1.2.3 判斷Rpf閾值、VBNC狀態(tài)菌

Rpf閾值為實驗組細菌總數(shù)與對照組細菌總數(shù)的比值。Rpf閾值在5以上時，實驗組最前方培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后表現(xiàn)為混濁，為陽性，對照組為陰性，稀釋平板分離實驗組培養(yǎng)液后，可得到單位樣品中總數(shù)屬于優(yōu)勢的VBNC狀態(tài)菌；Rpf閾值為5～1時，稀釋平板分離兩組最前方混濁培養(yǎng)液，對細菌落形態(tài)特征存在的差異做出判斷，特征性菌落為實驗組特有時，表明VBNC狀態(tài)細菌敏感于Rpf。

1.2.4 分離菌株

依照相應(yīng)的試劑盒說明書進行VBNC狀態(tài)細菌DNA的提取，并進行PCR擴增，分析分離出來的菌株。

2 結(jié)果

2.1 MPN值與樣品細菌總數(shù)

生物反應(yīng)器運行時間不同時，實驗組和對照組的MPN值、細菌總數(shù)見表1。經(jīng)計算可知，運行30 d時，VBNC狀態(tài)菌復活率為94.1%；運行61 d時，VBNC狀態(tài)菌復活率97.9%；運行183 d時，VBNC狀態(tài)菌復活率為55.1%；運行361 d時，VBNC狀態(tài)菌復活率為48.0%（VBNC狀態(tài)菌復活率=（實驗組細菌總數(shù)-對照組細菌總數(shù)）/實驗組細菌總數(shù)×100%）。見表1。

2.2 Rpf閾值、OD660值

由Rpf閾值可知，處于優(yōu)勢的、敏感于Rfp的VBNC狀態(tài)菌存在于單位樣品中。由OD660值可知，實驗組均高于對照組，Rpf具有刺激細菌生長的作用。

2.3 菌株分離結(jié)果

實驗組經(jīng)培養(yǎng)分離后，在分離中，發(fā)現(xiàn)包含豐富的菌株類型，主要為革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌。

3 討論

在制藥行業(yè)生產(chǎn)過程中，會產(chǎn)生大量的制藥廢水，屬于有機廢水，濃度比較高，降解難度大。現(xiàn)階段，主要包含6種制藥廢水，分別為化學合成類、發(fā)酵類、提取類、傳統(tǒng)中藥類、混裝制劑類、生物工程類，其中，占據(jù)比重比較大的為化學合成類和發(fā)酵類，這兩類的污染程度也比較高[2]。基于制藥廢水的特殊特點，行業(yè)研究的熱點問題之一即為開發(fā)出高效的微生物處理技術(shù)，以能有效地處理制藥廢水。

該研究中，實驗組細菌培養(yǎng)時加入了含有Rpf的制備液，對照組加入的制備液中則不含有Rpf，結(jié)果顯示，實驗組的細菌總數(shù)多于對照組，而且OD660值也高于對照組，這說明，Rpf蛋白能夠刺激部分細菌菌種的生長。此外，經(jīng)分離實驗組VBNC狀態(tài)細菌后，得到的菌株類型包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等，均屬于近緣菌。實際上，采用普通方法培養(yǎng)細菌時，這些細菌并無法獲取，不過利用Rpf蛋白誘導后，改變了細菌的VBNC狀態(tài)，變?yōu)榭膳囵B(yǎng)狀態(tài)，從而被分離出來，這表示，Rpf蛋白能夠復蘇、刺激革蘭氏陽性菌及陰性菌生長的作用。

綜上所述，制藥廢水在生物反應(yīng)器作用下，經(jīng)Rpf蛋白的誘導，能夠分離出處于VBNC狀態(tài)的細菌，并能刺激其復活、生長，有利于深入的認識其中VBNC狀態(tài)細菌的組成，為微生物處理技術(shù)的開發(fā)提供參考。

參考文獻

[1] 康得軍，謝丹瑜，唐虹，等.微生物胞外聚合物在水環(huán)境中的應(yīng)用研究[J].工業(yè)水處理，2016，13（9）：11-15.

[2] 高學宇.Rpf對印染廢水中VBNC菌復蘇活化的研究[J].環(huán)境科學導刊，2016，21（S1）：110-117.