郭旭超

摘 要：目的 分析制藥廢水中活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的組成。方法 以采集的制藥廢水為研究對(duì)象，經(jīng)處理后，利用MPN法分離VBNC狀態(tài)細(xì)菌，并利用Rpf誘導(dǎo)，分析VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成。結(jié)果 制藥廢水中，存在具有優(yōu)勢(shì)的、敏感于Rpf的VBNC菌群，其組成包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等。結(jié)論 VBNC狀態(tài)細(xì)菌存在于制藥廢水中，為深度處理制藥廢水方法的研制提供參考。

關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器 制藥廢水 活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌

中圖分類號(hào)：G8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）04（a）-0245-02

近年來，人們不斷提升藥品需求，促使制藥行業(yè)快速的發(fā)展，由此也增加了制藥廢水的排放量。在制藥廢水中，鹽、難溶化合物、有機(jī)物、無機(jī)物等均包含其中，且具有比較高的化學(xué)需氧量，處理時(shí)，無論是化學(xué)法或是物理法，都難以有效處理，因此，制藥廢水處理研究中，熱點(diǎn)問題即為微生物處理技術(shù)的開發(fā)[1]。該文以微生物學(xué)為切入點(diǎn)，分析制藥廢水中VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

制藥廢水：采集于制藥公司，尚未進(jìn)行處理，置入生物反應(yīng)器中，分別進(jìn)行30 d、61 d、183 d及361 d的連續(xù)流運(yùn)行，在生物反應(yīng)器最初出水段的三點(diǎn)分別進(jìn)行取樣，折算為干重后，共3 g，于100 mL錐形瓶中放置，將蒸餾水27 mL加入其中，進(jìn)行20 min的攪拌，保證充分混勻，制成懸液待用。

試驗(yàn)菌種：藤黃微球菌，來源于分子細(xì)胞生物學(xué)研究所，制備菌種DNA，按照規(guī)定方法進(jìn)行，將其Rpf基因確定，同時(shí)，保證其表達(dá)于大腸桿菌中。

主要儀器及試劑：PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 制備培養(yǎng)基

反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基選擇為MPN培養(yǎng)系液體培養(yǎng)基，高壓滅菌15 min；由PYM培養(yǎng)基作為MPN培養(yǎng)系分離純化培養(yǎng)基，高壓滅菌15 min。

1.2.2 MPN法和MPN培養(yǎng)系

樣品中，可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的統(tǒng)計(jì)利用MPN法、MPN培養(yǎng)系進(jìn)行。培養(yǎng)容器選擇為透明玻璃瓶，容量2.5～5.0 mL，于液體培養(yǎng)基中加入10%制備液（其中含有Rpf），作為實(shí)驗(yàn)組，于另外液體培養(yǎng)基中加入10%制備液（不含Rpf），作為對(duì)照組，稀釋10%的樣品懸液，濃度梯度為10倍，直至10～6停止，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均分別進(jìn)行3次，靜置培養(yǎng)時(shí)溫度維持在30℃。以生物反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間為依據(jù)，將兩組吸光值的變化（OD660）測(cè)量出來，同時(shí)，結(jié)合肉眼判斷，將兩組培育液混濁情況準(zhǔn)確記錄，有混濁為陽性，否則為陰性。根據(jù)MPN值，查出兩組細(xì)菌總數(shù)。

1.2.3 判斷Rpf閾值、VBNC狀態(tài)菌

Rpf閾值為實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)與對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)的比值。Rpf閾值在5以上時(shí)，實(shí)驗(yàn)組最前方培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后表現(xiàn)為混濁，為陽性，對(duì)照組為陰性，稀釋平板分離實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液后，可得到單位樣品中總數(shù)屬于優(yōu)勢(shì)的VBNC狀態(tài)菌；Rpf閾值為5～1時(shí)，稀釋平板分離兩組最前方混濁培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)菌落形態(tài)特征存在的差異做出判斷，特征性菌落為實(shí)驗(yàn)組特有時(shí)，表明VBNC狀態(tài)細(xì)菌敏感于Rpf。

1.2.4 分離菌株

依照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行VBNC狀態(tài)細(xì)菌DNA的提取，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析分離出來的菌株。

2 結(jié)果

2.1 MPN值與樣品細(xì)菌總數(shù)

生物反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間不同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的MPN值、細(xì)菌總數(shù)見表1。經(jīng)計(jì)算可知，運(yùn)行30 d時(shí)，VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為94.1%；運(yùn)行61 d時(shí)，VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率97.9%；運(yùn)行183 d時(shí)，VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為55.1%；運(yùn)行361 d時(shí)，VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率為48.0%（VBNC狀態(tài)菌復(fù)活率=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)-對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)）/實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)×100%）。見表1。

2.2 Rpf閾值、OD660值

由Rpf閾值可知，處于優(yōu)勢(shì)的、敏感于Rfp的VBNC狀態(tài)菌存在于單位樣品中。由OD660值可知，實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，Rpf具有刺激細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。

2.3 菌株分離結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組經(jīng)培養(yǎng)分離后，在分離中，發(fā)現(xiàn)包含豐富的菌株類型，主要為革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌。

3 討論

在制藥行業(yè)生產(chǎn)過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的制藥廢水，屬于有機(jī)廢水，濃度比較高，降解難度大?，F(xiàn)階段，主要包含6種制藥廢水，分別為化學(xué)合成類、發(fā)酵類、提取類、傳統(tǒng)中藥類、混裝制劑類、生物工程類，其中，占據(jù)比重比較大的為化學(xué)合成類和發(fā)酵類，這兩類的污染程度也比較高[2]?；谥扑帍U水的特殊特點(diǎn)，行業(yè)研究的熱點(diǎn)問題之一即為開發(fā)出高效的微生物處理技術(shù)，以能有效地處理制藥廢水。

該研究中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)加入了含有Rpf的制備液，對(duì)照組加入的制備液中則不含有Rpf，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌總數(shù)多于對(duì)照組，而且OD660值也高于對(duì)照組，這說明，Rpf蛋白能夠刺激部分細(xì)菌菌種的生長(zhǎng)。此外，經(jīng)分離實(shí)驗(yàn)組VBNC狀態(tài)細(xì)菌后，得到的菌株類型包含革蘭式陽性放線菌、革蘭氏陰性菌等，均屬于近緣菌。實(shí)際上，采用普通方法培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，這些細(xì)菌并無法獲取，不過利用Rpf蛋白誘導(dǎo)后，改變了細(xì)菌的VBNC狀態(tài)，變?yōu)榭膳囵B(yǎng)狀態(tài)，從而被分離出來，這表示，Rpf蛋白能夠復(fù)蘇、刺激革蘭氏陽性菌及陰性菌生長(zhǎng)的作用。

綜上所述，制藥廢水在生物反應(yīng)器作用下，經(jīng)Rpf蛋白的誘導(dǎo)，能夠分離出處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，并能刺激其復(fù)活、生長(zhǎng)，有利于深入的認(rèn)識(shí)其中VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成，為微生物處理技術(shù)的開發(fā)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 康得軍，謝丹瑜，唐虹，等.微生物胞外聚合物在水環(huán)境中的應(yīng)用研究[J].工業(yè)水處理，2016，13（9）：11-15.

[2] 高學(xué)宇.Rpf對(duì)印染廢水中VBNC菌復(fù)蘇活化的研究[J].環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2016，21（S1）：110-117.