李秋江++趙云霞++謝雅舒++王星皓++馬亞洪++李嘉文++宋桂芹

摘要：研究不同濃度重鉻酸鉀溶液及不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥（Allium cepa L.）根尖細(xì)胞有絲分裂和植物保護(hù)酶系統(tǒng)的影響，旨在為探究重金屬鉻作用于植物體的生理生化機(jī)理提供參考。分別用0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重鉻酸鉀溶液處理洋蔥根尖6、12、18、24 h，而后收集洋蔥根尖組織，分別用于洋蔥根尖組織石蠟切片、蘇木素染色觀(guān)察和測(cè)定根尖細(xì)胞中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性及丙二醛含量。結(jié)果表明，不同濃度重鉻酸鉀溶液處理洋蔥根尖不同時(shí)間后，細(xì)胞有絲分裂出現(xiàn)異常分裂，并伴有微核的產(chǎn)生；無(wú)論處理時(shí)間長(zhǎng)短，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性都呈現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢(shì)，而丙二醛含量先緩慢下降、后迅速上升；當(dāng)處理濃度一定時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性呈上升趨勢(shì)，而丙二醛含量呈緩慢下降趨勢(shì)。說(shuō)明重鉻酸鉀溶液對(duì)洋蔥具有一定的細(xì)胞毒性作用，可能與調(diào)控細(xì)胞中各種酶系統(tǒng)的活性及含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：洋蔥（Allium cepa L.）；重鉻酸鉀；超氧化物歧化酶（SOD）；過(guò)氧化氫酶（CAT）；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）；丙二醛（MDA）

中圖分類(lèi)號(hào)：S633.2+78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1489-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.022

Effects of Different Concentration of K2Cr2O7 Solution Stress on the Physiology and Biochemistry of the Tip Cell of Allium cepa

LI Qiu-jiang，ZHAO Yun-xia，XIE Ya-shu，WANG Xing-hao，MA Ya-hong，LI Jia-wen，SONG Gui-qin

（The Department of Biology of North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， Sichuan， China）

Abstract： To provide references for exploring the physiological and biochemical mechanisms of chromium ions on plants， the effects of potassium dichromate（K2Cr2O7） with different treatment time on the mitosis and plant protection enzyme system of root tip cells of Allium cepa L. were studied. K2Cr2O7 solutions with different concentration were used separately to treat the root tip of A. cepa for 6， 12， 18， 24 h. The A. cepa root tip tissue were collected for tissue paraffin sections， hematoxylin and testing the activity of SOD， CAT， GST and the content of MDA. After the tip cell being prosessed by K2Cr2O7 solution with different concentration for different time， abnormal mitotic cell division and micronucleus were found in mitotic cells. No matter the length of processing time， with the increase of K2Cr2O7 concentration， the activity of SOD， CAT， GST in cell increased at first and then decreased； but the content of MDA decreased slowly at first and then increased rapidly. When the K2Cr2O7 solution concentration was constant， with the extension of treatment time， the activity of SOD， CAT， GST in cell showed an increasing trend； while the content of MDA decreased slowly. Potassium dichromate solution had certain toxic effects on A. cepa cell， which may be related to regulating the activity and the content of various enzyme systems in cell.

Key words： Allium cepa L.； potassium dichromate solution； SOD； CAT； GST； MDA

隨著人類(lèi)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境污染尤其是農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染成為社會(huì)最關(guān)心的問(wèn)題。造成農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染的重金屬有鎘（Cd）、鉛（Pb）[1]、汞（Hg）、砷（As）、鉻（Cr）、銅（Cu）、錳（Mn）[2，3]及鋅（Zn）等，而鉻是其中最重要的污染源。鉻作為最主要的重金屬污染物，對(duì)動(dòng)植物均有一定的毒害作用，其中對(duì)植物毒害最大的主要是六價(jià)鉻，其絕大部分可被植物根部吸收，造成植物的畸形與突變[4]。植物在正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，耗氧是必不可少的，同時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基、過(guò)氧化物、活性氧等有害物質(zhì)。這些有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜有一定的破壞作用，并且大量長(zhǎng)期存在于植物體內(nèi)會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)代謝，對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用[5]。但是植物本身對(duì)這些有害物質(zhì)有一定的清除能力，因此正常情況下，自由基的產(chǎn)生與消除處在一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[6，7]。然而重金屬可在土壤中長(zhǎng)期存留，不易降解；長(zhǎng)時(shí)間的重金屬蓄積將打破植物的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，加速體內(nèi)自由基的積聚，延緩自由基的清除，長(zhǎng)此以往將造成植物出現(xiàn)一種不可逆的損傷，最終導(dǎo)致植物死亡。超氧化物歧化酶（SOD）[8]、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）[9]屬于植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，可清除自由基，從而對(duì)機(jī)體起著保護(hù)作用。微量丙二醛（MDA）能延緩自由基的清除，起著破壞作用。近年來(lái)重金屬對(duì)植物機(jī)體的毒害作用報(bào)道不少，但是通過(guò)檢測(cè)重金屬脅迫后植物機(jī)體中各種酶系統(tǒng)活性而更直接反映其毒害程度的報(bào)道較少。因此，試驗(yàn)開(kāi)展了這方面的探討，以期深入闡述重金屬對(duì)植物毒害的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 植物材料選擇洋蔥（Allium cepa L.），在2015年夏季購(gòu)于南充市當(dāng)?shù)氐氖袌?chǎng)，參試樣品大小均勻，生長(zhǎng)狀況良好，未使用任何藥物處理。將洋蔥隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組分別用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重鉻酸鉀（K2Cr2O7，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）溶液處理，對(duì)照組全程用去離子水處理。

1.1.2 洋蔥的培養(yǎng) 將買(mǎi)來(lái)的洋蔥取根尖，洗凈后剝?nèi)ダ掀ぃルx子水清洗處理，待根尖長(zhǎng)至2～3 cm后，換用不同濃度的重鉻酸鉀溶液分別處理6、12、18、24 h，然后剪下根尖組織，分別用于石蠟切片制作和酶活性的測(cè)定。

1.1.3 儀器與試劑 儀器主要有正立熒光顯微鏡、石蠟包埋機(jī)與輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司）；還有酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、721分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；試劑主要有乙醇、甲醛、醋酸、蘇木素等，SOD、CAT、GST、MDA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A001-3、A007-1、A004、A003-2。

1.2 方法

1.2.1 洋蔥根尖石蠟切片 分別選取不同濃度、不同時(shí)間處理后的洋蔥根尖組織3根置于FAA固定液（配置比例為38%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）中固定2～3 d，經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、透明等步驟包埋切片。采用蘇木素染色，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞有絲分裂情況。

1.2.2 SOD、CAT、GSH活性及MDA含量測(cè)定 分別選取不同濃度、不同時(shí)間處理后的長(zhǎng)度為2～3 cm洋蔥根尖10根，測(cè)其總重量，碾碎。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，以10根根尖的總酶活性作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)結(jié)果。用分光光度計(jì)檢測(cè)CAT、GSH活性及MDA含量，用酶標(biāo)儀檢測(cè)SOD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010程序處理，并用其制表和繪圖；運(yùn)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重鉻酸鉀溶液及處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂染色體的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液及不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂染色體的影響情況見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，重鉻酸鉀溶液處理后，洋蔥根尖細(xì)胞形態(tài)不一，細(xì)胞核也不規(guī)則；有的細(xì)胞在分裂過(guò)程中出現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)分裂、染色體橋、染色體滯后、不同步分裂等現(xiàn)象，各處理均形成了微核，有微核效應(yīng)，還有的細(xì)胞在分裂過(guò)程中紡錘絲被打斷，也可能出現(xiàn)微核，但是微核率各不相同。而對(duì)照組無(wú)微核現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.2 重鉻酸鉀溶液及處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞SOD活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞SOD活性的影響情況見(jiàn)圖2，不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞SOD活性的影響情況見(jiàn)圖3。從圖2、圖3可見(jiàn)，無(wú)論處理時(shí)間的長(zhǎng)短，洋蔥根尖細(xì)胞中SOD活性隨著重鉻酸鉀溶液濃度的增加都呈現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢(shì)，均在25.0 mg/L處理達(dá)到峰值。且處理6、12、18、24 h后的SOD活性在25.0 mg/L處理明顯上升，而在低濃度脅迫下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，洋蔥根尖細(xì)胞中SOD活性的增加并不明顯；高濃度脅迫下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性增加明顯。

2.3 重鉻酸鉀溶液及處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞CAT活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞CAT活性的影響情況見(jiàn)圖4，不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞CAT活性的影響情況見(jiàn)圖5。從圖4、圖5可見(jiàn)，洋蔥根尖處理12、18、24 h后，細(xì)胞中的CAT活性隨著重鉻酸鉀溶液濃度的增加呈現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢(shì)，上升的趨勢(shì)較下降緩慢，在25.0 mg/L處理后達(dá)到最大值，但是處理6 h后的CAT活性變化不大。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照的變化不明顯，其他處理呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)處理濃度為12.5、25.0 mg/L時(shí)，變化較高濃度處理的明顯。

2.4 重鉻酸鉀溶液及處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞GST活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞GST活性的影響情況見(jiàn)圖6，不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞GST活性的影響情況見(jiàn)圖7。從圖6、圖7可知，在低濃度重鉻酸鉀溶液脅迫下，細(xì)胞中的GST活性緩慢上升，隨著處理濃度的進(jìn)一步增加，細(xì)胞中GST活性出現(xiàn)緩慢下降。當(dāng)處理時(shí)長(zhǎng)為6、18、24 h時(shí)，細(xì)胞中的GST活性均在25.0 g/mL處理達(dá)到峰值，而當(dāng)處理時(shí)長(zhǎng)為12 h時(shí)，細(xì)胞中GST活性在50.0 g/mL處理的活性最強(qiáng)。在處理濃度相同的條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度脅迫下的細(xì)胞中GST活性增加明顯，高濃度脅迫下GST活性變化并未呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

2.5 重鉻酸鉀溶液及處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞MDA含量的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞MDA含量的影響情況見(jiàn)圖8，不同處理時(shí)間對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞MDA含量的影響情況見(jiàn)圖9。從圖8、圖9可見(jiàn)，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞中MDA含量均呈現(xiàn)先緩慢下降、后迅速升高的變化。在25.0 g/mL處理達(dá)到最小值。當(dāng)處理濃度相同時(shí)，除重鉻酸鉀溶液濃度為12.5、25.0 mg/L無(wú)明顯變化規(guī)律外，其他各處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中MDA含量緩慢下降。

3 討論

科技的進(jìn)步給人們生活提供了不少便利，但是也給環(huán)境造成了不同程度的損害，重金屬污染就是其中之一。重金屬在生物體內(nèi)蓄積而不被降解的特性最終導(dǎo)致了生物體的畸變與變異。試驗(yàn)中在不同濃度重鉻酸鉀溶液毒害下，洋蔥根尖細(xì)胞出現(xiàn)了染色體橋、染色體不同步甚至導(dǎo)致了微核的形成等變異現(xiàn)象[10，11]，印證了鉻作為環(huán)境中毒害性較大的重金屬元素對(duì)植物有一定的毒害作用，可以誘導(dǎo)植物的畸變與突變[12，13]；但是不同濃度、不同時(shí)間處理后洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的微核率差別不大，也與油菜根尖細(xì)胞的微核率和染色體畸變率在一定脅迫濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)[14]不符合，可能是由于植物種類(lèi)的不同造成的。產(chǎn)生細(xì)胞染色體畸變的原因有很多[15]，其中主要的原因是直接抑制DNA分子，破壞了DNA分子結(jié)構(gòu)，或者抑制了DNA分子向RNA分子和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變過(guò)程，最終導(dǎo)致染色體的變異；此外，還可以直接作用于染色體的分離過(guò)程，導(dǎo)致染色體的重排、滯后以及染色體橋的形成，滯后的染色體單獨(dú)成型導(dǎo)致單微核、雙微核的形成[16]。因此，可以通過(guò)計(jì)算細(xì)胞微核率來(lái)間接反映重金屬等對(duì)細(xì)胞的毒害程度[17]。試驗(yàn)中，細(xì)胞出現(xiàn)了染色體片段的斷裂以及染色體橋的形成，說(shuō)明鉻元素可能是作用于染色體的DNA分子而發(fā)揮毒害作用的，但是具體的毒害機(jī)理還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

重鉻酸鉀溶液對(duì)洋蔥的脅迫除了通過(guò)作用于蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)變性、從而改變細(xì)胞的膜功能外，還可以通過(guò)破壞洋蔥體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)（SOD、CAT、GST）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝障礙，使自由基積聚，從而造成洋蔥出現(xiàn)不可逆的損傷[18]。鉻元素對(duì)洋蔥的生理生化反應(yīng)呈現(xiàn)二重性，在低濃度作用下有一定的刺激作用。在重金屬輕度脅迫下，植物會(huì)由于應(yīng)激本能而產(chǎn)生保護(hù)作用，通過(guò)加速體內(nèi)的新陳代謝來(lái)緩解重金屬的毒害作用，但同時(shí)體內(nèi)代謝功能的增強(qiáng)也會(huì)加速重金屬進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而加重重金屬的毒害。當(dāng)重金屬脅迫作用進(jìn)一步加大后，植物本能應(yīng)激產(chǎn)生的保護(hù)作用減弱，重金屬的毒害加重，最終導(dǎo)致植物出現(xiàn)不可逆的損傷。試驗(yàn)結(jié)果表明，在低濃度時(shí)，SOD、CAT、GST活性增強(qiáng)，其原因是由于此時(shí)相比重金屬的毒害作用，洋蔥應(yīng)激產(chǎn)生的保護(hù)作用占優(yōu)勢(shì)；而高濃度時(shí)，SOD、CAT、GST活性受到抑制則是洋蔥受到重金屬鉻元素持續(xù)的毒害作用所致。這與以往報(bào)道的研究結(jié)果[19]相符合。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中SOD、CAT、GST活性增強(qiáng)，表明在處理時(shí)間為6～24 h之內(nèi)，洋蔥可以通過(guò)加速體內(nèi)的代謝來(lái)緩解重金屬鉻的毒害作用。

丙二醛（MDA）是細(xì)胞內(nèi)膜脂過(guò)氧化或脫脂過(guò)程的產(chǎn)物，它會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的生物膜，而膜脂過(guò)氧化是在膜脂不飽和脂肪酸中發(fā)生的一系列自由基反應(yīng)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，膜脂過(guò)氧化會(huì)導(dǎo)致大量活性氧自由基的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定性[21]。本試驗(yàn)中，洋蔥根尖細(xì)胞隨著處理鉻濃度的上升，其MDA含量呈現(xiàn)先緩慢下降、后急劇上升的變化趨勢(shì)，其中MDA含量緩慢下降主要是由于有機(jī)酸產(chǎn)生體外解毒效果，使體內(nèi)各種保護(hù)酶活性增強(qiáng)，加速了清除活性氧自由基的過(guò)程，削弱了膜脂過(guò)氧化作用，從而減少了MDA在體內(nèi)的累積；其次是機(jī)體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)（SOD、CAT、GST）受到抑制后，也可表現(xiàn)出MDA含量的降低；而MDA含量上升則是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)化的結(jié)果。這個(gè)結(jié)果與楊文玲等[21]報(bào)道的情況相類(lèi)似。

試驗(yàn)結(jié)果表明，洋蔥根尖受到重金屬鉻脅迫后，細(xì)胞有絲分裂過(guò)程會(huì)有染色體橋、染色體不同步甚至微核等現(xiàn)象的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂、生物畸變的形成；而這種異常分裂機(jī)制與機(jī)體內(nèi)酶系統(tǒng)（SOD、CAT、GST）活性及MDA含量的變化有著密切關(guān)系。但是重金屬鉻脅迫具體是通過(guò)何種途徑對(duì)洋蔥的酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響還不是很清晰，而且影響植物酶系統(tǒng)的機(jī)理相對(duì)較復(fù)雜，還有待于下一步深入研究。

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