秦 杰,趙立晶,董 暉,王 丹,楊一亭,趙 波,賀西京,李浩鵬,王 棟*

(1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科,西安 710004;2 陜西省定邊縣人民醫(yī)院骨傷科;3 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)麻醉科;*通訊作者,E-mail:wado110@163.com)

脊髓損傷是骨科和神經(jīng)外科常見疾病,會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和上下行傳導(dǎo)束中斷,多種炎性因子進(jìn)入損傷區(qū),血腦屏障破壞,局部微環(huán)境失衡,觸發(fā)細(xì)胞壞死及凋亡等級(jí)聯(lián)反應(yīng)。由于受損局部微環(huán)境的異常,導(dǎo)致多種神經(jīng)生長抑制性因子表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞表面,促進(jìn)脊髓內(nèi)神經(jīng)干/祖細(xì)胞(spinal cord neural stem/progenitor cells,spNSPCs)向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,形成膠質(zhì)瘢痕,分泌軸突再生抑制因子,抑制神經(jīng)細(xì)胞和軸突再生[1]。spNSPCs分化涉及復(fù)雜的精確調(diào)控的過程,受到多條途徑的共同作用。Notch信號(hào)通路是一個(gè)在進(jìn)化上十分保守的跨膜蛋白家族,主要介導(dǎo)分化抑制信號(hào),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育上起著重要作用[2],參與控制神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增及決定其最終分化命運(yùn)。研究spNSPCs分化調(diào)控的分子機(jī)制,如何促進(jìn)spNSPCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,減少其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,對(duì)spNSPCs的臨床應(yīng)用及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療具有重要的意義。轉(zhuǎn)錄激活因子5(activating transcription factor 5,ATF5)是轉(zhuǎn)錄激活因子/cAMP反應(yīng)元件(CREB)結(jié)合蛋白家族成員,在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中扮演著多種重要作用[3]。因此,本研究將探討ATF5在Notch信號(hào)通路調(diào)控spNSPCs分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

在獲得西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)8周齡C56BL/6J小鼠購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量18-22 g,動(dòng)物生產(chǎn)許可編號(hào):SCXK(陜)2018-001。胰酶、DMEM/F12、B27、N2、GlutaMAX、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司,表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購于美國Peprotech公司,Accutase細(xì)胞消化分離液、多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、層粘連蛋白(Laminin)、多聚甲醛(PFA),磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、3,5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT)、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液和TBST購于美國Sigma公司。大鼠抗巢蛋白(Nestin)抗體購于美國Chemicon公司,小鼠抗微管蛋白3β(Tuj-1)抗體購于美國BioLegend公司,兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購于美國DAKO公司,兔抗GalC抗體、TRIZol購于美國Invitrogen公司,兔抗轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)單抗、小鼠抗Notch1單抗,熒光二抗Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG,DAPI,WB一抗β-actin、WB二抗HRP偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購于美國Abcam公司。SDS-PAGE和PVDF膜購于美國BioRad Laboratories公司。

1.2 spNSPCs的分離培養(yǎng)

為了研究成年大鼠脊髓干祖細(xì)胞(spNSPCs),參照Hugnot[4]提出的培養(yǎng)方案,建立了spNSPCs原代分離培養(yǎng)體系。6-8周齡C56BL/6小鼠處死后無菌條件下剝離硬脊膜,分離T1至T12脊髓,將脊髓研碎后加入0.25%胰酶中,于37 ℃孵箱中消化30 min,加5%胎牛血清終止消化,漂洗后用火焰拋光的巴斯德吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液,用70 μm濾網(wǎng)過濾并離心沖洗,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù),按105/ml密度植于spNSPCs培養(yǎng)基(DMEM/F12+2%B27+1%N2+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)中,每3.5 d半量換液。每5-7 d進(jìn)行傳代,3-7代用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 spNSPCs的分化實(shí)驗(yàn)

為了對(duì)spNSPCs的神經(jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞分化能力進(jìn)行鑒定并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),將spNSPCs貼壁培養(yǎng)在經(jīng)過包被的細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片上,分別采用神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行定向分化。采用免疫細(xì)胞熒光染色,分別以神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GalC對(duì)其分化潛能進(jìn)行鑒定。spNSPCs傳代后,將其培養(yǎng)于Poly-L-Lysine和Laminin包被過的細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片上,分別采用神經(jīng)元分化培養(yǎng)基(Neurobasal Medium+2% B27+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement),星形膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基(DMEM+1% N-2 Supplement+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement+1% FBS)和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Neurobasal Medium+2%B27+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement+30 ng/ml T3)對(duì)其進(jìn)行定向分化。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

DAPT是γ-分泌酶抑制劑,抑制γ-分泌酶底物Notch的三級(jí)酶切從而減少Notch受體胞內(nèi)段的釋放,進(jìn)而影響Notch信號(hào)通路調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和分化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)將分化培養(yǎng)的spNSPCs分為兩組,實(shí)驗(yàn)組加入10 μmol/L DAPT,對(duì)照組加入相應(yīng)的0.02%(V/V,體積分?jǐn)?shù))DMSO。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫熒光細(xì)胞染色

鑒于轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)在神經(jīng)系統(tǒng)中的廣泛作用,選擇了Notch信號(hào)通路中最早被發(fā)現(xiàn)也是最主要的成員Notch1來觀察Notch信號(hào)與ATF5的表達(dá)情況。載有spNSPCs的細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片經(jīng)4% PFA固定,PBS沖洗,并在室溫下含有0.3% Triton X-100及1% BSA的PBS溶液進(jìn)行1 h的穿孔和封閉后,加入稀釋一抗溶液在4 ℃下孵育過夜(Nestin 1 ∶100;Tuj1 1 ∶200;GFAP 1 ∶500;GalC 1 ∶50;ATF5 1 ∶500)。次晨吸棄一抗溶液,PBS沖洗3次,每次5 min。加入對(duì)應(yīng)的稀釋二抗溶液(1 ∶500)及DAPI(1 ∶1 000)室溫下孵育1 h,PBS沖洗封片,光鏡觀察。圖像采集由奧林巴斯熒光顯微鏡(AxioVert. A1)或奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡(FV 1000)完成。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平

免疫印跡(Western blot)采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程,提取分化10 d的spNSPCs,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,BCA法測定蛋白濃度。20 μg蛋白樣品上樣,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜于室溫下在搖床上用5%脫脂牛奶TBST溶液封閉1 h。分別加入一抗稀釋液(Notch1 1 ∶1 000;ATF5 1 ∶2 000;β-actin 1 ∶4 000)4 ℃孵育過夜。用TBST溶液洗膜3次,每次10 min。加入二抗稀釋液室溫下孵育1 h。洗膜后在增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合液中反應(yīng)并拍片顯影,圖像灰度數(shù)據(jù)分析采用Image J軟件。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測ATF5的mRNA表達(dá)水平

TRIzol法提取不同組別spNSPCs總RNA,定量后按照說明書使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。參照Genbank中ATF5和內(nèi)參β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物:ATF5上游引物為5′-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3′,下游引物為3′-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-5′;β-actin上游引物為5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3′,下游引物為3′-CTCTTTGATGTCACGCACGAT-5′。以cDNA(6 μl)為模板,加入上、下游引物(10 μmol/L,各2.0 μl)和SYBR Green(10 μl)構(gòu)建為PCR反應(yīng)體系,在94 ℃ 50 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 50 s,72 ℃ 10 min反應(yīng)條件下連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt定量分析ATF5的mRNA表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0軟件對(duì)上述測量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,組間對(duì)比采用學(xué)生雙尾t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 spNSPCs分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

懸浮培養(yǎng)條件下,spNSPCs在傳代后3 d開始形成神經(jīng)球,對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的免疫熒光染色結(jié)果顯示陽性(見圖1)。

spNSPCs具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力(見圖2)。

圖1 脊髓來源神經(jīng)干祖細(xì)胞(spNSPCs)懸浮培養(yǎng)形成神經(jīng)球Nestin的表達(dá)情況Figure 1 Nestin expression of neurosphere formed by spinal cord derived neural stem and progenitor cells

圖2 spNSPCs具備向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力Figure 2 Capability of spNSPCs to differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes

2.2 DAPT對(duì)spNSPCs分化能力的調(diào)控作用

通過與對(duì)照組對(duì)比,DAPT組神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1的陽性比例從8.6%上升到23.3%(P<0.05,見圖3A和B),而星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的陽性比例從65.7%下降到42.1%(P<0.05,見圖3C和D)。結(jié)果表明,DAPT能夠促進(jìn)spNSPCs向神經(jīng)元方向分化,抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。

2.3 Notch信號(hào)通路通過ATF5調(diào)控spNSPCs的分化

首先通過免疫細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)ATF5與Notch1胞內(nèi)段共表達(dá)(見圖4A),這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步提示ATF5可能在Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。繼而通過免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測了ATF5在對(duì)照組和DAPT組中的表達(dá)情況(見圖4B和C),發(fā)現(xiàn)使用DAPT后Notch1胞內(nèi)段的表達(dá)較對(duì)照組下降了26%(P<0.05),隨著Notch1活性的下降,ATF5的蛋白水平上升了60%(P<0.05),mRNA水平上升了108%(P<0.05)。

3 討論

如何促進(jìn)脊髓損傷后內(nèi)外源性修復(fù)作用,促進(jìn)脊髓損傷的康復(fù)及功能改善,是骨科尤其是脊柱外科醫(yī)師面臨的重要問題,具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。脊髓神經(jīng)干祖細(xì)胞(spNSPCs)既具有一般神經(jīng)干細(xì)胞的特性,又具有脊髓同源性的特征,使其成為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷最有前途的候選者[5]。我們成功分離培養(yǎng)了spNSPCs,并且通過體外定向分化誘導(dǎo)驗(yàn)證了spNSPCs向神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。但是,如何促進(jìn)脊髓內(nèi)源性及外源性的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化、減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生、促進(jìn)軸突再生,是治療脊髓損傷的熱點(diǎn)問題,為治療脊髓損傷提供了理論依據(jù)和新思路。

Notch家族由高度保守的蛋白質(zhì)組成,在許多物種的細(xì)胞中均有表達(dá),對(duì)細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育、增殖分化以及凋亡過程具有重要的調(diào)控作用。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后,激活金屬蛋白酶家族的腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶在S2位點(diǎn)切去Notch受體大部分的胞外區(qū),再誘導(dǎo)γ-分泌酶在S3位點(diǎn)切割Notch受體,釋放受體胞內(nèi)段,胞內(nèi)段經(jīng)核定位到細(xì)胞核內(nèi),刺激靶基因E家族從而調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生[6]。DAPT就是通過抑制γ-分泌酶來發(fā)揮抑制Notch信號(hào)通路的作用的。長期以來,Notch信號(hào)通路是通過“旁側(cè)抑制”來調(diào)控細(xì)胞分化的。神經(jīng)前體細(xì)胞隨時(shí)間、空間和部位的不同對(duì)Notch信號(hào)的反應(yīng)不同。一般認(rèn)為,下調(diào)Notch信號(hào)通路會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[7],促進(jìn)其分化。Chapouton等[8]在斑馬魚體內(nèi)研究指出,Notch信號(hào)通路的活性控制著靜止期和活動(dòng)期神經(jīng)干細(xì)胞的平衡。Notch信號(hào)激活可以使神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)入G0期,使用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT可以使其重新進(jìn)入G1期并且向神經(jīng)元分化。Borghese等[9]發(fā)現(xiàn),抑制Notch信號(hào)通路,可以延緩人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)干細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化,并且可以加速其向神經(jīng)細(xì)胞分化。本研究中,為了觀察Notch信號(hào)對(duì)spNSPCs分化能力的調(diào)控作用,使用γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch受體的水解酶切,減少Notch受體胞內(nèi)段的釋放,從而達(dá)到抑制Notch信號(hào)通路的作用。首次證實(shí)了對(duì)于體外培養(yǎng)的脊髓來源的神經(jīng)干祖細(xì)胞,使用Notch信號(hào)通路抑制劑后,神經(jīng)元分化增多,星形膠質(zhì)細(xì)胞分化減少。所有這些發(fā)現(xiàn)都指示著,脊髓損傷后Notch信號(hào)通路激活,Notch1在室管膜區(qū)高表達(dá),Notch信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)可能是成年脊髓損傷后再生能力有限的重要原因,抑制Notch信號(hào)通路活性,可以促進(jìn)脊髓損傷后功能重建。以上都表明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中,Notch信號(hào)的作用主要表現(xiàn)為促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、抑制其分化,抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,而促進(jìn)向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

與對(duì)照組比較，* P<0.05圖3 DAPT對(duì)spNSPCs分化能力的調(diào)控作用Figure 3 Regulation effects of DAPT on the differentiation of spNSPCs

與對(duì)照組比較，* P<0.05圖4 spNSPCs中Notch1與ATF5的共表達(dá)情況及相互關(guān)系Figure 4 The coexpression and interaction between Notch1 and ATF5 in spNSPCs

Notch信號(hào)如何調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化一直是神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)能夠通過與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用形成復(fù)合物,從而共同調(diào)控細(xì)胞的生命過程。ATF5在諸如乳腺癌、黑色素瘤、腦腫瘤等多種腫瘤的增殖和凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用[10]。而ATF5在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育中也發(fā)揮著廣泛和重要的作用,例如嗅神經(jīng)元的終末分化和存活[11]等。尤其在神經(jīng)干細(xì)胞分化上,既往研究表明異丙酚抑制的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化是通過下調(diào)ATF5發(fā)揮作用的[12],ATF5下調(diào)是神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的必不可少的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述結(jié)果相佐證,并首次證明了ATF5在Notch信號(hào)通路調(diào)控的spNSPCs分化中發(fā)揮著極為重要的作用,表明,ATF5上調(diào)會(huì)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化,抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。下一步擬構(gòu)建ATF5顯性負(fù)性失活的spNSPCs來深入分析ATF5是如何在Notch調(diào)控spNSPCs分化中發(fā)揮作用的。

綜上所述,DAPT可以有效抑制spNSPCs中Notch信號(hào)活性,DAPT抑制Notch活性可以促進(jìn)spNSPCs向神經(jīng)元分化并抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,ATF5在這種分化作用中發(fā)揮著重要作用。