龍立平，周麗萍，孟 維，王姣亮，謝 丹(湖南城市學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽 413000)

葉酸熒光分光光度法測定Hg(Ⅱ)的研究

龍立平，周麗萍，孟 維，王姣亮，謝 丹
(湖南城市學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽 413000)

基于Hg(Ⅱ)對葉酸的內(nèi)源性熒光的熒光熄滅作用，建立了測定微量Hg(Ⅱ)的熒光分析方法﹒選用pH為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液，最大激發(fā)與發(fā)射波長分別為277.0 nm 和443.0 nm，葉酸濃度選用5.00×10-6mol/L，相對熒光強(qiáng)度與Hg(Ⅱ)濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，測定Hg(Ⅱ)濃度的線性范圍為(4.20×10-6-6.20×10-3)mol/L，檢出限為1.30×10-7mol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%(n=11)，加標(biāo)回收率為95.6%-99.7%﹒該法具有良好的選擇性，可直接用于測定環(huán)境水樣中的Hg(Ⅱ)含量﹒

熒光光度法；熒光熄滅；葉酸；Hg(Ⅱ)

汞是一種有毒金屬，測定汞的方法有原子熒光分光光度法[1]、微波消解-原子吸收分光光度法[2]、ICP發(fā)射光譜法[3]、氫化物-原子熒光法[4]、冷原子吸收法[5]、分光光度法[6]等﹒分光光度法靈敏度低、線性范圍窄；原子吸收法操作繁瑣、分析費(fèi)用高；而熒光光度法測定汞具有靈敏度高、選擇性好和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[7]﹒常用測Hg(Ⅱ)的熒光試劑有西夫堿化合物[8]和對羥基苯甲醛縮鄰氨基苯甲酸[9]等﹒但這些試劑有的制備困難，有的價格昂貴，有的涉及環(huán)境污染物．

葉酸作為一種水溶性B族維生素[10]，在細(xì)胞分裂、生長過程中不可缺少．目前，文獻(xiàn)報道的大多是運(yùn)用各種方法來測定葉酸的含量．葉酸分子本身具有內(nèi)源性熒光，還未見利用其熒光特性直接來進(jìn)行分子或離子的測定．本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在水溶液中，Hg(Ⅱ)能與葉酸發(fā)生反應(yīng)，形成不發(fā)熒光的配合物，而使葉酸熒光熄滅．選取最大激發(fā)/發(fā)射波長λex/λem=277.0 nm/443.0 nm 處，建立了Hg(Ⅱ)-葉酸體系測定微量Hg(Ⅱ)的熒光分析方法，直接用于實(shí)際樣品中Hg(Ⅱ)的測定，結(jié)果滿意．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

日立F-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；pHS-3C型精密pH計(jì)(上海第三分析儀器廠)．

5.00×10-4mol/L葉酸(AR，成都市科龍化工試劑廠)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取葉酸0.0552 g于小燒杯中，加水溶解后過濾，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，用水定容，搖勻．用時稀釋至所需濃度．

0.10 mol/L 的Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取Hg(NO3)2(AR)8.115 8 g 于小燒杯中，加少量水溶解后轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，用水定容，搖勻．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取1.00 mL 5.00×10-5mol/L的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10.00 mL比色管，然后加不同濃度Hg(Ⅱ)，加入5.00 mL pH為6.0的NaAc-HAc緩沖溶液，用水定容至刻度；選擇激發(fā)/發(fā)射夾縫寬為5.0 nm/5.0 nm，光電倍增電壓PTM為700 V，用1 cm的石英比色皿盛入待測液，于最大激發(fā)/發(fā)射波長λex/λem==277.0 nm/443.0 nm 處測其熒光強(qiáng)度．所有實(shí)驗(yàn)均在(20±1) ℃下進(jìn)行，其余無機(jī)或有機(jī)試劑均為分析純，并未再經(jīng)提純和無熒光．實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

由于葉酸有較大的共軛結(jié)構(gòu)(供體)，Hg(Ⅱ)是強(qiáng)的電子受體，當(dāng)供體-受體分子相互碰撞時形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物[11]．在宏觀上將表現(xiàn)為熒光熄滅作用．選擇最大激發(fā)/發(fā)射波長為 277.0 nm/443.0 nm，加入1.00 mL 5.00×10-5mol/L的葉酸，5.00 mL pH為6.0的NaAc-HAc緩沖溶液與不同濃度的Hg(Ⅱ)形成絡(luò)合物后的熒光發(fā)射光譜如圖1 所示．由圖1 可知：在發(fā)射波長為443.0 nm處，Hg(Ⅱ)濃度的不斷加大，對葉酸熒光強(qiáng)度的熄滅程度也在增加，這樣從理論上測定Hg(Ⅱ)含量提供了可行性．

圖1 葉酸與不同濃度的Hg(Ⅱ)反應(yīng)達(dá)平衡時熒光光譜圖

2.2 葉酸用量的選擇

葉酸的用量影響測定 Hg(Ⅱ)的靈敏度大小及線性范圍．取5.00×10-5mol/L濃度不同體積的葉酸液及pH為6.0的NaAc-HAc緩沖溶液5.00 mL，加水配成10.00 mL試劑，用作空白樣品，測定其熒光強(qiáng)度F0；同樣，5.00×10-5mol/L濃度不同體積的葉酸液再加1.00×10-4mol/L 的Hg(Ⅱ)溶液及pH 為6.0的NaAc-HAc緩沖溶液5.00 mL，加水配成10.00 mL試劑，測定其熒光強(qiáng)度F，得到相對熒光強(qiáng)度F0/F與葉酸濃度c的影響．結(jié)果如圖2所示．

圖2 葉酸的用量對測定Hg(Ⅱ)的熒光強(qiáng)度的影響

由圖2可知，葉酸用量太小，反應(yīng)可能完全，熒光響應(yīng)值小，隨著葉酸的加入量過大，相對熒光強(qiáng)度增加；至1.30 mL以后，可能由于內(nèi)濾效應(yīng)使熒光自猝滅，相對熒光強(qiáng)度又會減?。?dāng)5.00×10-5mol/L葉酸的用量為0.70～1.30 mL 時，相對熒光強(qiáng)度穩(wěn)定且最大．因此，實(shí)驗(yàn)時選用葉酸最宜用量為1.00 mL的5.00×10-5mol/L．

2.3 pH的選擇

考察了pH對葉酸測定Hg(Ⅱ)的影響作用．按1.2實(shí)驗(yàn)方法，取1.00 mL的5.00×10-5mol/L葉酸的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，并用1.0 mol/L的HCl溶液在1.0～7.0范圍內(nèi)調(diào)節(jié)溶液的pH，分別測定在葉酸不加和加Hg(Ⅱ)時的熒光強(qiáng)度F0和F，得到相對熒光強(qiáng)度F0/F，觀察其F0/F與溶液pH的影響時發(fā)現(xiàn)在pH 6.0時為最大．后改用pH 6.0的NaAc-HAc緩沖溶液作為測試底液實(shí)驗(yàn)，所加的緩沖溶體積為5.0 mL時為最大，故實(shí)驗(yàn)選用5.00 mL pH 6.0的NaAc-HAc緩沖溶液作為測試底液．

2.4 測定Hg(Ⅱ)的原理

設(shè)Hg(Ⅱ)為A(aq)與葉酸為B(aq)作用形成組成比為m﹕n的絡(luò)合物AmBn(aq)，則Hg(Ⅱ)與葉酸之間具有平衡K為平衡常數(shù)即絡(luò)合物的形成常數(shù)，按文獻(xiàn)[12]方法處理得

其中α是相對熒光響應(yīng)值，可表示為

式中α=0 表示葉酸無絡(luò)合，熒光強(qiáng)度F=F0;α= 1全部絡(luò)合物，此時熒光強(qiáng)度F=F1= 0．

由式(1)、式(2)可知, 待測Hg(Ⅱ)濃度與α有確定函數(shù)關(guān)系，是本法測定Hg(Ⅱ)的定量依據(jù)．作F0/F—logc圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按公式(1)擬合進(jìn)行繪圖，其結(jié)果見圖3．由圖3可知：當(dāng)m﹕n為1﹕2時(曲線c)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)與理論擬合有很好的重合，所得平衡常數(shù)K=1.8×105，此曲線c可作為測定Hg(Ⅱ)含量的校準(zhǔn)曲線．

圖3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)按式(2)進(jìn)行擬合圖

根據(jù)文獻(xiàn)[13]處理方法，由0.05≤(1－α)≤0.95，來確定其動力學(xué)測定范圍；同時根據(jù)3S0/K(S0為空白測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為校準(zhǔn)曲線的斜率)來確定檢出限．對測定Hg(Ⅱ)的動力學(xué)范圍為(4.20× 10-6-6.20×10-3) mol/L；對1.00×10-4mol/L的Hg(Ⅱ)平行測定11次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%，計(jì)算出檢出限為1.30×10-7mol/L．

2. 5 選擇性實(shí)驗(yàn)

為考察一些常見干擾物質(zhì)對葉酸測定Hg(Ⅱ)的影響，按熒光強(qiáng)度的相對誤差≤±5%來進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，選5.0×10-6mol/L和3.00×10-5mol/L Hg(Ⅱ)溶液作底液，分別加入其它離子進(jìn)行測定．可允許的共存物質(zhì)倍率為：30倍的Mg(II)、Al(Ⅲ)；3倍的Pb (II)、Li (Ⅰ)、Ca(II)、Zn(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)；0.3倍的Cu(II)、Cr(Ⅺ)、Fe(Ⅲ)；檢測時需要用硫脲掩蔽Cu(Ⅱ)，用連二亞硫酸鈉掩蔽Cr(Ⅺ)，用鄰二氮菲掩蔽Fe(Ⅲ)等離子．

2.6 樣品及回收率的測定

取蒸餾水 1.00 mL，加入 1.00 mL的5.00×10-5mol/L葉酸測定熒光強(qiáng)度F0；分別于上述水樣中再加入1.00 mL的1.00×10-4mol/L 的Hg(Ⅱ)，測定熒光強(qiáng)度F．按標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，得該試樣中Hg(Ⅱ)的濃度，其結(jié)果見表1，回收率為95.6%-99.7%．

表1 樣品及回收率的測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

[1]房宏偉, 時嵐. 冷蒸汽－原子熒光光譜法測定水樣中3種形態(tài)的汞[J]．理化檢驗(yàn)－化學(xué)分冊, 2015, 51(5): 721-722．

[2]張泓, 呂維君, 茅建人, 等．微波消解--原子吸收分光光度法、原子熒光分光光度法測定土壤中的銅鋅鉛鎘鉻砷汞[J]．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15(7): 830-831．

[3]陳賀, 周慧蘭．液液萃取-HPLC-ICPMS 聯(lián)用技術(shù)測定水體中甲基汞[J]．中國環(huán)境監(jiān)測, 2015, 31(1): 109-112．

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[7]劉欣, 黃漢國. 葉酸氧化物體系熒光測定銪[J]．河北化工, 2004, 6(3): 62-64．

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[9]李惠成, 仵博萬, 張克鈞, 等．對羥基苯甲醛縮鄰氨基苯甲酸與汞的熒光猝滅反應(yīng)及其應(yīng)用[J]．分析測試學(xué)報, 2010, 29(4): 415-417．

[10]劉慧娟, 李鵬, 張亞東, 等．葉酸與人血清白蛋白結(jié)合作用的光譜研究[J]．光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 29(7): 1915-1919．

[11]王柯敏．光化學(xué)傳感器理論與方法[M]．長沙: 湖南教育出版社, 1995: 52．

[12]Yang R H, Wang K M, Long L P,et al．A selective optode membrane for histidine based on fluorescence en-hancement of meso?meso-linked porphyrin dimer[J]．Ana.l Chem., 2002, 74(5): 1088-1096．

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(責(zé)任編校：陳健瓊)

Determination of Mercury (Ⅱ ) Based on Fluorescence Quench of Folic Acid

LONG Li-ping, ZHOU Li-ping, MENG Wei, WANG Jiao-liang, XIE Dan
(College of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang, Hunan 413000, China)

A simple and sensitive fluorescence quenching method for the determination of mercury (Ⅱ) was reported. It was based on fluorescence quenching effect of mercury (Ⅱ) on folic acid. When the concentration of folic acid is 5.00×10-6mol/L in HAc-NaAc buffer solution of pH 6.0, the maximum excitation and emission wavelengths of folic acid are 277.0 nm and 443.0 nm respectively. There is a good linear relationship between the relative fluorescence intensity and the concentration of mercury (Ⅱ) ranged from (4.20×10-6to 6.20×10-3) mol/L, with detection limit of 1.30×10-7mol/L. The relative standard deviation (n=11) is 1.38%. The average recovery is 95.6%-99.7%. The method has a good selectivity, which can be applied to the direct determination of mercury (Ⅱ) in environment water.

Spectrophotofluorimetry；fluorescence quenching；folic acid；mercury(Ⅱ)

O621.15

A

10.3969/j.issn.1672-7304.2017.01.15

1672–7304(2017)01–0073–03

2016-08-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21545003，21502048)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JJ2023，13JJ3117)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(湘教通[2014]207號)；湖南省黑茶金花重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(湘科規(guī)財(cái)[2016]8號)

龍立平(1964-)，男，湖南益陽人，教授，主要從事光化學(xué)傳感器的研制與應(yīng)用研究．E-mail: llping401@163.com