劉婷婷，邢青斌，程家麗，沈 葹，卓 勤

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量的分析及比較

劉婷婷，邢青斌，程家麗，沈 葹，卓 勤

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

目的：對小麥中氨基酸分析的水解方法進(jìn)行研究，比較非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸的含量。方法：樣品用含0.1%巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取，樣液經(jīng)定容、過濾、濃縮、復(fù)溶、過膜后，用氨基酸分析儀測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果：應(yīng)用含巰基乙酸的鹽酸水解液對小麥樣品進(jìn)行水解的同時有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，相對氧化水解方法節(jié)省前處理時間，方法的回收率為93%～99%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.4%。非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品的17種氨基酸分析，氨基酸含量不存在顯著性差異。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確快速、重現(xiàn)性好，適用于小麥中氨基酸含量分析的檢測要求。

氨基酸；轉(zhuǎn)基因小麥；非轉(zhuǎn)基因小麥；氨基酸分析儀

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾霓r(nóng)作物之一，是世界上栽培面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物，也是人類最重要的植物蛋白質(zhì)來源，而組成蛋白質(zhì)的氨基酸在小麥的營養(yǎng)品質(zhì)方面起著決定作用。自1992年人類獲得第一株轉(zhuǎn)基因小麥以來，抗蟲、抗病等轉(zhuǎn)基因小麥的研究取得一定進(jìn)展[1-2]。

由于多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性，需通過衍生化后進(jìn)行檢測。國內(nèi)外許多學(xué)者對其進(jìn)行研究，開發(fā)出柱前衍生的高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法等[3-5]。經(jīng)典的氨基酸分析方法是應(yīng)用氨基酸分析儀，采用柱后用茚三酮衍生的陽離子交換色譜法，該方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好。

本實驗使用氨基酸分析儀，對其前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，建立了更加準(zhǔn)確快速的小麥中氨基酸含量分析的檢測方法。通過對不同實驗基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品的測定，分析其所含的氨基酸成分和含量，為進(jìn)一步科學(xué)認(rèn)識轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中的氨基酸提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥試驗樣品：原料樣品用四分法縮減，粉碎備用。樣品編號1～4，其中1、2為非轉(zhuǎn)基因小麥(濟(jì)麥22)，3、4為轉(zhuǎn)基因小麥(16聯(lián)鑒10)，1、3來自山東實驗基地，2、4來自山西實驗基地。濟(jì)麥22是16聯(lián)鑒10的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N，轉(zhuǎn)基因小麥(16聯(lián)鑒10)進(jìn)行了抗逆相關(guān)的DREB(脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)類轉(zhuǎn)錄因子基因GmDREB3的轉(zhuǎn)錄，該基因具有持久耐鹽性。

17種氨基酸標(biāo)樣：美國Sigma公司；鹽酸(優(yōu)級純)：北京試劑公司；巰基乙酸：美國Sigma公司；氨基酸分析儀配套的流動相(茚三酮溶液和緩沖液)：日本和光公司。

1.2 儀器和設(shè)備

L-8900型氨基酸分析儀：日本日立公司；電熱恒溫干燥箱：上海森信；濃縮儀：TAITEC公司；自動凱氏定氮儀：FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定 稱取約0.20 g樣品，加入4.5 mL濃硫酸和催化劑片(K2SO41.5g；Se0.0075g)，過夜，同時做樣品空白管。次日，置凱氏消化器消化6h，待消化完全后用自動定氮分析儀測定氮含量[6]。

1.3.2 氨基酸樣品預(yù)處理 稱取樣品約0.15g于水解管中，在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸(含0.5%巰基乙酸)15mL，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空，然后充入高純氮氣；在充氮氣狀態(tài)下封口，將已封口的水解管放在110±1℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。

打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶內(nèi)，用去離子水定容，多次沖洗水解管。將水解液過濾后，吸取濾液1mL于10mL管中，用真空濃縮器在50℃左右抽干，殘留物用1～2mL水溶解，最后蒸干，用2.0mL 0.02moL/L稀鹽酸溶解，過濾后供儀器測定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：水解氨基酸專用色譜柱；檢測波長：570nm，其中脯氨酸檢測波長為440nm；分析柱溫度：57℃；反應(yīng)柱溫度：135℃；進(jìn)樣體積：20μL；洗脫溶液流速：0.4mL/min；柱后衍生試劑流速：0.35mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

通過凱氏定氮法測得的小麥樣品蛋白質(zhì)含量見表1。

表1 樣品中蛋白質(zhì)含量(n=6)

2.2 方法的精密度

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用0.02moL/mL稀鹽酸稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10μmoL/mL)。從圖1～2中可以看出，峰窄而尖，基線平穩(wěn)，分離效果好。在實際樣品中，目標(biāo)峰也與樣品中的其他雜質(zhì)峰分離良好。取同一批樣品6份，按上述前處理過程做精密度試驗，結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.4%，表明此檢測方法有較好的重復(fù)性。

2.3 水解方法對氨基酸檢測結(jié)果的影響

在酸水解過程中，植物性蛋白質(zhì)樣品中的含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)會部分氧化，導(dǎo)致檢測值比實際含量值偏低，因此含硫氨基酸回收率的提高是保證水解氨基酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的處理方法是首先利用氧化水解法，將含硫氨基酸用過甲酸試劑氧化成對酸穩(wěn)定性物質(zhì)，再進(jìn)行水解處理，此氧化方法需冰浴反應(yīng)16～18h，前處理分析時間較長，不適宜高通量樣品的處理[7]。本實驗采用含0.1%巰基乙酸的鹽酸水解液，由于巰基乙酸既具有羥酸的反應(yīng)特征，又具有巰基的反應(yīng)特征，直接對植物性蛋白樣品進(jìn)行水解的同時，可有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，減少了氨基酸前處理過程中的氧化損失。

用3種不同的的前處理水解方法對1號小麥樣品進(jìn)行添加回收實驗的結(jié)果見表2?？梢钥闯黾尤霂€基乙酸的鹽酸水解法與氧化水解法對樣品中含硫氨基酸的水解效果均較好，所得到的含硫氨基酸加標(biāo)回收率高于常規(guī)鹽酸水解的處理方法。加入巰基乙酸的鹽酸水解液分析步驟相對簡單，節(jié)省前處理時間，重現(xiàn)性好，回收率高。

圖1 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 小麥樣品中17種氨基酸測定色譜圖

組別含硫氨基酸添加值(g/100g)測定均值(g/100g)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)回收率(%)含0.1%巰基乙酸的6moL/mL鹽酸水解組半胱氨酸00.2652.230.500.7292.0192.91.001.2121.3294.7蛋氨酸00.2082.120.500.6911.8990.61.001.1981.1599.06moL/mL鹽酸水解組半胱氨酸00.2022.360.500.6552.1590.61.001.1871.5192.2蛋氨酸00.1472.020.500.5511.8680.81.000.9681.3282.1甲酸試劑氧化后鹽酸水解組半胱氨酸00.2562.330.500.7292.0992.81.001.2251.5895.9蛋氨酸00.2122.390.500.6842.1195.21.001.1871.3697.9

2.4 樣品檢測結(jié)果

通過氨基酸分析儀對來自山東和山西轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實驗基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品中的17種氨基酸進(jìn)行分析(表3)。對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗異方差假設(shè)分析，得到雙尾P值，P>0.05時表示差異不顯著。從表3中的P值可以看出轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中的17種氨基酸P值均大于0.05，所以轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量不存在顯著性差異。小麥的氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，回收率>99%。間接證明了本方法檢測小麥中氨基酸含量的的準(zhǔn)確性。

表3 樣品中氨基酸含量比較(n=6)

3 結(jié)論與討論

本實驗通過對小麥中氨基酸分析的水解方法進(jìn)行研究，在鹽酸水解液中加入巰基乙酸，防止了含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)在傳統(tǒng)酸水解方法中的氧化損失，分析步驟相對簡單，相對氧化水解方法節(jié)省前處理時間，重現(xiàn)性好，回收率高。小麥中氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，證明了本方法檢測小麥中氨基酸含量的準(zhǔn)確性。

本文通過氨基酸分析儀對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實驗基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品中的17種氨基酸進(jìn)行分析，對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量不存在顯著性差異?！?/p>

[1]周巖，薛曉峰，魏琦超，等.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，2012(5)：53-59.

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Determination and Comparison of Amino Acids in Non-transgenic Wheat and Transgenic Wheat

LIU Ting-ting，XING Qing-bin，CHENG Jia-li，SHEN Shi，ZHUO Qin

(Institute of Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

amino acid；transgenic wheat；non-transgenic wheat;amino acid analyzer

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國家科技重大專項課題“轉(zhuǎn)基因生物的食用和飼用安全評價技術(shù)”(項目編號：2014ZX08011-005、2016ZX08011-005)。

劉婷婷(1985— )，女，碩士，助理研究員，研究方向：食物成分分析。

卓勤(1969— )女，博士，研究員，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。