劉婷婷，邢青斌，程家麗，沈 葹，卓 勤

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量的分析及比較

劉婷婷，邢青斌，程家麗，沈 葹，卓 勤

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

目的：對(duì)小麥中氨基酸分析的水解方法進(jìn)行研究，比較非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸的含量。方法：樣品用含0.1%巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取，樣液經(jīng)定容、過濾、濃縮、復(fù)溶、過膜后，用氨基酸分析儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果：應(yīng)用含巰基乙酸的鹽酸水解液對(duì)小麥樣品進(jìn)行水解的同時(shí)有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，相對(duì)氧化水解方法節(jié)省前處理時(shí)間，方法的回收率為93%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.4%。非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品的17種氨基酸分析，氨基酸含量不存在顯著性差異。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確快速、重現(xiàn)性好，適用于小麥中氨基酸含量分析的檢測(cè)要求。

氨基酸；轉(zhuǎn)基因小麥；非轉(zhuǎn)基因小麥；氨基酸分析儀

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾霓r(nóng)作物之一，是世界上栽培面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物，也是人類最重要的植物蛋白質(zhì)來(lái)源，而組成蛋白質(zhì)的氨基酸在小麥的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面起著決定作用。自1992年人類獲得第一株轉(zhuǎn)基因小麥以來(lái)，抗蟲、抗病等轉(zhuǎn)基因小麥的研究取得一定進(jìn)展[1-2]。

由于多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸收和熒光發(fā)射特性，需通過衍生化后進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，開發(fā)出柱前衍生的高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法等[3-5]。經(jīng)典的氨基酸分析方法是應(yīng)用氨基酸分析儀，采用柱后用茚三酮衍生的陽(yáng)離子交換色譜法，該方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好。

本實(shí)驗(yàn)使用氨基酸分析儀，對(duì)其前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，建立了更加準(zhǔn)確快速的小麥中氨基酸含量分析的檢測(cè)方法。通過對(duì)不同實(shí)驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品的測(cè)定，分析其所含的氨基酸成分和含量，為進(jìn)一步科學(xué)認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中的氨基酸提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥試驗(yàn)樣品：原料樣品用四分法縮減，粉碎備用。樣品編號(hào)1～4，其中1、2為非轉(zhuǎn)基因小麥(濟(jì)麥22)，3、4為轉(zhuǎn)基因小麥(16聯(lián)鑒10)，1、3來(lái)自山東實(shí)驗(yàn)基地，2、4來(lái)自山西實(shí)驗(yàn)基地。濟(jì)麥22是16聯(lián)鑒10的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N，轉(zhuǎn)基因小麥(16聯(lián)鑒10)進(jìn)行了抗逆相關(guān)的DREB(脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)類轉(zhuǎn)錄因子基因GmDREB3的轉(zhuǎn)錄，該基因具有持久耐鹽性。

17種氨基酸標(biāo)樣：美國(guó)Sigma公司；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)：北京試劑公司；巰基乙酸：美國(guó)Sigma公司；氨基酸分析儀配套的流動(dòng)相(茚三酮溶液和緩沖液)：日本和光公司。

1.2 儀器和設(shè)備

L-8900型氨基酸分析儀：日本日立公司；電熱恒溫干燥箱：上海森信；濃縮儀：TAITEC公司；自動(dòng)凱氏定氮儀：FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 稱取約0.20 g樣品，加入4.5 mL濃硫酸和催化劑片(K2SO41.5g；Se0.0075g)，過夜，同時(shí)做樣品空白管。次日，置凱氏消化器消化6h，待消化完全后用自動(dòng)定氮分析儀測(cè)定氮含量[6]。

1.3.2 氨基酸樣品預(yù)處理 稱取樣品約0.15g于水解管中，在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸(含0.5%巰基乙酸)15mL，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空，然后充入高純氮?dú)?；在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，將已封口的水解管放在110±1℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。

打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容，多次沖洗水解管。將水解液過濾后，吸取濾液1mL于10mL管中，用真空濃縮器在50℃左右抽干，殘留物用1～2mL水溶解，最后蒸干，用2.0mL 0.02moL/L稀鹽酸溶解，過濾后供儀器測(cè)定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：水解氨基酸專用色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：570nm，其中脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm；分析柱溫度：57℃；反應(yīng)柱溫度：135℃；進(jìn)樣體積：20μL；洗脫溶液流速：0.4mL/min；柱后衍生試劑流速：0.35mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

通過凱氏定氮法測(cè)得的小麥樣品蛋白質(zhì)含量見表1。

表1 樣品中蛋白質(zhì)含量(n=6)

2.2 方法的精密度

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用0.02moL/mL稀鹽酸稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10μmoL/mL)。從圖1～2中可以看出，峰窄而尖，基線平穩(wěn)，分離效果好。在實(shí)際樣品中，目標(biāo)峰也與樣品中的其他雜質(zhì)峰分離良好。取同一批樣品6份，按上述前處理過程做精密度試驗(yàn)，結(jié)果顯示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.4%，表明此檢測(cè)方法有較好的重復(fù)性。

2.3 水解方法對(duì)氨基酸檢測(cè)結(jié)果的影響

在酸水解過程中，植物性蛋白質(zhì)樣品中的含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)會(huì)部分氧化，導(dǎo)致檢測(cè)值比實(shí)際含量值偏低，因此含硫氨基酸回收率的提高是保證水解氨基酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的處理方法是首先利用氧化水解法，將含硫氨基酸用過甲酸試劑氧化成對(duì)酸穩(wěn)定性物質(zhì)，再進(jìn)行水解處理，此氧化方法需冰浴反應(yīng)16～18h，前處理分析時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜高通量樣品的處理[7]。本實(shí)驗(yàn)采用含0.1%巰基乙酸的鹽酸水解液，由于巰基乙酸既具有羥酸的反應(yīng)特征，又具有巰基的反應(yīng)特征，直接對(duì)植物性蛋白樣品進(jìn)行水解的同時(shí)，可有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，減少了氨基酸前處理過程中的氧化損失。

用3種不同的的前處理水解方法對(duì)1號(hào)小麥樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表2?？梢钥闯黾尤霂€基乙酸的鹽酸水解法與氧化水解法對(duì)樣品中含硫氨基酸的水解效果均較好，所得到的含硫氨基酸加標(biāo)回收率高于常規(guī)鹽酸水解的處理方法。加入巰基乙酸的鹽酸水解液分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，節(jié)省前處理時(shí)間，重現(xiàn)性好，回收率高。

圖1 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 小麥樣品中17種氨基酸測(cè)定色譜圖

組別含硫氨基酸添加值(g/100g)測(cè)定均值(g/100g)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)回收率(%)含0.1%巰基乙酸的6moL/mL鹽酸水解組半胱氨酸00.2652.230.500.7292.0192.91.001.2121.3294.7蛋氨酸00.2082.120.500.6911.8990.61.001.1981.1599.06moL/mL鹽酸水解組半胱氨酸00.2022.360.500.6552.1590.61.001.1871.5192.2蛋氨酸00.1472.020.500.5511.8680.81.000.9681.3282.1甲酸試劑氧化后鹽酸水解組半胱氨酸00.2562.330.500.7292.0992.81.001.2251.5895.9蛋氨酸00.2122.390.500.6842.1195.21.001.1871.3697.9

2.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

通過氨基酸分析儀對(duì)來(lái)自山東和山西轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實(shí)驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品中的17種氨基酸進(jìn)行分析(表3)。對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)異方差假設(shè)分析，得到雙尾P值，P>0.05時(shí)表示差異不顯著。從表3中的P值可以看出轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中的17種氨基酸P值均大于0.05，所以轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量不存在顯著性差異。小麥的氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，回收率>99%。間接證明了本方法檢測(cè)小麥中氨基酸含量的的準(zhǔn)確性。

表3 樣品中氨基酸含量比較(n=6)

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小麥中氨基酸分析的水解方法進(jìn)行研究，在鹽酸水解液中加入巰基乙酸，防止了含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)在傳統(tǒng)酸水解方法中的氧化損失，分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，相對(duì)氧化水解方法節(jié)省前處理時(shí)間，重現(xiàn)性好，回收率高。小麥中氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，證明了本方法檢測(cè)小麥中氨基酸含量的準(zhǔn)確性。

本文通過氨基酸分析儀對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實(shí)驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因小麥樣品中的17種氨基酸進(jìn)行分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中氨基酸含量不存在顯著性差異?！?/p>

[1]周巖，薛曉峰，魏琦超，等.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012(5)：53-59.

[2]喻修道，徐兆師，陳明.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(8)：1539-1553.

[3]高燕紅，朝陽(yáng)，魯琳.應(yīng)用柱前衍生法和柱后衍生法測(cè)定氨基酸方法的比較[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2004，5(2)：133-135.

[4]Langrock T，Czihal P，Horrmann R.Amino acid analysis by hydrophilic interaction chromatography coupled on-line to electrospray ionization mass spectrometry[J]. Amino Acids，2006，30(2)：291-297.

[5]于泓，丁永勝，牟世芬.陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法分離測(cè)定氨基酸注射液中的氨基酸和葡糖糖[J]. 色譜，2002，20(5)：398-401.

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部 GB 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[7]李玉玲，李衛(wèi)華，楊秀清.反相高效液相色譜法檢測(cè)奶粉中含硫氨基酸[J]. 食品科學(xué)，2012，33(8)：167-170.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Determination and Comparison of Amino Acids in Non-transgenic Wheat and Transgenic Wheat

LIU Ting-ting，XING Qing-bin，CHENG Jia-li，SHEN Shi，ZHUO Qin

(Institute of Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

amino acid；transgenic wheat；non-transgenic wheat;amino acid analyzer

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題“轉(zhuǎn)基因生物的食用和飼用安全評(píng)價(jià)技術(shù)”(項(xiàng)目編號(hào)：2014ZX08011-005、2016ZX08011-005)。

劉婷婷(1985— )，女，碩士，助理研究員，研究方向：食物成分分析。

卓勤(1969— )女，博士，研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。